專(zhuān)利名稱(chēng)：治療過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2惡性腫瘤的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2腫瘤的共表達(dá)人源性單抗和Mda-7的重組腺病毒構(gòu)建，其所在的技術(shù)領(lǐng)域與生命科學(xué)和生物醫(yī)藥技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
·研究表明原癌基因neu/erbB2是多種惡性腫瘤的一個(gè)重要標(biāo)記基因，其產(chǎn)物又稱(chēng)為惡蛋白，約30％的乳腺癌患者和其它腫瘤部份患者，如卵巢癌、肺癌和胃癌，該基因neu/erbB2都處于高表達(dá)狀態(tài)，是這些腫瘤惡化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因之一。國(guó)外巳成功開(kāi)發(fā)針對(duì)此原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體。經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市和多年臨床應(yīng)用，表明此治療性人源化單抗對(duì)高表達(dá)原癌基因neu/erbB2的惡性乳腺癌具有很好的治療效果，取得滿(mǎn)意臨床效果(Carter P，et alPNAS，1992，4285-4289；Stebbing.J.，et alCancer Treat.Reviews 2000；26287-290)。但是，盡管抗原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體已成功用于過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2惡性乳腺癌冶療，但臨床研究表明大多數(shù)初期用此抗體有效的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在一年內(nèi)將對(duì)此抗體治療產(chǎn)生抗性、15％的患者仍將復(fù)發(fā)。因此，在冶療neu/erbB2陽(yáng)性的乳腺癌時(shí)，綜合使用其他藥物或治療途徑以增強(qiáng)此抗體的療效，并克服其產(chǎn)生的抗性，是目前正在探索的一種冶療方法(Tseng PH，et alMol Pharmacol.2006 Nov；70(5)1534-41；Nahta R，et alBreast Cancer Res.2006；8(6)215)。
另一方面，研究也表明應(yīng)用neu/erbB2的人源化單克隆抗體的單鏈可變區(qū)，既可保留抗體的特異性抗原結(jié)合能力，又能增加治療性抗體的腫瘤滲透性、在腫瘤組織以及血液中滯留時(shí)間(Gregory P，et alCancerResearch 1993，534026-4034；Adams GP，et alBrit.J Cancer(1998)77(9)1405-1412)，這為應(yīng)用單克隆抗體的單鏈可變區(qū)或Fab片段作為治療性藥物奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
最近一種經(jīng)聚乙稀二醇化的腫瘤壞死因子抗體Fab片段巳證實(shí)能有效控制類(lèi)風(fēng)濕病和慢性結(jié)腸炎，并經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)建入臨床應(yīng)用。
近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床驗(yàn)證的黑色素細(xì)胞分化相關(guān)基因(英文名melanoma differentiation associated(mda)genes)，又稱(chēng)白細(xì)胞介素-24(縮寫(xiě)IL-24、下同)，屬于白細(xì)胞介素-10家族的一員。Mda-7/IL-24基因是一個(gè)結(jié)構(gòu)上保守的基因，其表達(dá)產(chǎn)物是由206個(gè)氨基酸組成的一種糖蛋白。能誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-6、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-a、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-12和集落細(xì)胞刺激因子表達(dá)(Devanand Sarkar，et alPNAS，2005.105(39)14034-14039)，因而具有多重抗腫瘤效應(yīng)。多種腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究證明該基因具有區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的能力、能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡功能以及抑制腫瘤血管形成和腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力、并使腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥、生物制劑和放射線(xiàn)治療更為敏感和協(xié)同冶療作用，而更重要的是對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性作用。Mda-7被認(rèn)為是一種特異性腫瘤凋亡因子，具有雙重作用的細(xì)胞因子，其正常生理功能可能與免疫系統(tǒng)的有關(guān)，而其過(guò)表達(dá)則致特異性腫瘤細(xì)胞凋亡(Fisher PB，et alCancerBiol Ther.2003 Jul-Aug；2(4 Suppl 1)S23-37；Fisher PBet alCurr GeneTher.2006 Feb；6(1)73-91；Gupta P，et alPharmacol Ther.2006Sep；111(3)596-628.Epub 2006 Feb 7)。目前在國(guó)外臨床驗(yàn)證療效令人滿(mǎn)意。在晚期腺癌患者的臨床I期和II期驗(yàn)證中表明是安全的和耐受良好的，一次瘤內(nèi)注射可致大多數(shù)腫瘤細(xì)胞凋亡。
