專利名稱：異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氧化硅納熒光納米粒子及其制備方法，特別是一種異硫氰酸熒光素FITC摻雜的二氧化硅熒光納米粒子及其制備方法。
背景技術(shù)：
直接對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行原位監(jiān)測(cè)，可以真實(shí)地了解活細(xì)胞的生命活動(dòng)，但是傳統(tǒng)的 方法很難實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。熒光納米顆?？芍苯舆M(jìn)入單個(gè)活體細(xì)胞體內(nèi)，基于熒光納米顆粒建 立的納米生物探針可高靈敏、高選擇性地監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的活性物質(zhì)如Ca2+，H+，RNA等。H+離子對(duì)生物體的生命活動(dòng)起著重要的調(diào)控作用，一些生命現(xiàn)象的發(fā)生常伴隨著 細(xì)胞內(nèi)H+離子濃度的變化，因此單細(xì)胞水平上pH的測(cè)量對(duì)生命機(jī)理的解釋以及疾病病變 的預(yù)測(cè)具有非常重要的意義。如果將對(duì)PH敏感的熒光納米顆粒制備成pH探針，可用于單 細(xì)胞中PH的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于二氧化硅良好的水溶性及生物相容性，熒光染料摻雜的二氧化硅核殼熒光納 米粒子用作細(xì)胞分析的探針具有良好的應(yīng)用前景。目前現(xiàn)有技術(shù)采用是將異硫氰酸熒光素FITC直接摻雜合成二氧化硅核殼型納米 粒子，但是此法容易弓I起染料泄露。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種新型的FITC摻雜的二氧化硅熒光納米粒子。本發(fā)明的目的之二在于提供該熒光納米粒子的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的機(jī)理為<formula>formula see original document page 3</formula>
<formula>formula see original document page 3</formula>
<formula>formula see original document page 4</formula>根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子，其特征在于該熒光納米粒子 是異硫氰酸熒光素通過其分子中的活性官能團(tuán)異硫氰基與3-氨基丙基三甲氧基硅烷分子 的氨基發(fā)生加成反應(yīng)形成schiff堿；然后在氨水作用下，該schiff堿與正硅酸乙酯共水解 之后發(fā)生聚合反應(yīng)而形成的核殼型異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子，其結(jié)構(gòu) 式為 <formula>formula see original document page 4</formula>一種制備上述的異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子的方法，其特征在 于該方法的具體步驟為a. FITC 與 APTMS 反應(yīng)制得前驅(qū)體 FITC-APTMS ；b.將環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇按4 1 1 5 1 1的體積比混和形 成混合液，再將該混合液與去離子水按60 1 50 1的體積比混合形成清澈透明的微乳 液；c.將步驟a所得前驅(qū)體FITC-APTMS的水溶液加入上述微乳液中，充分?jǐn)嚢杌靹颍?并控制前驅(qū)體與微乳液的質(zhì)量比為1 8 1 10，充分?jǐn)嚢杌靹?，加入正硅酸乙酯，?與前驅(qū)體的用量體積比為1 10 2 10，然后加入氨水，使其與正硅酸乙酯體積比為3 5 1 5，室溫避光磁力攪拌反應(yīng)24小時(shí)后加入丙酮破乳，再用無水乙醇和超純水交 替離心、洗滌，得到純的FITC_APTMS/Si02核殼型熒光納米粒子，最后將該熒光納米粒子烘
