專利名稱：一種心肌肌鈣蛋白i的檢測(cè)試劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種心肌肌鈣蛋白I (TROPONIN I)的檢測(cè)試劑及其制備方法和用途， 屬于生物醫(yī)藥檢測(cè)試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病是威脅人類生命健康的第一重大疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)， 全球每年有1670萬(wàn)人死于各類心腦血管疾病，這一數(shù)字占所有疾病死亡的四.2%，其中有一半以上死于急性心肌梗死。在我國(guó)，近10年來(lái)，我國(guó)急性心肌梗死的發(fā)病率明顯上升，已接近國(guó)際平均水平。冠心病發(fā)病率占總?cè)丝诘?%。左右，實(shí)際的冠心病患者人數(shù)達(dá)780萬(wàn)人。而且由于缺乏冠心病的防治常識(shí)，很多患者就診時(shí)已到晚期，以急性心肌梗死(AMI)為首發(fā)癥狀。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)是臨床癥狀如胸痛，心電圖異常以及血清心肌生化標(biāo)志物異常。但是在AMI初期，約25%病人沒(méi)有典型的臨床癥狀，約一半的病人心電圖沒(méi)有典型異常變化，因此檢測(cè)AMI初期病人心臟損傷時(shí)的血液樣品中生化標(biāo)志物異常在AMI臨床診斷中具有重要參考意義。在我國(guó)各級(jí)醫(yī)院中，在化驗(yàn)室中檢測(cè)的主要生化標(biāo)志物包括肌鈣蛋白 Troponin-I (TNI)，Troponin-T (TNT)，肌紅蛋白 Myoglobin 和肌酸磷酸激酶 CK-MB。其中 CK-MB大量存在于心肌中，一般在AMI發(fā)病4-8小時(shí)升高，12-20小時(shí)達(dá)到高峰，七十年代初以來(lái)被公認(rèn)為是檢測(cè)AMI的"金標(biāo)準(zhǔn)"。但是CK-MB特異性較差，馬拉松賽跑、骨骼肌損傷、 腎衰者CK-MB含量均可異常增高。CK-MB在血液中存在的時(shí)間也較短(1-4天)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，心肌肌鈣蛋白I(CTnI)已被證實(shí)為心肌損傷最特異，最敏感的血清標(biāo)志物之一。正常人血液中CTnI的含量一般低于0. ^g/ml，在AMI發(fā)生后，CTnI可在6_8小時(shí)內(nèi)快速升高，在18-24小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值，并在10-15天內(nèi)都維持較高濃度。對(duì)CTnI的臨床快速檢測(cè)具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益?，F(xiàn)有的CTnI檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA，化學(xué)發(fā)光法和免疫熒光法。 ELISA的最低檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0. 2ng/mL，測(cè)定周期長(zhǎng)，達(dá)5-6小時(shí)?；瘜W(xué)發(fā)光法是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)的微量抗原或抗體的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，其靈敏度高達(dá) 0.03ng/mL，檢測(cè)時(shí)間也較短，約1_2小時(shí)，但需要采用專用大型設(shè)備，操作復(fù)雜。免疫熒光法采用夾心和酶聯(lián)熒光相結(jié)合的方法，檢測(cè)時(shí)間較快，最高靈敏度可達(dá)到0. Ing/mL，也需要專門儀器。這些檢測(cè)方法都需要昂貴儀器和專業(yè)人員操作，只適用于在中心實(shí)驗(yàn)室使用，檢測(cè)結(jié)果到達(dá)醫(yī)生手中的時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足臨床快速檢測(cè)需要，也不適合于中小醫(yī)院尤其是沒(méi)有中心實(shí)驗(yàn)室的鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的快速檢測(cè)CTnI的試劑盒主要采用傳統(tǒng)膠體金免疫層析法制備。其基本原理是采用膠體金標(biāo)記單株或多株抗CTnI的單克隆抗體，采用雙抗免疫夾心來(lái)檢測(cè) CTnI，中國(guó)專利200710022815. χ, 200810036418. 2已有報(bào)導(dǎo)。市場(chǎng)上所有的基于CTnI快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度一般在2-lOng/ml范圍內(nèi)。