國(guó)外臨床研究證明治療惡性乳腺癌的人源化單抗結(jié)合應(yīng)用Mda-7/IL-24的治療效果顯著優(yōu)于單用人源化單抗、或結(jié)合化療的效果，甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤都消失(Bocangel D，et alCancer Gene Ther.2006Oct；13(10)958-68)。
基于上述的研究和臨床研究，構(gòu)建一種共表達(dá)neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda-7/IL-24的重組腺病毒，以便更有效的治療過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2腫瘤將是可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建構(gòu)建一種共表達(dá)neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda-7/IL-24的重組腺病毒以及利用其表達(dá)產(chǎn)物治療如本說(shuō)明書(shū)中所描述的過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2腫瘤，如卵巢癌、肺癌和胃癌等。本發(fā)明的共表達(dá)neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda-7/IL-24的重組腺病毒的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其主要特征為1).應(yīng)用的抗neu/erbB2原癌基因的抗體為其人源化單抗可變區(qū)；2).人源化單抗可變區(qū)的N-末端連接著人白細(xì)胞介素-2N-末端的20個(gè)氨基酸構(gòu)成的分泌肽；3).Mda-7/IL-24為206個(gè)氨基酸組成全長(zhǎng)基因片段，其中第72位氨基酸Ala轉(zhuǎn)換為Val；4).人源化單抗可變區(qū)片段和Mda-7/IL-24基因通過(guò)內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)片段相連接；5).Mda-7/IL-24基因共表達(dá)人源化單抗可變區(qū)和Mda-7/IL-24的表達(dá)盒由CMV啟動(dòng)子、人源化單抗可變區(qū)片段、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)片段、Mda-7/IL-24基因和SV40多聚腺嘌呤序列構(gòu)成；


附圖1原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv克隆第一道為DNA分子量標(biāo)記物，第二泳道為的EcoR1酶切結(jié)果，箭頭所指為原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv片段。
附圖2SDS-PAGE凝膠分析。原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv基因在原核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。第一道為末誘導(dǎo)菌體總蛋白；第二道和第三道分別為1小時(shí)和第三小時(shí)誘導(dǎo)菌體總蛋白，箭頭所指為scFv表達(dá)產(chǎn)物。
附圖3Mda-7基因的克隆及酶切電泳分析經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，克隆Mda-7基因于T-Easy載體。此為EcoR1酶切消化結(jié)果，第一、第二泳道為DNA分子量標(biāo)記物，第三泳道為Mda-7的EcoR1酶切結(jié)果，產(chǎn)生二個(gè)片段。箭頭所指為Mda-7基因。
附圖4由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒構(gòu)成圖譜此表達(dá)盒圖譜顯示由位于N-未端的CMV啟動(dòng)子、原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv、IRES、Mda-7和SV40多聚腺嘌呤組成，并以不同內(nèi)切酶位點(diǎn)相連接。
附圖5表達(dá)由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒的重組腺病毒結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖中兩瑞分別為腺病毒的左臂和右臂，表達(dá)盒由CMV啟動(dòng)子、原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES，下同)、Mda-7基因和SV40多聚腺苷酸組成。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用的腺病毒載體為Stratagene公司產(chǎn)品，包括腺病毒穿載體PaDeasy-1。穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-IRES。
