專利名稱：一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電化學(xué)酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及一種基于電化學(xué)酶聯(lián)免疫測(cè) 試技術(shù)的牙根吸收早期診斷的一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法及其裝置。
背景技術(shù)：
大多數(shù)患者在正畸過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)輕度牙根吸收，矯治結(jié)束后不會(huì)出現(xiàn)牙齒松 動(dòng)。但是少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的牙根吸收，牙齒會(huì)出現(xiàn)松動(dòng)甚至脫落；正畸牙根吸收是正 畸治療的主要并發(fā)癥。如果能夠及早診斷出牙根吸收，可以防止患者牙齒松動(dòng)加重或脫落。 目前主要使用曲面斷層、根尖片、CT等影像學(xué)方法診斷牙根吸收，迫切需要尋找一種更為敏 感、安全、及時(shí)的新方法實(shí)現(xiàn)對(duì)牙根吸收的早期診斷、早期預(yù)防。無(wú)創(chuàng)性生化方法是近年來(lái) 牙根吸收診斷方法的新方向。主要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)是牙根吸收患者口腔齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白 抗原的量會(huì)增加，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)測(cè)定其中牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)含量變化可 間接診斷牙根吸收。與傳統(tǒng)的影像學(xué)方法相比，ELISA法具有敏感性高、輻射損傷性小、可 以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。目前主要使用的 分光光度酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白含量變化，該方法原理簡(jiǎn)單，儀器價(jià)格便宜，可以目 測(cè)得到結(jié)果，并且儀器的自動(dòng)化程度高，是一種成熟的檢測(cè)手段。但是，由于齦溝液樣品量 少，待測(cè)液中的有效成分更是希罕，很難保證酶聯(lián)板的均一性和透光性，使用分光光度法限 制了測(cè)定的精密度和檢測(cè)限，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，目前尚沒(méi)有解決上述問(wèn)題的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)傳統(tǒng)分光光度酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)限低、精度差，無(wú)法滿足牙 本質(zhì)磷蛋白的精確檢測(cè)要求而提供一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法及其裝置。其特征在于所 述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法是基于電化學(xué)酶聯(lián)免疫的測(cè)定法；包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取 及純化和電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的含量?jī)蓚€(gè)步驟；1)牙本質(zhì)磷蛋白的提取和純化采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙 本質(zhì)磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純?nèi)忧?，首先清潔口腔牙面并吹干，將?潮試紙尖端緊貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封管 作待測(cè)樣品，并于-70°C保存；待測(cè)樣品提純是在待測(cè)樣品中加入20μ 1蛋白提取液，冰浴 20 30分鐘，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，提取20 μ 1上清液，加入等量蛋白 上樣液，煮沸并冷卻，于-20°C保存待測(cè)；2)電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白含量a.基于“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測(cè)法相結(jié)合精確測(cè)定牙本質(zhì) 磷蛋白的精確含量；酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程為將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體吸附到以聚苯乙烯容器 作為固相載體上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的抗原樣品， 使之與吸附于固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體反應(yīng)，孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品； 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的抗原反應(yīng)，形成所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與雙抗體夾心抗原之間形成等量關(guān)系；最后加入主 要成分包括鄰氨基酚和過(guò)氧化氫的底物，在酶催化下，底物鄰氨基酚和過(guò)氧化氫反應(yīng)生成 可進(jìn)行電化學(xué)方法精確測(cè)定的產(chǎn)物氨基吩噁嗪；b. “電化學(xué)”測(cè)試法為主要成分包括鄰氨基酚和過(guò)氧化氫的底物溶液在辣根過(guò)氧 化物酶催化下，過(guò)氧化氫將鄰氨基酚氧化生成產(chǎn)物氨基吩噁嗪，氨基吩噁嗪在汞電極上發(fā) 生還原反應(yīng)，其反應(yīng)電流的大小與氨基吩噁嗪的量呈正比定量關(guān)系，進(jìn)而與辣根過(guò)氧化物 酶的量在0. 01 X 10-9-4X 10_9g/ml濃度范圍內(nèi)呈I = 22. 6-5. 