專利名稱：一種混合脂肪酸的高效液相色譜分離方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酸混合物的分離方法，特別是涉及一種利用高效液相色譜分
離脂肪酸混合物的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸是一端含有一個羧基的長的脂肪族碳?xì)滏湥侵匾墓I(yè)原料，也是有機(jī) 體主要營養(yǎng)素的重要成分和主要能量來源之一。隨著人們生活水平的提高，對脂肪酸的測 定愈來愈顯得重要。食品營養(yǎng)及安全方面，各種食用油、糧食、水果以及奶粉的脂肪酸組成 成分及含量的測定是必不可少的；醫(yī)藥方面，一些疾病患者疾病的診斷，中草藥、注射液等 的品質(zhì)好壞均依賴于對脂肪酸組成及含量的分析；能源方面，越發(fā)重要的生物能源的評價 及研究需要越來越成熟的高效，低成本，精確的脂肪酸測定方法；環(huán)境衛(wèi)生方面，污水中過 氧脂肪酸等的檢測也是一項十分重要的指標(biāo)。在科學(xué)研究領(lǐng)域，如生物膜結(jié)構(gòu)、功能，動植 物及微生物的脂肪酸代謝等方面的研究，對脂肪酸進(jìn)行原位水平研究的前提是對脂肪酸分 離及含量測定甚至超微量分析。如何科學(xué)、精確地測定脂肪酸的組成及含量是諸多脂肪酸 的研究、分析、生產(chǎn)等能夠得到開展并得到可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。因此，如何高效、快速、精準(zhǔn)地 分析脂肪酸組成，并實現(xiàn)檢測成本的最低化，是脂肪酸分離和定量的迫切要求。
很長一段時間內(nèi)人們一直采用氣相色譜(GC)完成對脂肪酸的分離和含量測定， 由于氣相色譜的分離能力及靈敏度不如液相色譜高，使得該方法在混合脂肪酸樣品及痕量 分析中難以湊效。自上世紀(jì)90年代起有研究者開始嘗試用液相色譜法分離不同的脂肪酸， 但所能實現(xiàn)的分離效果不佳，能同時分離出的脂肪酸各類也很少。高效液相色譜(HPLC)法 采用常規(guī)的紫外_可見光檢測器，能夠達(dá)到檢測靈敏度明顯提高的目的，并且檢測結(jié)果達(dá) 到ng級水平，因此在實際檢測中的具有廣闊的適用范圍。在脂肪酸分析領(lǐng)域，由于HPLC定 量準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、分離能力強(qiáng)，在脂肪酸分離上的應(yīng)用一直為研究者所重視，但研究 成果卻并不理想。表現(xiàn)為或者分離效果不佳，或者同時分離的脂肪酸種類很少。特別是在 分離幾種分子量和物化性質(zhì)都很接近的脂肪酸混合物時，現(xiàn)有技術(shù)中更是鮮見報道。所以 無論在實驗室還是實際生產(chǎn)中，用HPLC分析脂肪酸的方法使用率并不高。
亞麻酸(C18:3)，棕櫚油酸(C16:l)，亞油酸(C18:2)，油酸(C18:l)，棕櫚酸 (C16:0)，和硬脂酸(C18:0)是自然界中常見的6種脂肪酸，它們是生物膜組織和神經(jīng)組織 的重要組成成分。由于這6種脂肪酸通常是混合存在于生物組織中，因此對它們的分離與 定量分析是諸多相關(guān)研究內(nèi)容的基礎(chǔ)。但這6種脂肪酸具有十分相近化學(xué)、物理性質(zhì)，對它 們的分離手段研究一直收效甚微。特別是利用HPLC完成的對這6種混合脂肪酸的共時分 離與定量分析的方法更為有限。 譚冰等人發(fā)表在1996年第1期《瀘天化科技》的"HPLC法測定菜油中脂肪酸組成" 一文中公開了一種用高效液相色譜(HPLC)法分析脂肪酸組成的方法，該方法對菜油樣品 經(jīng)皂化后直接衍生形成脂肪酸苯乙酮酯進(jìn)行色譜分離，分離出了菜油中亞麻酸、棕櫚油酸、 亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸、花生烯酸、芥酸和山崳酸等9種脂肪酸的衍生物。該方法公