實(shí)施例一原癌基因neu/erbB2人源化單抗scFv(下同)基因的克隆過(guò)程如下(包括人單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間連接；新型scFv基因表達(dá)質(zhì)粒的克隆)1).人源化單克隆抗體輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)的連接a.以人源化單克隆抗體cDNA作為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。首先擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)，使輕鏈可變區(qū)5’-N未端增加一個(gè)Hind111和Nhe1內(nèi)切酶切點(diǎn)，并拼接上人白細(xì)胞介素-2的由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，其3’-C末端帶有Kpn1內(nèi)切酶切點(diǎn)。此過(guò)程經(jīng)過(guò)二次PCR反應(yīng)完成，即用引物2和引物3進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)；第二次以第一次反應(yīng)產(chǎn)物為模板，應(yīng)用引物1和引物3進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，；PCR引物設(shè)計(jì)如下引物15’-gtaagcttgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt-3’引物25’-actaagtcttgcacttgtcacaaacagtgatatccagatgaccca-3’引物35’-agctgaacctcacttttgatctccaccttggtaccctgtccg-3’其PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、加腺嘌呤(A Tailling)處理后連于T-easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后擴(kuò)增T-easy質(zhì)粒并測(cè)序確定。
b.同樣，使重鏈可變區(qū)5’-N未端含有輕鏈可變區(qū)3’-C末端部份編碼序列，該3’-C末端序列包含一個(gè)Kpn1內(nèi)切酶切點(diǎn)，并在重鏈可變區(qū)5’-N未端和輕鏈可變區(qū)3’-C末端之間通過(guò)接頭(-G-G-G-G-S-)相連接，其3’-C末端增加一個(gè)Not1內(nèi)切酶切點(diǎn)。
PCR引物設(shè)計(jì)如下引物35’-acagggtaccaaggtggagatcaaaggtggcggtggctcggaggttcagctgg-3’引物45’-ctagcggccgccctacgaggagacggtgaccagggtt-3’其PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、加腺嘌呤(A Tailling)處理后連接于T-easy載體。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后，擴(kuò)增T-easy質(zhì)粒并測(cè)序確定。
c.人源化單克隆抗體輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)的連接用內(nèi)切酶Nhe1、Kpn1和Kpn1、Not1分別消化上述A和B的T-easy載體，從0.8％瓊脂糖上分離、純化抗體輕鏈Nhe1-Kpn1片段和重鏈Kpn1和Not1片段，進(jìn)行拼接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后，抽取質(zhì)粒DNA，測(cè)序確定。
2).經(jīng)測(cè)序正確后，應(yīng)用內(nèi)切酶Nhe1和Not1消化含上述scFv的T-easy載體，獲得的片段經(jīng)純化處理后，與用內(nèi)切酶Nhe1和Not1預(yù)先消化、純化后的表達(dá)質(zhì)粒pPET45B進(jìn)行拼接，形成含人源化單克隆抗體可變區(qū)scFv表達(dá)質(zhì)粒pPET45B-scFv。最后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌、質(zhì)粒擴(kuò)增后，經(jīng)測(cè)序和酶切證實(shí)。
實(shí)施例二、Mda-7 DNA片段的人工合成及其克隆根椐巳知基因序列，按常規(guī)技術(shù)人工合成Mda-7的編碼DNA片段，在其5’-末端增加Smal1，在3’-未端增加X(jué)ba1酶切位點(diǎn)，并以下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物15’-agcgggccctatgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtgg-3’引物25’-cgacagatctatcagagcttgtagaatttctgcatcc-3’PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測(cè)序確定。
實(shí)施例三、由CMV啟動(dòng)子、scFv、內(nèi)部核糖體結(jié)合點(diǎn)(IRES)和Mda-7組成的表達(dá)盒的構(gòu)建。本實(shí)施例所用的Stratagene公司產(chǎn)品為pShuttle-IRES，以此載體為骨架構(gòu)建表達(dá)盒。通過(guò)多次不同的內(nèi)切酶消化、連接反應(yīng)、感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化和測(cè)序證實(shí)，完成此表達(dá)盒構(gòu)建。即以5’-末端為Nhe1和3’-末端為Not1內(nèi)切酶位點(diǎn)的scFv片段，拼接于IRES的上游；以5’-末端為Sma1內(nèi)切酶位點(diǎn)和3’-末端為Xba1內(nèi)切酶位點(diǎn)的Mda-7基因片段拼接于SV40多聚腺嘌呤的上游，而位于IRES的下游；至此，此表達(dá)盒構(gòu)建才告完成。
實(shí)施例四、構(gòu)建含此表達(dá)盒的腺病毒穿梭質(zhì)粒1).以?xún)?nèi)切酶Sal1消化上述含表達(dá)盒的pIRES質(zhì)粒DNA，將產(chǎn)生Sal1一個(gè)DNA片段，由此，該表達(dá)盒將包含上述整個(gè)表達(dá)盒和SV40的多聚腺嘌呤DNA序列。消化后，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳分離、純化所需DNA片段備用。
2).以?xún)?nèi)切酶Sal1消化pShuttle穿梭載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳分離、純化線(xiàn)性化的pShuttle載體DNA備用。