干。本發(fā)明將FITC與APTMS反應(yīng)制成前驅(qū)體FITC-APTMS，采用油包水微乳液法，制得 了一種新的FITC摻雜的二氧化硅核殼納米顆粒簡(jiǎn)稱FAS。由于APTMS與正硅酸乙酯(TEOS) 的共水解與聚合作用，使FITC通過牢固的化學(xué)鍵與二氧化硅外殼相連接，有效地防止了 FITC熒光染料分子的泄露，同時(shí)硅殼的保護(hù)作用，提高了染料的化學(xué)穩(wěn)定性與光穩(wěn)定性。此 夕卜，由于二氧化硅殼層是多孔網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，裸露的質(zhì)子能穿透過去，而且該納米顆粒能被 單個(gè)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞吞噬并對(duì)PH有良好的響應(yīng)，因此可望用做納米pH傳感器件，實(shí)現(xiàn)對(duì)單 個(gè)細(xì)胞的PH實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。


圖1為本發(fā)明的熒光納米粒子和FITC的紫外-可見吸收光譜圖，其中(a)為熒光 納米粒子，(b)為FITC0圖2為本發(fā)明的熒光納米粒子和FITC的熒光光譜，其中(a)為熒光納米粒子，(b) 為 FITC。圖3為本發(fā)明的熒光納米粒子的透射電鏡圖。圖4為本發(fā)明的熒光納米粒子和FITC的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)曲線(a)為FITC，(b)為熒 光納米粒子。圖5為本發(fā)明的熒光納米粒子和FITC的染料泄露曲線，其中實(shí)線為熒光納米粒子 和虛線為FITC硅納米粒子。圖6為本發(fā)明的熒光納米粒子的熒光強(qiáng)度隨PH值變化曲線.圖7為吞噬本發(fā)明的熒光納米粒子的神經(jīng)干細(xì)胞熒光成像圖.圖8為不同pH值本發(fā)明的熒光納米粒子的的熒光光譜。
具體實(shí)施例方式一、儀器與試劑FITC、APTMS、表面活性劑TritonX-100等均為分析純，購于Sigma 公司；小鼠神經(jīng)干細(xì)胞由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；其他試劑均從上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試 劑有限公司購買，均為分析純。所用水均為超純水。FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Olympus公司)；SPM-9600原子力顯微鏡 (日本Shimadzu公司)JSM-2010F型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；F-7000型熒光分 光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)； CR21GII高速離心機(jī)(日本Hitachi公司)；PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。二、FITC-APTMS/Si02核殼型熒光納米粒子的制備及表征FITC與APTMS反應(yīng)制成前驅(qū)體schiff堿FITC-APTMS的方法請(qǐng)參見參考文獻(xiàn) (SantraS,2006)。1.制備反應(yīng)所用的玻璃容器反應(yīng)前用5% HF溶液清洗，再用去離子水清洗，以除 去玻璃容器可能帶來的成核位點(diǎn)。稱取Img FITC，溶于ImL經(jīng)過重蒸的無水乙醇，超聲分散。
然后加入5yL APTMS0在干燥密閉的環(huán)境中避光攪拌反應(yīng)24小時(shí)，制得前驅(qū) 體FITC-APTMS。將環(huán)己烷、Triton X-100、正己醇按4 1 1 5 1 1的體積比加 入燒瓶形成混和溶液，磁力攪拌30min，緩慢滴加去離子水，混合液與去離子水的體積比為 60 1 50 1，攪拌30min使之混勻，形成清澈透明的微乳液。將前驅(qū)體FITC-APTMS加 入上述微乳液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，并控制前?qū)體FITC-APTMS與微乳液的質(zhì)量比為1 8 1 10，充分?jǐn)嚢杌靹颍尤胝杷嵋阴?，其與前驅(qū)體的用量體積比為1 10 2 10，然 后加入氨水，使其與正硅酸乙酯體積比為3 5 1 5，室溫避光磁力攪拌反應(yīng)24h后加 入少量丙酮破乳，再用無水乙醇和超純水交替離心、洗滌數(shù)次，洗掉殘留的表面活性劑和染 料分子等，得到純的FITC_APTMS/Si02核殼型熒光納米粒子(簡(jiǎn)稱FAS)，最后將納米粒子在 真空中80°C烘干。2. FAS納米粒子的光譜表征將ImgFITC和Img FAS納米粒子分別溶于2mL超純水中，分別測(cè)量紫外-可見光譜及熒光光譜如圖1及圖2所示。由圖1可知，F(xiàn)AS納米粒子 與FITC的最大吸收波長(zhǎng)分別為498nm，492nm。與單純的FITC相比，F(xiàn)AS納米粒子的吸收峰 明顯變窄，峰值位置稍有移動(dòng)，這可能是由于FITC被限域在SiO2空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中以及FITC 分子與SiO2空間網(wǎng)絡(luò)的硅羥基相互作用引起的。