膠體金即指金微粒的懸浮液，其直徑在1 lOOnm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。傳統(tǒng)膠體金的合成過(guò)程，其對(duì)單克隆抗體的標(biāo)記，固相免疫層析試紙條的制備均有報(bào)導(dǎo)。在二十世紀(jì)八十年代，膠體金首先被應(yīng)用于蛋白分子的標(biāo)記和體外檢測(cè)領(lǐng)域。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合， 這種結(jié)合是靜電結(jié)合，雖然不影響蛋白質(zhì)的生物特性，也比較穩(wěn)定，但是這種結(jié)合受溶液離子強(qiáng)度，PH影響很大，尤其是在高離子強(qiáng)度溶液中，膠體金發(fā)生凝聚，用納米金標(biāo)記的生物分子也隨時(shí)間變化變得不穩(wěn)定，影響了膠體金對(duì)很多生物分子的標(biāo)記以及在生物樣品中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑及其制備方法和用途，其特點(diǎn)是合成新型納米微粒，納米微粒表面功能化，以及納米微粒對(duì)抗體的標(biāo)記方法。它還包含試劑條，試劑條上含有抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體以及改性納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗。本發(fā)明的目的由下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外，均為重量份數(shù)。心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑及其制備方法心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑有機(jī)硅包裹納米金微粒的粒徑為10-150nm，優(yōu)選為50 lOOnm，最優(yōu)選為55 75nm，納米硅涂層厚為5-lOOnm，所述有機(jī)硅涂層表面引入胺基、羧基、羥基、氫硫基、環(huán)丙烷基和醛基功能基團(tuán)，功能化的有機(jī)硅表面通過(guò)化學(xué)與生物分子如蛋白質(zhì)、抗體進(jìn)行標(biāo)記，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接，并保持被標(biāo)記分子的生物活性。心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)試劑的制備方法包括以下步驟1.傳統(tǒng)的膠體金的制備將濃度為0. 01 4%氯金酸溶液100份加熱，在100 400rpm攪拌下煮沸10 120分鐘，快速加入濃度為2N氨水溶液0. 1 5份和濃度為1 %的檸檬酸鈉2 10份，高速攪拌至溶液呈現(xiàn)橙紅色，冷卻后高速離心純化，獲得微粒徑在10 200nm的膠體金微粒， 并將制得的膠體金分裝保存；2.有機(jī)硅包裹的納米金微粒的制備將上述制得的膠體金溶液100份，加入0. 1 2份三胺基丙基三乙氧基硅烷，在 100 400rpm攪拌15 120分鐘，加入200 500份溶劑，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至堿性，加入0. 1 2份四乙基硅烷混合物，在室溫下繼續(xù)攪拌18- 小時(shí)，對(duì)產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm 高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹的納米金微粒；3.有機(jī)硅包裹納米金的表面功能化將上述制得的膠體金100份加入200 500份溶劑，在100 400rpm攪拌15 120分鐘，用氨水調(diào)節(jié)pH值至堿性，加入0.1 2份1 1的四乙基硅烷和含有機(jī)功能基團(tuán)的混合溶液，在室溫下繼續(xù)攪拌18 M小時(shí)，產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)包裹納米金表面功能化改性的納米微粒；
4.有機(jī)硅包裹的納米金對(duì)心肌鈣蛋白I單克隆抗體的標(biāo)記采用表面羧基化有機(jī)硅包裹納米金通過(guò)乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺 (EDC)活化其表面羧基并與心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體Fc的胺基反應(yīng)，形成化學(xué)性能穩(wěn)定的酰胺結(jié)構(gòu)，這種穩(wěn)定的化學(xué)鍵不受溶液的離子強(qiáng)度，酸堿性影響，從而增加了標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的化學(xué)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。