3).將上述線(xiàn)性化的pShuttle載體DNA片段和消化表達(dá)盒產(chǎn)生的Sal1DNA片段，在連接酶作用下進(jìn)行拼接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)擴(kuò)增。
4).篩選細(xì)菌轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)擴(kuò)增，抽取重組質(zhì)粒DNA，最后再經(jīng)酶切消化和DNA測(cè)序證實(shí)。
實(shí)施例五、共表達(dá)scFv和Mda-7基因的重組腺病毒1).制備線(xiàn)性化含scFv和Mda-7基因表達(dá)盒的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-scFv-Mda-7取適量上述重組穿梭質(zhì)粒DNA，經(jīng)核苷酸內(nèi)切酶Pme1消化、電泳分離、純化Pme1酶切線(xiàn)性化重組穿梭質(zhì)粒DNA，備用。
2).將上述線(xiàn)性化重組穿梭質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化已預(yù)轉(zhuǎn)化腺病毒載體pAdEasy-1的BJ5183-AD-1細(xì)菌，進(jìn)行同源重組，并以抗生素卡拉霉素進(jìn)行篩選。含腺病毒載體pAdEasy-1重組體的細(xì)菌將為耐卡拉霉素細(xì)株。
3).擴(kuò)增含腺病毒載體pAdEasy-1重組體的、耐卡拉霉素的細(xì)株，即擴(kuò)增重組腺病毒載體pAdEasy-1 DNA。抽提腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，用內(nèi)切酶Pac1消化，線(xiàn)性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，并分離純化備用。
4).按Stratagene公司關(guān)于AdEasy XL Adenoviral Vector System說(shuō)明手冊(cè)介紹的方法，將上述純化備用的線(xiàn)性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA轉(zhuǎn)染AD-胚胎腎293細(xì)胞。
5).轉(zhuǎn)染AD-胚胎腎293細(xì)胞7-10天后，備制原代重組腺病毒母液，并優(yōu)化原代重組腺病毒母液的感染AD-胚胎腎293細(xì)胞的條件，擴(kuò)增重組腺病毒。
6).擴(kuò)增足量的高滴定度的重組腺病毒，用于研究和動(dòng)物試驗(yàn)。
序列表Individual Applicant--------------------Street科學(xué)城國(guó)際企業(yè)孵化器A區(qū)610房City廣州市State廣東省Country中國(guó)PostalCode510633PhoneNumber020-32290208FaxNumber020-38491559EmailAddressshangwu_w@yahoo.com<110>LastName王<110>FirstName尚武<110>MiddleInitial<110>SuffixApplication Project-------------------<120>Title治療過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2惡性腫瘤的重組腺病毒<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber1<141>CurrentFilingDate2006-10-26Sequence--------<210>1<211>784<212>DNA<213>neu/erbB2人源化單抗可變區(qū)人工序列<400>1gtaagcttgc tagcatgtac aggatgcaac tcctgtcttg cattgcacta agtcttgcac 60ttgtcacaaa cagtgatatc cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg120gcgatagggt caccatcacc tgccgtgcca gtcaggatgt gaatactgct gtagcctggt180atcaacagaa accaggaaaa gctccgaaac tactgattta ctcggcatcc ttcctctact240ctggagtccc ttctcgcttc tctggctcaa gatctgggac ggatttcact ctgaccatca300gcagtctgca gccggaagac ttcgcaactt attactgtca gcaacattat actactcctc360ccacgttcgg acagggtacc aaggtggaga tcaaaggtgg cggtggctcg gaggttcagc420tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag480cttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc ccgggtaagg540gcctgaaatg ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat gccgatagcg600tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac ctgcagatga660acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgttc tagatgggga ggggacggct720tctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg taggcggccg780caga 784