圖2顯示FAS納米粒子與FITC在激發(fā)波 長(zhǎng)為492nm時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為518nm和515nm。FAS納米粒子發(fā)射峰的位置較FITC 略有紅移，原因可能是由于二氧化硅基質(zhì)與染料相互作用引起能量的損失，從而導(dǎo)致熒光 發(fā)射峰的紅移。3. FAS納米粒子的TEM表征將所得的FAS納米顆粒充分分散到乙醇相中，用移液 器吸取少許滴加到銅網(wǎng)上，常溫放置自然干燥后用透射電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行掃描，觀察其 形貌，結(jié)果如圖3所示。由圖3可看出所制備的FAS納米粒子呈規(guī)則球型，大小比較均勻且 分散性好，平均粒徑約為150 士 15nm。三、FAS納米粒子的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將Img的FITC和Img的FAS納米粒子分別溶于pH值7. 8的0. 05mol/LTris_HCl 緩沖溶液中，以100W的氤燈作為激發(fā)光源分別對(duì)兩種溶液進(jìn)行照射，樣品距氙燈的距離為 5cm，每隔10分鐘測(cè)量一次最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，共測(cè)試70分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，發(fā)現(xiàn)氙燈照射70min后，F(xiàn)ITC水溶液的熒光強(qiáng)度下降達(dá)52%，而FAS納米粒子的熒光 強(qiáng)度下降小于5%，表明FAS納米粒子具有良好的光穩(wěn)定性。由此可見，將FITC用二氧化硅 包覆形成納米粒子后，由于二氧化硅殼層的保護(hù)作用，有效地減少外界光源對(duì)熒光分子的 光漂白作用，使其抗光穩(wěn)定性顯著提高。四、FAS納米粒子的染料泄漏實(shí)驗(yàn)將純化的FAS納米復(fù)合物及FITC直接摻雜的Si02納米粒子分別溶于超純水中， 超聲，每隔一小時(shí)取出ImL溶液，離心，棄去上清液，加入ImL水，超聲分散后用F-2500型熒 光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)492nm下檢測(cè)納米顆粒懸浮液的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度的變化 確定有機(jī)熒光染料泄露的程度。兩種納米粒子的染料泄露實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，由圖看出， FAS納米復(fù)合物的熒光強(qiáng)度在6小時(shí)內(nèi)基本保持不變，6小時(shí)后下降不到8%，而FITC直接 摻雜的二氧化硅納米粒子的熒光強(qiáng)度則下降超過40%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AS納米粒子在溶 液中不易發(fā)生染料泄露。原因是由于FITC與APTMS形成前驅(qū)體FITC-APTMS后，由于APTMS 與正硅酸乙酯(TEOS)的共水解作用，使FITC通過牢固的化學(xué)鍵與二氧化硅外殼相連接，有效地防止了 FITC熒光染料分子的泄露。五、FAS納米粒子對(duì)pH的響應(yīng)將FAS納米顆粒經(jīng)超聲分散后，分別取300 μ L lmg/mL納米顆粒懸浮液加入到ImL不同PH值的磷酸緩沖溶液中，充分混勻后分別測(cè)量其在最大激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜及熒 光強(qiáng)度隨PH值的變化情況。實(shí)驗(yàn)測(cè)得FAS納米粒子的熒光光譜隨pH值變化如圖7所示 (圖6中的1，2，3，4，5，6，7分別與插圖中的？!1值由低到高一一對(duì)應(yīng))。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)pH值范圍3. 6 9. 7內(nèi)，F(xiàn)AS納米粒子對(duì)pH有良好的響應(yīng)，隨著pH值的增加，熒光強(qiáng) 度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)PH從3. 6變至9. 7時(shí)熒光強(qiáng)度增加了大約30倍，且在pH值6. 0 9. 0之 間呈良好的線性關(guān)系。從圖中還可看出隨著PH值的增加，熒光強(qiáng)度增加，但發(fā)射波長(zhǎng)沒有 發(fā)生變化。