將標(biāo)記好的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體噴涂在玻璃纖維墊片上，形成金標(biāo)墊。5.試劑盒的制備將一株CTnI的單克隆抗體作為檢測(cè)抗體配制濃度為1. 5mg/ml的抗體磷酸緩沖溶液，加入2%海藻糖1 20份，噴印到活化的硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線；將CTnI的單克隆抗體的二抗如羊抗鼠IgG噴印到硝酸纖維素膜上形成質(zhì)量控制線；將硝酸纖維素膜干燥 2-10小時(shí)，制備檢測(cè)CTnI的硝酸纖維素膜。將金標(biāo)墊，樣品墊，硝酸纖維素膜和吸水墊粘貼在塑料板上，把塑料板切割成5mm寬度檢測(cè)CTnI試紙條，再將CTnI檢測(cè)試紙條裝入塑料盒，制成檢測(cè)CTnI的試劑盒。6.心肌肌鈣蛋白I的快速檢測(cè)方法將全血/血清樣品加入試劑盒上的樣品孔，滲透到樣品墊上，樣品中CTnI與有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記的CTnI的單克隆檢測(cè)抗體相遇結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物繼續(xù)順硝酸纖維素膜滲透到檢測(cè)線與固定在檢測(cè)線上的CTnI單克隆捕捉抗體形成夾心雙抗體的復(fù)合結(jié)合，在檢測(cè)線上顯示納米金的紅色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；多余納米金標(biāo)記的CTnI單克隆檢測(cè)抗體在滲析到質(zhì)量控制線時(shí)，與固定在質(zhì)量控制線上的二抗形成夾心結(jié)合，使質(zhì)控線也顯示紅色，表明樣品在硝酸纖維素膜上的滲析完全，該檢測(cè)結(jié)果有效。如果樣品中CTnI含量低于檢測(cè)靈敏度，納米金標(biāo)記的CTnI單克隆檢測(cè)抗體不能與檢測(cè)線上固定的捕捉抗體形成有效夾心復(fù)合結(jié)合，檢測(cè)線不會(huì)顯示紅色，檢測(cè)結(jié)果為陰性，但是納米金標(biāo)記的CTnI單克隆檢測(cè)抗體仍然能與固定在質(zhì)控線上的單克隆二抗形成夾心結(jié)合，在質(zhì)控線上顯示紅色，表明檢測(cè)結(jié)果有效。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。有機(jī)功能基團(tuán)為胺基、羧基、氫硫基、羥基、環(huán)丙烷基或醛基功能基團(tuán)中的任一種。溶劑為乙醇、異丙醇、甲醇、正丁醇中的任一種。有機(jī)包裹納米金表面功能化改性的納米金微粒通過(guò)化學(xué)與生物分子進(jìn)行標(biāo)記形成穩(wěn)定的共價(jià)健連接。檢測(cè)試劑用于臨床快速檢測(cè)心肌梗塞病人血液中的心肌肌鈣蛋白I的含量。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明采用有機(jī)硅對(duì)傳統(tǒng)的納米金微粒進(jìn)行包裹，在其表面形成納米厚度的硅涂層，對(duì)硅涂層表面進(jìn)行化學(xué)改性，引入羧基，胺基，羥基，氫硫基，環(huán)丙烷基和醛基功能基團(tuán)。有機(jī)硅改性的納米金較傳統(tǒng)的膠體金具有更好的穩(wěn)定性，不容易發(fā)生金顆粒的凝聚。硅表面引入的化學(xué)功能基團(tuán)與生物分子如蛋白，抗體，抗原形成穩(wěn)定化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合，制備更加穩(wěn)定的納米金標(biāo)記物。這種改性的納米金可以取代傳統(tǒng)膠體金用于免疫學(xué)領(lǐng)域，制備免疫試劑。2、利用該納米金對(duì)生物蛋白，抗體進(jìn)行標(biāo)記，在生物分子和納米金微粒間形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，提高了被標(biāo)記分子的化學(xué)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。3、表面硅涂層可以提高納米材料的表面反射光強(qiáng)度，從而提高該材料的肉眼分辨率，提高了免疫試劑的靈敏度，可達(dá)到0. 4ng/mL04、利用該有機(jī)硅包裹的納米金對(duì)心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體標(biāo)記并通過(guò)免疫層析法制備檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑盒，大大提高了心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)速度。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例11 有機(jī)硅包裹納米金顆粒的制備及表面胺基化納米金顆粒溶液的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金微粒溶液，膠體金的微粒大小控制在10-150nm。