4開的主要色譜分離條件為ZorbaxODS分析柱4. 6X250mm，流動相甲醇水=90 : IO，進(jìn) 樣30min后改為純甲醇，流速2ml/min，檢測波長254nm，靈敏度0. 2AUFS。該方法采用梯度 洗脫的方式分離目標(biāo)脂肪酸。與等度洗脫方式相比，梯度洗脫存在多方面的缺點比如操作 復(fù)雜，對作為流動相的溶劑的互溶性要求高，對溶劑的純度要求高；流動相不能循環(huán)利用， 增加了分析成本；每次運行梯度洗脫之后必須重新平衡色譜柱、耗時較長，以及常常引起基 線漂移和降低重現(xiàn)性等。并且某些色譜柱_流動相的聯(lián)合應(yīng)用不適于梯度洗脫也限制了梯 度洗脫方式的適用性。該方法選用甲醇與水的混合物或者純甲醇作為流動相。以甲醇作為 流動相有兩方面的不利影響，一是甲醇HPLC級的吸光度比乙腈大，在UV檢測時，產(chǎn)生的噪 聲大，因此在進(jìn)行UV短波長上的高靈敏度分析時甲醇HPLC級比乙腈差(分析脂肪酸正是 短波長區(qū))；二是甲醇與水混合后粘度增大，在同樣的流速下會在柱內(nèi)加上多余的壓力，從 而減少色譜柱的使用壽命。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種高效液相色譜(HPLC)法分離 并定量分析混合脂肪酸組成的方法。該方法僅使用常規(guī)HPLC儀器配置就能在很短時間 內(nèi)同時分析出亞麻酸(C18:3)，棕櫚油酸(C16:l)，亞油酸(C18:2)，油酸(C18:l)，棕櫚酸 (C16:0)，和硬脂酸(C18:0) 6種化學(xué)、物理性質(zhì)十分相近的常見脂肪酸的組成含量，方法簡 單易行、運行成本經(jīng)濟(jì)節(jié)約。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
—種混合脂肪酸的高效液相色譜分離方法，首先將待測脂肪酸溶液用"_溴代苯 乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液進(jìn)行脂化處理得到待測液，再將待測液上樣進(jìn)行高 效液相色譜分離，其特征在于所述高效液相色譜分離采用等度洗脫方式分離，流動相采用 乙腈與CTAB水溶液的混合液或者乙腈_水溶液。 HPLC分離效果主要由色譜分離條件決定，分離條件影響著被分離混合物由流動相 液體推動進(jìn)入色譜柱后樣品分子與溶劑(即流動相或洗脫液)以及固定相分子間的作用， 作用力的大小，決定了色譜過程的保留行為，從而決定了分離效果。色譜分離條件中以流動 相組成、流速、色譜柱溫度及洗脫方式最為重要。本技術(shù)方案采用HPLC分析脂肪酸組成，選 擇優(yōu)化流動相組成、色譜柱溫度、流動相流速等色譜分離條件。 在流動相組分選擇方面，本技術(shù)方案以乙腈為主的乙腈_水溶液或乙腈與CTAB水 溶液的混合液為流動相。HPLC中流動相是液體，與組分間有親合作用力，并參與固定相對組 分的競爭，能提高柱的選擇性、改善分離度，因此流動相的正確選用直接影響組分分離度。 本技術(shù)方案以乙腈為主的乙腈-水溶液為流動相在脂肪酸的HPLC分析中至少有兩點優(yōu)點 第一，低粘度。低粘度是流動相的優(yōu)選方向，也是對流動相溶劑的基本要求之一。因為高粘 度溶劑作為流動相勢必增高柱壓不利于分離，不利于系統(tǒng)的穩(wěn)定運行，也不利于色譜柱的 保護(hù)。乙腈的粘度雖然與甲醇相近，但是甲醇與水混合后粘度增高，而乙腈與水混合后粘度 變化則不大。因此本技術(shù)方案中選用乙腈與水的混合物為流動相在與甲醇與水的混合物作 流動相相比，在同樣的流速下不需增加柱壓，優(yōu)勢明顯；第二，低吸光度。在乙腈和甲醇的市 銷HPLC級和優(yōu)級的吸收光譜中，乙腈HPLC級吸收最小，在UV檢測時產(chǎn)生的噪聲小，這一特 征在短波長上最為顯著。由于分析脂肪酸正是短波長區(qū)，因此本技術(shù)方案選用乙腈為流動 相能夠提高HPLC在脂肪酸分析中的靈敏度。并且乙腈HPLC級在UV檢測中的梯度基線上
5產(chǎn)生鬼峰少，對色譜圖分析的干擾小。 在洗脫梯度方面，本技術(shù)方案采用等度洗脫，即在同一分析周期內(nèi)流動相組成保 持恒定，以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分。這樣不僅穩(wěn)定性高、色譜重現(xiàn)性好，并且方法操 作簡便也易于色譜柱再生，在系統(tǒng)運行時還可以實現(xiàn)流動相的循環(huán)利用(根據(jù)檢測的具體 情況，確定循環(huán)的次數(shù))，能夠節(jié)約方法運用的成本。 在色譜柱溫度選擇方面，本技術(shù)方案采用10°C 2(TC柱溫，優(yōu)選溫度為15°C。色 譜柱溫度因為影響容量因子k'而影響分離度，因而是影響HPLC分離效果的最要因子。