六、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的熒光成像與pH檢測(cè)將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞懸浮液接種到培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(5% CO2, 370C )。然后用 0. 01mol/L PBS (pH7. 4)洗三次。將 100 μ L lmg/mL 經(jīng)高溫消毒的 FAS 熒光納米顆粒懸浮液加入到含Iml培養(yǎng)液的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培 養(yǎng)箱中培育30min(5% CO2, 37°C )，PBS洗滌3次，最后在FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡下 觀察細(xì)胞的熒光成像。通過改變細(xì)胞培養(yǎng)液的PH值，調(diào)節(jié)細(xì)胞的pH值，分別測(cè)量在不同 PH值時(shí)細(xì)胞的熒光光譜與熒光顯微成像。圖7為FAS納米粒子與小鼠神經(jīng)干細(xì)胞共培育 30min后的激光共聚焦掃描顯微鏡圖片，可看到在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到較強(qiáng)熒光信號(hào)，且pH7. 8的 細(xì)胞熒光信號(hào)高于PH6. 6的細(xì)胞。圖8為它們的熒光光譜圖。這表明FAS納米顆?？杀恍?鼠神經(jīng)干細(xì)胞有效攝入，且在活細(xì)胞體內(nèi)保持較強(qiáng)的熒光信號(hào)，隨PH值的不同，熒光強(qiáng)度 不同。由此可知，將FAS納米粒子與細(xì)胞共培育后，通過細(xì)胞成像測(cè)量其熒光強(qiáng)度可檢測(cè)細(xì) 胞內(nèi)的PH值。
權(quán)利要求
一種異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子，其特征在于該熒光納米粒子是異硫氰酸熒光素通過其分子中的活性官能團(tuán)異硫氰基與3-氨基丙基三甲氧基硅烷分子的氨基發(fā)生加成反應(yīng)形成schiff堿；然后在氨水作用下，該schiff堿與正硅酸乙酯共水解之后發(fā)生聚合反應(yīng)而形成的核殼型納米納米粒子，其結(jié)構(gòu)式為FSA00000053514400011.tif
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅熒光納米粒子的 方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.FITC與APTMS反應(yīng)制得前驅(qū)體FITC-APTMS ；b.將環(huán)己烷、TritonX-100、正己醇按4 1 1 5 1 1的體積比混和形成混合 液，再將該混合液與去離子水按60 1 50 1的體積比混合形成清澈透明的微乳液；c.將步驟a所得前驅(qū)體FITC-APTMS加入上述微乳液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，并控制前?qū)體 與微乳液的質(zhì)量比為1 8 1 10，充分?jǐn)嚢杌靹?，加入正硅酸乙酯，其與前驅(qū)體的用量 體積比為1 10 2 10，然后加入氨水，其與正硅酸乙酯體積比為3 5 1 5，室溫 避光磁力攪拌反應(yīng)24小時(shí)后加入丙酮破乳，再用無水乙醇和超純水交替離心、洗滌，得到 純的FITC_APTMS/Si02核殼型熒光納米粒子，最后將該熒光納米粒子烘干。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種二氧化硅納熒光納米粒子及其制備方法，特別是一種FITC摻雜的二氧化硅熒光納米粒子及其制備方法。該方法具體包括前驅(qū)體溶液的制備等步驟。本發(fā)明以異硫氰酸熒光素與3-氨基丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)制成前驅(qū)體，然后采用油包水微乳液法，制得了一種新的FITC摻雜的二氧化硅核殼納米顆粒。所制備的納米顆粒呈規(guī)則球形，具有良好的單分散性與光穩(wěn)定性，不易發(fā)生染料泄漏。這種納米顆粒對(duì)pH具有良好的響應(yīng)可應(yīng)用于細(xì)胞的pH實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101805603SQ20101012649
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者劉斌虎, 吳明紅, 尹東光, 張禮, 李劍, 謝春娟 申請(qǐng)人:上海大學(xué)