將濃度為1 %的氯金酸去離子水溶液100份，高速攪拌并煮沸10 分鐘?？焖偌尤霛舛葹?N的氫胺溶液0. 1份和濃度為1 %的檸檬酸鈉2份，高速攪拌，溶液呈現(xiàn)橙紅色，冷卻后高速離心純化得到微粒的粒徑為55-75nm的膠體金微粒，得到的膠體金保存一段時(shí)間然后對(duì)膠體金表面進(jìn)行有機(jī)硅包裹并胺基化改性，取得到的膠體金溶液 100份，加入300份乙醇，在100 400rpm攪拌15分鐘，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至堿性，加入 1份1 1混合的四乙基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷混合溶液，在室溫下繼續(xù)攪拌 18-24小時(shí)，產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹表面胺基化的新型納米金微粒。2表面胺基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體在100份上述描述的方法制備的有機(jī)硅包裹表面胺基化的納米金溶液中，加入10 份交聯(lián)劑和100微克抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，然后加入濃度為10% 牛血清白蛋白的磷酸緩沖液0. 1份，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。高速離心純化后得到表面胺基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。3心肌肌鈣蛋白I試劑盒的制備將上述制備的改性納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I的單抗噴涂到玻璃纖維紙片上制備免疫改性納米金紙片。用噴點(diǎn)儀器將心肌肌鈣蛋白I的單克隆捕捉抗體和二抗 IgGd. 5mg/mL)噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在溫度37°C干燥2小時(shí)，獲得到免疫硝酸纖維素膜片條，將吸水紙粘貼于免疫硝酸纖維素膜片條上，并切割成5mm寬試紙條，將切割的試紙條，金標(biāo)紙和樣品墊，過(guò)濾墊組裝在樣品盒中，制成心肌肌鈣蛋白I的試齊U盒。實(shí)施例21有機(jī)硅包裹納米金顆粒的制備及表面羧基化按實(shí)施例1所描述的方法制備粒徑為55-75nm的膠體金微粒，取上述制得膠體金溶液100份，加入250份乙醇，在100 400rpm攪拌65分鐘，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至堿性， 加入1份四乙基硅烷，反應(yīng)2小時(shí)，再加入1份馬來(lái)酰胺酸丙基三乙氧基硅烷，在室溫下繼續(xù)攪拌18- 小時(shí)，產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹表面羧基化的新型納米金微粒。2表面羧基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體
在100份上述描述的方法制備的有機(jī)硅包裹表面羧基化的納米金溶液中，加入5 份1 1混合的濃度為20mmol 1_乙基_3_ (3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和濃度為20mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)混合溶液，在室溫下反應(yīng)45分鐘，加入50微克抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，然后加入濃度為10%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液 0. 1份，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。高速離心純化后得到表面羧基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。3心肌肌鈣蛋白I試劑盒的制備將上述制備的改性納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I的單抗噴涂到玻璃纖維紙片上制備免疫改性納米金紙片。用噴點(diǎn)儀器將心肌肌鈣蛋白I的單克隆捕捉抗體和二抗 IgGd. 5mg/mL)噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在溫度37°C干燥2小時(shí)，獲得到免疫硝酸纖維素膜片條，將吸水紙粘貼于免疫硝酸纖維素膜片條上，并切割成5mm寬試紙條，將切割的試紙條，金標(biāo)紙和樣品墊，過(guò)濾墊組裝在樣品盒中，制成心肌肌鈣蛋白I的試齊U盒。實(shí)施例31 有機(jī)硅包裹納米金顆粒的制備及表面氫硫基化按實(shí)施例1所描述的方法制備粒徑為55-75nm的膠體金微粒，取上述制得的膠體金溶液100份，加入200份異丙醇，在100 400rpm攪拌120分鐘，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至堿性，加入份0. 