51og2X關(guān)系，式中I為反應(yīng)電 流的大小，單位為微安μ A，X為辣根過(guò)氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ml，則通過(guò) 測(cè)定上述反應(yīng)電流的大小，測(cè)定氨基吩噁嗪的量，進(jìn)而測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶的量，進(jìn)而測(cè)定 待測(cè)樣品中牙本質(zhì)磷蛋白的量。所述孵育后洗滌除去未吸附的抗體是用包被緩沖液將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體 (如CSB-P10111Rb-h，武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品)稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10 μ g/ ml，優(yōu)選5μ g/ml。在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C過(guò)夜，以使抗體與固相載體充分吸附。次 日，棄去容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的抗體；其中包 被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與2. 93g碳酸氫鈉 NaHCO3溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml配制而成。所述孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀 釋液，稀釋的待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白抗原樣品，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì) 磷蛋白抗體與待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白抗原充分結(jié)合。用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待 測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白抗原樣品中的未反應(yīng)的樣品；其中牛血清蛋白稀釋液是由0. Ig牛血清蛋 白溶解于IOOOml蒸餾水中稀釋配制而成。所述形成所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋 白稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記牙本質(zhì)磷蛋白抗體，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本 質(zhì)磷蛋白抗體16與牙本質(zhì)磷蛋白抗原15充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌 緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去其他成分。一種基于電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的裝置。該裝置 包括了電解池1、檢測(cè)儀表3和儲(chǔ)汞瓶9串聯(lián)構(gòu)成，外加電源2與檢測(cè)儀表3連接；所述電解池為以聚苯乙烯容器作為固相載體7內(nèi)裝入待測(cè)溶液6，工作電極4在待 測(cè)溶液6液面以下、參比電極5為具有恒定電位的飽和甘汞電極，飽和甘汞電極的頂端浸泡 在待測(cè)溶液6液面以下；參比電極5與外加電源2正極連接，檢測(cè)儀表3的電壓表連接外加 電源2正極和外加電源2的滑線電阻滑動(dòng)臂上。所述電解池中的工作電極為汞滴電極，產(chǎn)生汞滴的裝置是在儲(chǔ)汞瓶9上端插入鉬 絲8于汞中，儲(chǔ)汞瓶9下端套塑料管10和毛細(xì)管11，儲(chǔ)汞瓶9中汞在毛細(xì)管的下端形成汞 滴，汞滴浸泡在待測(cè)溶液液面以下，儲(chǔ)汞瓶中的汞通過(guò)鉬絲與檢測(cè)儀表3的電流表連接，電 流表接到外加電源的滑線電阻滑動(dòng)臂上。所述作為固相載體的聚苯乙烯容器7，其成分為聚苯乙烯，聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸 附蛋白質(zhì)的性能，蛋白質(zhì)抗原和抗體吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性，待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白、 抗體、酶標(biāo)記抗體都吸附固定在固相載體上。所述外加電源2在工作電極4和參比電極5之間由計(jì)算機(jī)控制施加一個(gè)準(zhǔn)確電壓，由此精確控制工作電極4于-0. 46V (相對(duì)于參比電極5)的電位上，在此電位下氨基吩 噁嗪在汞滴表面發(fā)生電化學(xué)還原反應(yīng)，檢測(cè)儀表3的電流表精確記錄工作電極4汞滴表面 氨基吩噁嗪發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生的電流。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白變化規(guī)律的精確 檢測(cè)，基于牙本質(zhì)磷蛋白含量與牙根吸收發(fā)生程度之間的必然聯(lián)系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)患者牙根 吸收的早期診斷；本檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無(wú)輻射損傷等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的 臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是電化學(xué)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是牙本質(zhì)磷蛋白“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法及其裝置。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái) 詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。