在流動相流速選擇方面，流動相的不同流速會影響分離度，一般而言將流動相控 制在較低的流速范圍內(nèi)可以使兩物質(zhì)的保留時間顯著延長，有利于提高分離度。但由于保 留時間變長所有縱向擴(kuò)散會明顯增加，表現(xiàn)為峰型矮胖，并且流速慢會使峰變寬，使柱效明 顯下降，大大延長了分析時間，提高了分析方法實施的時間成本。因此HPLC中，在流動相組 成、色譜柱及柱溫相同的條件下，流動相的流速在一定范圍內(nèi)均能滿足對樣品的分離效果， 并會存在最佳流速。本技術(shù)方案提供流動相流率在1. 0ml/min 2. Oml/min范圍內(nèi)均可以 滿足對混合脂肪酸的分離，其中以1. 5ml/min為最優(yōu)流速。 本混合脂肪酸的高效液相色譜分離方法適用于對樣品中含有亞麻酸、棕櫚油酸、
亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸六種脂肪酸中至少一種的混合脂肪液進(jìn)行分離，或者對樣品
中亞麻酸、棕櫚油酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸六種脂肪酸的同時分離。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是所述分析方法利用高效液相色譜同時分
離化學(xué)、物理性質(zhì)十分相近的亞麻酸(C18:3)，棕櫚油酸(C16:l)，亞油酸(C18:2)，油酸
(C18:l)，棕櫚酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)等6種常見脂肪酸。該方法操作簡單易行、分
離效果好、檢測靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，同時分離6種脂肪酸分離時間短、效率高。并且，
本技術(shù)方案提供的分析方法僅采用常規(guī)的HPLC儀器便可實施，無需專門配置價格昂貴的
檢測器。


圖l是實施例一色譜圖。
圖2是實施例二色譜圖。
圖3是實施例三色譜圖。
圖4是實施例四色譜圖。
圖5是實施例五色譜圖。
圖6是實施例六色譜圖。
圖7是實施例七色譜圖。
圖8是實施例八色譜圖。
圖9是實施例九色譜圖。 圖中吸引峰對應(yīng)脂肪酸為l一亞麻酸(C18:3)、2—棕櫚油酸(C16:l)、3—亞油 酸(C18:2)、4一油酸(C18:l)、5—棕櫚酸(C16:0) 、6—硬脂酸(C18:0)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明優(yōu)選實施例作進(jìn)一步的描述。
6
實施例一
混合脂肪酸分析試驗。
1、儀器與主要試劑
1. 1試驗使用儀器 色譜儀器配置高效液相色譜儀(日本島津(SHIMADZU) LC-20AD高效液相色譜儀， 島津CT0-10AS柱溫箱，島津SPD-M20A二極管陣列檢測器)；記錄色譜圖(島津LC solution 色譜數(shù)據(jù)工作站)。
1.2試劑標(biāo)準(zhǔn)樣亞麻酸(C18:3)，棕櫚油酸(C16:l)，亞油酸(C18:2)，油酸(C18:l)，棕櫚 酸(C16:0)，和硬脂酸(C18:0)購自美國sigma公司，對照品級。
2、標(biāo)準(zhǔn)樣的制備 6種脂肪酸分別用甲醇作為溶劑配成lmg/ml脂肪酸溶液；分別取等量脂肪酸溶液
均勻混合成脂肪酸混合溶液。 3、脂肪酸脂化處理 取25 iU脂肪酸混合溶液于試管中，氮氣吹干，精密加入10mg/ml "-溴代苯乙酮 的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25iU，試管密封，混合均勻，于約IO(TC加 熱約15min ;冷卻至室溫后，精密加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80 y 1，于約IO(TC加熱5約 min，氮氣吹干；再加入甲醇500iU，振蕩約lmin，下離心約10min，取上清液上樣分析。