1份1 1混合的四乙基硅烷和3-硫基丙基三乙氧基硅烷混合溶液，在室溫下繼續(xù)攪拌18- 小時(shí)。產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹表面氫硫基化的新型納米金微粒。2表面氫硫基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體將100微克心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的磷酸緩沖液中加入5微克活化劑，室溫下反應(yīng)20分鐘，用凝膠色譜柱純化反應(yīng)物，得到活化的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體溶液。 將活化的單克隆抗體中加入1份實(shí)施例3中描述的有機(jī)硅包裹的納米金溶液，室溫下反應(yīng) 1小時(shí)，加入濃度為5%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液0. 1份，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，高速離心純化后得到表面氫硫基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，標(biāo)記的抗體與硅包裹納米金之間形成穩(wěn)定的化學(xué)共價(jià)鍵連接，增加了標(biāo)記抗體的化學(xué)穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。3心肌肌鈣蛋白I試劑盒的制備將上述制備的改性納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I的單抗噴涂到玻璃纖維紙片上制備免疫改性納米金紙片。用噴點(diǎn)儀器將心肌肌鈣蛋白I的單克隆捕捉抗體和二抗 IgGd. 5mg/mL)噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在溫度37°C干燥2小時(shí)，獲得到免疫硝酸纖維素膜片條，將吸水紙粘貼于免疫硝酸纖維素膜片條上，并切割成5mm寬試紙條，將切割的試紙條，金標(biāo)紙和樣品墊，過(guò)濾墊組裝在樣品盒中，制成心肌肌鈣蛋白I的試齊U盒。實(shí)施例41 有機(jī)硅包裹納米金顆粒的制備及表面環(huán)丙烷基化按實(shí)施例1所描述的方法制備粒徑為55-75nm的膠體金微粒，取上述制得膠體金溶液100份，加入250份乙醇，在100 400rpm攪拌75分鐘，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至堿性，加入1份四乙基硅烷，反應(yīng)2小時(shí)，再加入1份(3-環(huán)氧丙氧基丙基)二甲基乙氧基硅烷， 在室溫下繼續(xù)攪拌18- 小時(shí)，產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹表面環(huán)丙烷基化的新型納米金微粒。2表面環(huán)丙烷基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體在100份上述描述的方法制備的有機(jī)硅包裹表面丙烷基的納米金溶液中，加入50 微克抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體在38°c繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，然后加入濃度為10%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液0. 1份，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。高速離心純化后得到表面環(huán)丙烷基化有機(jī)硅包裹納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。3心肌肌鈣蛋白I試劑盒的制備將上述制備的改性納米金標(biāo)記的抗心肌肌鈣蛋白I的單抗噴涂到玻璃纖維紙片上制備免疫改性納米金紙片。用噴點(diǎn)儀器將心肌肌鈣蛋白I的單克隆捕捉抗體和二抗 IgGd. 5mg/mL)噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線上，在溫度37°C干燥2小時(shí)，獲得到免疫硝酸纖維素膜片條，將吸水紙粘貼于免疫硝酸纖維素膜片條上，并切割成5mm寬試紙條，將切割的試紙條，金標(biāo)紙和樣品墊，過(guò)濾墊組裝在樣品盒中，制成心肌肌鈣蛋白I的試齊U盒。
權(quán)利要求