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200 205 210Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val215 220 225Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp230 235 240Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser245 250<210>3<211>641<212>DNA<213>Mda-7人工序列<400>3agcgggccca tgaattttca acagaggctg caaagcctgt ggactttagc cagacccttc 60tgccctcctt tgctggcgac agcctctcaa atgcagatgg ttgtgctccc ttgcctgggt120tttaccctgc ttctctggag ccaggtatca ggggcccagg gccaagaatt ccactttggg180ccctgccaag tgaagggggt tgttccccag aaactgtggg aagtcttctg ggctgtgaaa240gacactatgc aagctcagga taacatcacg agtgcccggc tgctgcagca ggaggttctg300cagaacgtct cggatgctga gagctgttac cttgtccaca ccctgctgga gttctacttg360aaaactgttt tcaaaaacta ccacaataga acagttgaag tcaggactct gaagtcattc420tctactctgg ccaacaactt tgttctcatc gtgtcacaac tgcaacccag tcaagaaaat480gagatgtttt ccatcagaga cagtgcacac aggcggtttc tgctattccg gagagcattc540aaacagttgg acgtagaagc agctctgacc aaagcccttg gggaagtgga cattcttctg600acctggatgc agaaattcta caagctctga ttctagagtc g641<210>4<211>206<212>PRT<213>Mda-7人工序列<400>4Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Arg5 10 15
Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met20 25 30Val Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln35 40 45Val Ser Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln50 55 60Val Lys Gly Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Val Phe Trp Ala65 70 75Val Lys Asp Thr Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg80 85 90Leu Leu Gln Gln Glu Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser95 100 105Cys Tyr Leu Val His Thr Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val110 115 120Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys125 130 135Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe Val Leu Ile Val Ser Gln140 145 150Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe Ser Ile Arg Asp Ser155 160 165Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala Phe Lys Gln Leu170 175 180Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu Val Asp Ile185 190 195Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu200 20權(quán)利要求
1，一種共表達(dá)原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體單鏈可變區(qū)和Mda-7的重組腺病毒。本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品AdEasy-1載體，為E1和E3區(qū)缺失的腺病毒載體。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)盒由CMV動(dòng)子、原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體單鏈可變區(qū)、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)片段、Mda-7和SV40多聚腺嘌呤組成，其主要特征為a).原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體僅由抗體可變區(qū)構(gòu)成；b).原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體可變區(qū)序列中，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過(guò)氨基酸多肽-G-G-G-G-G-S-(GS1)連結(jié)，在其N(xiāo)-末端以?xún)?nèi)切酶Nhe1和C-末端以?xún)?nèi)切酶Not1片段拼接于pIRES質(zhì)粒上游；c).人Mda-7的第72位氨基酸由Ala突變成Val，其他氨基酸組成及其排列順序不變；d).Mda-7基因在其N(xiāo)-末端以?xún)?nèi)切酶Smal和C-末端以?xún)?nèi)切酶Xba 1片段拼接于pIRES質(zhì)粒下游；經(jīng)重組后，該表達(dá)盒位于腺病毒載體的E1缺失區(qū)。該重組腺病毒具有共表達(dá)neu/erbB2的人源化單克隆抗體單鏈可變區(qū)和Mda-7的作用，因而具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡功能、抗癌譜更廣的生物功能。