4、HPLC分析
色譜分離條件如下色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m)
柱溫15。C 流動相:乙月青:水(v/v，下同)=90 : io 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm 試驗色譜圖如圖1所示。 實施例二 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m) 柱溫10。C 流動相乙腈5%CTAB = 90 : 10 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm 試驗色譜圖如圖2所示。 實施例三 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m)
7
柱溫15。C 流動相乙腈水=95 : 5 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm。 試驗色譜圖如圖3所示。 實施例四 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m) 柱溫15。C 流動相乙腈5%CTAB = 95 : 5 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm 試驗色譜圖如圖4所示。 實施例五 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m) 柱溫18。C 流動相乙腈5%CTAB = 95 : 5 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm 試驗色譜圖如圖5所示。 實施例六 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m) 柱溫15。C 流動相乙腈10%CTAB = 94 : 6 流速1.5ml/min 檢測波長242士5nm 試驗色譜圖如圖6所示。 實施例七 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下 色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m) 柱溫17" 流動相乙腈10%CTAB = 94 : 6 流速1.5ml/min
8
檢測波長242士5nm
試驗色譜圖如圖7所示。
實施例八 混合脂肪酸分析試驗。其與實施例一中相同之處不再重復(fù)，不同之處在于，色譜分 離條件如下色i普柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 u m)
柱溫20。C 流動相乙腈10%CTAB = 94 : 6
流速1.5ml/min
檢測波長242士5nm
試驗色譜圖如圖8所示。
實施例九 小麥葉片內(nèi)囊體膜脂肪酸定量分析試驗。
1、儀器、材料與主要試劑
1. l試驗使用儀器
同實施例一。
1.2材料新鮮小麥旗葉于-S(TC保存?zhèn)溆谩?
1.3試劑 內(nèi)囊體膜提取液水溶液，每升溶液包含50mmolNa、K磷酸緩沖液(PH7. 4)， 200mmolNaCl， lOOmmol蔗糖，5mmolMgC12， lmmol DTT。
2、小麥葉片內(nèi)囊體膜脂肪酸樣品制備
2. l內(nèi)囊體膜的提取 稱4g植物材料，加入提取液40ml，研磨成勻漿，用四層紗布過濾。濾液經(jīng)1000Xg 離心5min，取上清液，再6000Xg離心10min。用提取液分散沉淀過濾，濾液經(jīng)1000Xg離 心5min，取上清液，再6000 X g離心10min，得到提純內(nèi)囊體膜液，其中葉綠素的濃度控制在 1 2mg/ml之間。葉綠素濃度用Amon的方法(Arnon，D. I. ， 1949)在663nm禾P 645nm兩禾中
波長測定光吸收和計算。所得內(nèi)囊體膜液用液氮保存?zhèn)溆谩?