圖1為電化學(xué)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)裝置，該裝置包括了電解池1、檢測(cè)儀表3和儲(chǔ)汞瓶 9串聯(lián)構(gòu)成，外加電源2與檢測(cè)儀表3連接；在作為固相載體7的聚苯乙烯容器內(nèi)裝入待測(cè) 溶液6，工作電極4在待測(cè)溶液6液面以下、參比電極5為具有恒定電位的飽和甘汞電極，飽 和甘汞電極的頂端浸泡在待測(cè)溶液6液面以下；參比電極5與外加電源2正極連接，檢測(cè)儀 表3的電壓表連接外加電源2正極和外加電源2的滑線電阻滑動(dòng)臂上。所述電解池中的工作電極為汞滴電極，產(chǎn)生汞滴的裝置是在儲(chǔ)汞瓶9上端插入鉬 絲8于汞中，儲(chǔ)汞瓶9下端套塑料管10和毛細(xì)管11，儲(chǔ)汞瓶9中汞在毛細(xì)管的下端形成汞 滴，汞滴浸泡在待測(cè)溶液液面以下，儲(chǔ)汞瓶中的汞通過(guò)鉬絲與檢測(cè)儀表3的電流表連接，電 流表接到外加電源的滑線電阻滑動(dòng)臂上。所述固相載體7，其成分為聚苯乙烯，聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，蛋 白質(zhì)抗原和抗體吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性，待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白、抗體、酶標(biāo)記抗體都 吸附固定在固相載體上。所述外加電源2在工作電極4和參比電極5之間由計(jì)算機(jī)控制施加一個(gè)準(zhǔn)確電 壓，由此精確控制工作電極4的電位，在此恒定電位下氨基吩噁嗪在汞滴表面發(fā)生電化學(xué) 還原反應(yīng)，檢測(cè)儀表3的電流表精確記錄工作電極4汞滴表面氨基吩噁嗪發(fā)生還原反應(yīng)而 產(chǎn)生的電流。圖2為牙本質(zhì)磷蛋白酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程示意圖，將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13吸附 到聚苯乙烯容器作為固相載體7上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測(cè)牙本質(zhì) 磷蛋白(抗原)15樣品，使之與吸附于固相載體7上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13反應(yīng)，孵 育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性抗體16與待測(cè)抗原15反 應(yīng)，形成所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與抗原之間形成定量關(guān)系；最后加入包含過(guò)氧 化氫17和鄰氨基酚18的底物，在酶催化下，過(guò)氧化氫17和鄰氨基酚18反應(yīng)生成可進(jìn)行電 化學(xué)方法精確測(cè)定產(chǎn)物，酶的量與產(chǎn)物的量呈正比定量關(guān)系。產(chǎn)物的量可以通過(guò)圖1中所 示的裝置及方法加以測(cè)定。進(jìn)而可以測(cè)定待測(cè)樣品中牙本質(zhì)磷蛋白的含量并診斷牙根吸收
6發(fā)生的程度。本方法包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取及純化。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢 測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的含量。所述齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白的提取方法為取樣前，首先清潔口腔牙面并吹干。將 吸潮試紙尖端緊貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封 管并于-70°C保存，作為待測(cè)樣品待用。上述方法具有良好的可靠性和可重復(fù)性。關(guān)鍵影響 因素是放置時(shí)間，放置時(shí)間30秒，時(shí)間過(guò)少易導(dǎo)致所采集的齦溝液體積較少，給后續(xù)測(cè)量 帶來(lái)誤差。所述齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白的純化方法為在待測(cè)樣品中加入20μ 1蛋白提取 液，冰浴20 30分鐘，于4°C下15000轉(zhuǎn)/分鐘(r/min)離心10分鐘后，提取20 μ 1上清 液，加入等量蛋白上樣液，煮沸并冷卻，于-20°C保存待測(cè)。所述蛋白提取液配制方法先以少量蒸餾水(300 500ml)溶解60. 57g Tris (三 羥甲基氨基甲烷)，加入HCl后，用HCl(lmol/L)或Na0H(lmol/L)將pH調(diào)至7. 6，最后蒸餾 水加至1000ml，Tis濃度為0. 5mol/L。此液為儲(chǔ)備液，4°C冰箱中保存。所述蛋白上樣液配制方法先量取120ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入 200ml質(zhì)量濃度比為10%的SDS (十二烷基磺酸鈉)水溶液，500ml質(zhì)量濃度比為50%的甘 油水溶液，50ml的2-巰基乙醇，IOOml質(zhì)量濃度比為1 %的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至 1000ml。此液為儲(chǔ)備液，4°C冰箱中保存。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白含量包括基于“雙抗體夾 心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測(cè)法相結(jié)合精確測(cè)定牙本質(zhì)磷蛋白的精確含量。電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法反應(yīng)過(guò)程為用包被緩沖液將兔抗牙本質(zhì)磷 蛋白抗體13(如CSB-P10111Rb-h，武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品)稀釋至蛋白質(zhì)含量為 1 10μ g/ml，優(yōu)選5μ g/ml。在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C過(guò)夜，以使抗體與固相載體 充分吸附。次日，棄去容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的 抗體，如圖2所示。