2.根椐權(quán)利要求1，一種CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)二種有協(xié)同抗癌作用基因的表達(dá)盒，其含有下列氨基酸序列a).與人Mda-7的親本多肽的氨基酸序列基本一致，僅有一個(gè)氨基酸的取代，即此腫瘤抑制基因p53的第72氨基酸由Val(V72)代替野生型Mda-7同一位置的Ala(A72)；b).一種以鼠源抗neu/erbB2原癌基因抗體基因?yàn)槟０澹瑧?yīng)用基因突變技術(shù)，人工改造成的一種抗neu/erbB2原癌基因的人源化單克隆抗體單鏈可變區(qū)片段；c).內(nèi)部校核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)源于腦心肌炎病毒；
3.根椐權(quán)利要求1和要求2所述重組腺病毒，其特征在于表達(dá)盒中驅(qū)動(dòng)共表達(dá)原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體可變區(qū)和Mda-7基因的啟動(dòng)子序列不僅限于CMV啟動(dòng)子，也包括其他病毒啟動(dòng)子以及某些腫瘤特異性啟動(dòng)子，如鼠源腫瘤特異性PEG-3基因啟動(dòng)子，人端粒酶啟動(dòng)子、雌激素和低氧反應(yīng)啟動(dòng)子、人前列腺癌特異因子啟動(dòng)和肝胎兒甲型球蛋白啟動(dòng)子(AFP，胎甲球蛋白啟動(dòng)子)。
4.根椐權(quán)利要求1，表達(dá)盒中共表達(dá)的原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體可變區(qū)既可位于IRES的上游，也可位于其下游；Mda-7亦如此。
5.根椐權(quán)利要求1和要求3，由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)的、位于IRES上游的基因既可是本發(fā)明的，也可以是有其他有治療價(jià)值的人源化或全人化單克隆抗體可變區(qū)；位于IRES下游的基因既可是Mda-7基因，也可以是其他促細(xì)胞凋亡基因，如Noxa、p53RFP和P27(Kip1)；免疫調(diào)節(jié)因子，如IL-2、IL-6、IFN-γ，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a等；
6.根椐權(quán)利要求1，本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品AdEasy-1載體，為E1和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。但本發(fā)明使用的腺病毒載體不限于此復(fù)制缺陷型Ad5型腺病毒，也包括條件性復(fù)制的腺病毒載體，如本人申請(qǐng)的另一專(zhuān)利“一種用于臨床腫瘤基因治療的新型腺病毒載體”所敘述的腺病毒載體。該專(zhuān)利敘述的條件性復(fù)制腺病毒載體為一種由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)腺病毒復(fù)制因子E1A基因僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因而具有僅能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。而且，其纖維蛋白AB環(huán)、H1環(huán)和/或Shaft進(jìn)行了突變，具有感染力更強(qiáng)、感染細(xì)胞譜更廣的特點(diǎn)。此新型重組腺病毒也可僅表達(dá)Mda-7基因。
7.根椐權(quán)利要求1，此共表達(dá)原癌基因neu/erbB2的人源化單克隆抗體可變區(qū)和Mda-7的重組腺病毒為一種用于治療多種過(guò)表達(dá)原癌基因neu/erbB2惡性癌癥疾病的基因治療藥物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
8.如權(quán)利要求7所述的基因治療藥物，其特征在于，權(quán)利要求1所述的為共表達(dá)原癌基因neu/erbB2基因可變區(qū)和Mda-7基因的重組腺病毒，所述的有效抗癌成份為原癌基因neu/erbB2基因可變區(qū)和Mda-7基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明敘述了一種構(gòu)建表達(dá)neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda－7/IL－24的表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的重組腺病毒的方法及其用途和意義，其表達(dá)盒結(jié)構(gòu)主要特征為1)neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)；2)Mda－7/IL－24為206個(gè)氨基酸組成全長(zhǎng)基因片段，其中第72位氨基酸Ala轉(zhuǎn)換為Val；3)通過(guò)內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)將neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda－7基因連接；3)該重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的血清A5型腺病毒。該新型腺病毒具有共表達(dá)二種抗癌基因，即neu/erbB2原癌基因人源化單抗可變區(qū)和Mda－7基因，其產(chǎn)物具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能，但對(duì)正常細(xì)胞不會(huì)造成損傷。因此，在過(guò)表達(dá)neu/erbB2原癌基因的惡性腫瘤的基因治療中將具有重要意義。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101054596SQ20071002736
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日
發(fā)明者王尚武 申請(qǐng)人:王尚武