2.2膜脂肪酸的制備 300 iil內(nèi)囊體膜液中加入6ml氯仿:甲醇(2 : 1，V/V)提取類脂，加入2mL0. 76% NaCl使液體分層。取下層，氮氣吹干。立即加入2mL2. 0%的KOH-甲醇溶解，取500iU溶 解液，于IO(TC水浴皂化30min，待冷至室溫后，加入250 y 1水和25 y 1濃鹽酸，得到自由脂 肪酸釋放溶液，再用700 iU正己烷抽提三次制得膜脂肪酸溶液待用。
3、膜脂肪酸脂化處理 取200iU脂肪酸混合溶液于試管中，以下步驟同實施例一中"3、脂肪酸脂化處 理"步驟得到上樣待測液。
4、HPLC分析
色譜分析條件色譜柱色譜柱Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm， 5 ii m)






柱溫18°C
流動相乙腈5% CTAB水溶液=95 : 5 流速1. 5ml/min 檢測波長242nm
試驗重復(fù)3次，分離色譜圖如圖9所示。譜圖用峰面積法定3 表1色譜峰面積值
試驗結(jié)果見表l、2c
峰面 積亞麻酸棕櫚油酸亞油酸油酸棕櫚酸硬脂酸
13285337100477551542815334850066
23594098472542041523115098852853
33199377354443131478714717451967
平均 ±SD335959. 67 ±11984. 387642. 00±421. 4 348757. 33±289 8. 9415148. 67±189. 56150503. 33±17 98. 6851628. 67±822. 13 表2單位重量葉片的內(nèi)囊體中各脂肪酸的含j
含量(ug/g)亞麻酸棕櫚油酸亞油酸油酸棕櫚酸硬脂酸
1187. 89203. 106326. 24538. 999783. 221525. 4784
2205. 90303. 706530. 47748. 884881. 844927. 1041
3182. 87763. 217423. 98648. 625879. 620026. 5873
平均±SD192. 22±6. 993. 34±0. 1827. 61±1. 908. 84±0. 1181. 56±1. 0526. 39±0. 48
10
權(quán)利要求
一種混合脂肪酸的高效液相色譜分離方法，首先將待測脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液進(jìn)行脂化處理得到待測液，再將待測液上樣進(jìn)行高效液相色譜分離，其特征在于所述高效液相色譜分離采用等度洗脫方式分離，流動相為如下二種溶液之一一、乙腈與CTAB水溶液的混合液；二、乙腈-水溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述流動相為如下二種溶液之一 一、 乙腈與CTAB水溶液的混合液，乙腈90% 95% ， CTAB水溶液10% 5% ，所述CTAB 水溶液濃度《10% ;二、 乙腈-水溶液，乙腈90% 95%，水10% 5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離方法，其特征在于色譜柱cl8柱，柱溫l(TC 20°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于采用如下步驟進(jìn)行51、 脂肪酸脂化處理取25iU脂肪酸溶液至試管中，氮氣吹干，加入10mg/ml"-溴代苯乙酮的丙酮溶液和 10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25iU ;試管密封，混合均勻，于沸水中加熱約15min，待冷 卻至室溫后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80iil，于沸水中加熱約5min，氮氣吹干，加入甲 醇500iil，振蕩約lmin，在10000r/min條件下離心約10min，取上清液待測；52、 高效液相色譜分離取Sl制得待測液上樣分析，分離色譜條件為色譜柱c18柱，柱溫10°C 20°C ，流動相 流速1. Oml/min 2. Oml/min，檢測波長242士5nm，流動相為如下二種溶液之一 一、 乙腈與CTAB水溶液的混合液，乙腈90% 95% ， CTAB水溶液10% 5% ，所述CTAB 水溶液濃度《10% ;二、 乙腈-水溶液，乙腈90% 95%，水10% 5%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于采用如下步驟進(jìn)行51、 脂肪酸脂化處理取25iU脂肪酸溶液至試管中，氮氣吹干，加入10mg/ml"-溴代苯乙酮的丙酮溶液和 10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各25iU ;試管密封，混合均勻，于沸水中加熱約15min，待冷 