1.一種心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑，其特征在于該檢測(cè)試劑含有有機(jī)硅包裹的納米金微粒的粒徑為10 150nm，納米硅涂層為5 lOOnm，所述的有機(jī)硅涂層表面引入胺基、羧基、羥基、氫硫基、環(huán)丙烷基和醛基功能基團(tuán)，功能化的有機(jī)硅表面通過(guò)化學(xué)與生物分子如蛋白質(zhì)、抗體進(jìn)行標(biāo)記，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接，并保持被標(biāo)記分子的生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑，其特征在于有機(jī)硅包裹的納米金微粒的粒徑為50 lOOnm。
3.如權(quán)利要求1所述心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑，其特征在于有機(jī)硅包裹的納米金微粒的粒徑為55-75nm。
4.如權(quán)利要求1 3之一所述心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)傳統(tǒng)的膠體金的制備將濃度為0. 01 4%氯金酸溶液100重量份加熱，在100 400rpm攪拌下煮沸10 120分鐘，快速加入濃度為2N氨水溶液0. 1 5重量份和濃度為1 %的檸檬酸鈉2 10重量份，高速攪拌至溶液呈現(xiàn)橙紅色，冷卻后高速離心純化，獲得微粒徑在10 150nm的膠體金微粒，并將制得的膠體金分裝保存；(2)有機(jī)硅包裹的納米金微粒的制備將上述制得的膠體金溶液100重量份，加入0. 1 2重量份三胺基丙基三乙氧基硅烷， 在100 400rpm攪拌15 120分鐘，加入200 500重量份溶劑，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值至堿性，加入0. 1 2重量份四乙基硅烷混合物，在室溫下繼續(xù)攪拌18-M小時(shí)，對(duì)產(chǎn)物在 2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹的納米金微粒；(3)有機(jī)硅包裹納米金的表面功能化將上述制得的膠體金100重量份加入200 500重量份溶劑，在100 400rpm攪拌 15 120分鐘，用氨水調(diào)節(jié)pH值至堿性，加入0.1 2重量份1 1的四乙基硅烷和含功能基團(tuán)的混合溶液，在室溫下繼續(xù)攪拌18 M小時(shí)，對(duì)產(chǎn)物在2000 IOOOOrpm高速離心純化，獲得有機(jī)硅包裹納米金表面功能化改性的納米微粒；(4)心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑的制備采用雙抗免疫夾心法將上述制得的納米微粒標(biāo)記的心肌肌鈣蛋白I單克隆檢測(cè)抗體噴點(diǎn)于樣品墊上，另一心肌肌鈣蛋白I捕捉抗體和單克隆捕捉抗體的二抗噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜形成制備抗心肌肌鈣蛋白I的快速檢測(cè)試劑紙條，再將該檢測(cè)試劑紙條制成試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于含有機(jī)功能基團(tuán)為胺基、羧基、氫硫基、羥基、環(huán)丙烷基或醛基功能基團(tuán)中的任一種。
6.如權(quán)利要求4所述心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于溶劑為乙醇、 異丙醇、甲醇、正丁醇的任一種。
7.如權(quán)利要求4所述心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于有機(jī)聚合物包裹納米金表面功能化改性的納米金微粒通過(guò)化學(xué)與生物分子進(jìn)行標(biāo)記形成穩(wěn)定的共價(jià)健連接。
8.如權(quán)利要求1所述心肌肌鈣蛋白I檢測(cè)試劑的用途，其特征在于該檢測(cè)試劑用于臨床快速檢測(cè)心肌梗塞病人血液中的心肌肌鈣蛋白I的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑及其制備方法和用途，其特點(diǎn)是該檢測(cè)試劑為有機(jī)硅包裹的納米金微粒，微粒的粒徑為10～150nm，納米硅涂層為5～100nm，所述的有機(jī)硅涂層表面引入胺基、羧基、羥基、氫硫基、環(huán)丙烷基和醛基功能基團(tuán)，功能化的有機(jī)硅表面通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與生物分子如蛋白質(zhì)、抗體進(jìn)行標(biāo)記，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接，并保持被標(biāo)記分子的生物活性；這種改性的納米金可以取代傳統(tǒng)膠體金用于免疫學(xué)領(lǐng)域，制備免疫試劑；用這種改性的納米膠體可以制備心肌肌鈣蛋白I的檢測(cè)試劑。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102192986SQ20101012788
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者胡衛(wèi)紅 申請(qǐng)人:胡衛(wèi)紅