卻至室溫后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80iil，于沸水中加熱約5min，氮氣吹干，加入甲 醇500iil，振蕩約lmin，在10000r/min條件下離心約10min，取上清液待測；52、 高效液相色譜分離取S1制得待測液上樣分析，分離色譜條件為色譜柱cl8柱，柱溫l(TC 18tV流動相 流速1. Oml/min 2. Oml/min，檢測波長242士5nm，流動相為如下六種溶液之一 CTAB水溶液=90 : 10，所述CTAB水溶液濃CTAB水溶液二94 : 6，所述CTAB水溶液濃度CTAB水溶液二95 : 5，所述CTAB水溶液濃度 《10% ; 一、 乙腈與CTAB水溶液的混合液，乙腈 度《腦；二、 乙腈與CTAB水溶液的混合液，乙腈 《10% ;三、 乙腈與CTAB水溶液的混合液，乙腈四、 乙腈-水溶液，乙腈水=90 : io;五、 乙腈-水溶液，乙腈水=94 : 6;六、 乙腈-水溶液，乙腈水=95 : 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的分離方法，其特征在于所述CTAB水溶液濃度為5% 。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的分離方法，其特征在于所述柱溫為10°C 17°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述分離色譜條件為柱溫15tV流 動相流速1. 5ml/min，流動相為乙腈:5% CTAB水溶液二 95 : 5。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或5或8任一所述的分離方法的應(yīng)用，其特征在于適用 于如下二種情況之一一、 對樣品中含有亞麻酸、棕櫚油酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸六種脂肪酸中至少 一種的混合脂肪液進(jìn)行分離；二、 對樣品中亞麻酸、棕櫚油酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸六種脂肪酸的同時分離。
10. —種小麥葉片內(nèi)囊體膜脂肪酸分析測定方法，以小麥葉片為植物材料提取得到葉 片內(nèi)囊體膜液，并制得內(nèi)囊體膜脂肪酸溶液，再將內(nèi)囊體膜脂肪酸溶液脂化處理，并利用高 效液相色譜進(jìn)行分析測定，其特征在于所述內(nèi)囊體膜脂肪酸溶液脂化處理的操作為取`200 iU脂肪酸溶液至試管中，氮氣吹干，加入10mg/ml"-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ ml三乙醇胺的丙酮溶液各25iU ;試管密封，混合均勻，于沸水中加熱約15min，待冷卻至 室溫后，加入20mg/ml乙酸的丙酮溶液80 iil ，于沸水中加熱約5min ，氮氣吹干，加入甲醇 500iU，振蕩約lmin，在10000r/min條件下離心約10min，取上清液待測；所述高效液相色 譜分析測定的色譜分析條件為色譜柱C18，柱溫18tV流動相乙腈5% CTAB水溶液二 95 : 5，流速`1. 5ml/min，檢測波長242士5nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用高效液相色譜分離脂肪酸混合物的方法及其應(yīng)用。針對現(xiàn)有技術(shù)中利用HPLC在同時分離化學(xué)、物理性質(zhì)十分相近的亞麻酸、棕櫚油酸、亞油酸等6種脂肪酸混合物時存在的方法單一，以及在洗脫方式與流動相組成選擇等方面的缺陷，本發(fā)明提供一種利用HPLC同時分離亞麻酸、棕櫚油酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸6種脂肪酸混合物的方法。該方法將待測脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液進(jìn)行脂化處理，再進(jìn)行HPLC分離。HPLC采用等度洗脫方式，流動相選用乙腈與CTAB水溶液的混合液或者乙腈-水溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明操作簡單易行、分離效果好、檢測靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠同時分離6種脂肪酸。
文檔編號G01N30/06GK101776666SQ20101010583
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者任正隆, 張勇, 羅培高, 胡學(xué)運, 鄧科君, 陳俊伯 申請人:羅培高;鄧科君;張勇;胡學(xué)運;陳俊伯;任正隆