于聚苯乙烯容器中加0. Iml稀釋液(如圖2所示)適當(dāng)稀釋的待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白 抗原樣品15，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體13與待測(cè)樣品中 的牙本質(zhì)磷蛋白抗原15充分結(jié)合；用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待測(cè)樣品中的 其他成分(如圖2所示)；所述稀釋液為牛血清蛋白稀釋液，其配制方法為將0. Ig牛血清 蛋白溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml中配制而成。于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記牙 本質(zhì)磷蛋白抗體16，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本質(zhì)磷蛋白抗體16與牙本質(zhì)磷蛋白抗原 15充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去其他 成分，備用(如圖2所示)，此時(shí)所形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)中待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白抗原與辣根 過(guò)氧化物酶之間形成定量關(guān)系。所述包被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與 2. 93g碳酸氫鈉NaHCO3溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml配制而成。上述酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò) 程中洗滌緩沖液為PH7. 4的磷酸鹽緩沖液，其配制方法為0. 2g磷酸二氫鉀KH2PO4, 2. 9g磷 酸二氫鈉，8g氯化鈉NaCl，0. 2g KC1，0. 5ml吐溫Tween-20，混合溶解于蒸餾水并稀釋至
7IOOOml中配制而成。電化學(xué)方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的含量包括電化學(xué)檢測(cè)體系的建立以及在此基礎(chǔ) 上牙本質(zhì)磷蛋白含量的測(cè)定。電化學(xué)檢測(cè)體系為鄰氨基酚-過(guò)氧化氫-辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)體系。過(guò)氧化氫17 可以氧化鄰氨基酚18生成氨基吩噁嗪，該反應(yīng)十分緩慢，產(chǎn)物微量。而在辣根過(guò)氧化物酶 催化下，該反應(yīng)速度大大加快，生成大量產(chǎn)物氨基吩噁嗪。所生成氨基吩噁嗪可以在工作電 極4上于-0. 46V (相對(duì)于參比電極5)發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生還原電流，并相應(yīng)在檢測(cè)儀表3中 記錄下一個(gè)靈敏的電流峰。辣根過(guò)氧化物酶含量與電流峰大小在0. OlX 10_9-4X 10_9g/ml 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)正比定量關(guān)系，通過(guò)該方法可以精確測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶含量。在IOml的比色管中加入少量蒸餾水，依次加入1 X 10_2mol/L的鄰氨基酚溶液1ml， 0. 2mol/L的PH = 5. 7的B-R緩沖溶液1 3ml (優(yōu)選2ml)，4X 10_3mol/L過(guò)氧化氫0. 2 Iml (優(yōu)選0. 5ml)，以及不同量的標(biāo)準(zhǔn)辣根過(guò)氧化物酶，稀釋至刻度，在37°C下反應(yīng)30分鐘。 取此溶液5ml于另外一只IOml比色管中，計(jì)入PH = 8的B-R緩沖溶液2 5ml (優(yōu)選3ml)， 搖勻并稀釋至刻度，將IOml最終配制完成溶液倒入容器中，反應(yīng)1小時(shí)，將滴汞工作電極和 飽和甘汞參比電極插入反應(yīng)液中，在工作電極4上于-0. 46V (相對(duì)于參比電極5)電位處測(cè) 定并記錄工作電極反應(yīng)峰電流大小。以標(biāo)準(zhǔn)品辣根過(guò)氧化物酶濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)峰電 流大小為縱坐標(biāo)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程。以標(biāo)準(zhǔn)品辣根過(guò)氧化物酶濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)峰電流大小為縱坐標(biāo)，可以生成 標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程，根據(jù)公式I = 22. 6-5. 51og2X可計(jì)算未知樣品的濃度，式中I為 反應(yīng)電流的大小，單位為微安uA，X為辣根過(guò)氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ml ；通 過(guò)上述方法測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)限可達(dá)到1 X 10_12g/mL。上述電化學(xué)檢測(cè)體系的待測(cè)樣品中牙本質(zhì)磷蛋白含量測(cè)定方法是在IOml的比色管中加入少量蒸餾水，依次加入1 X 10_2mol/L的鄰氨基酚溶液1ml， 濃度0. 2mol/L的PH = 5. 7的B-R緩沖溶液1 3ml (優(yōu)選2ml)，濃度4X 10_3mol/L過(guò)氧 化氫0. 2 Iml (優(yōu)選0. 5ml)，以及0. 005 5ml濃度為2X 10_8g/ml的標(biāo)準(zhǔn)辣根過(guò)氧化物 酶，稀釋至IOml標(biāo)準(zhǔn)刻度，在37°C下反應(yīng)30分鐘。取此溶液5ml于另外一只IOml比色管 中，加入PH = 8的B-R緩沖溶液2 5ml (優(yōu)選3ml)，搖勻并稀釋至IOml標(biāo)準(zhǔn)刻度，將IOml 最終配制完成溶液倒入前述完成酶聯(lián)免疫反應(yīng)帶有“雙抗體夾心結(jié)構(gòu)”的聚苯乙烯容器中， 反應(yīng)1小時(shí)，將工作電極和參比電極插入反應(yīng)液中，在汞滴電極4上于-0. 46V (相對(duì)于飽和 甘汞參比電極5)電位測(cè)定并記錄工作電極表面反應(yīng)峰電流大小，進(jìn)而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 辣根過(guò)氧化物酶量的多少。進(jìn)而根據(jù)辣根過(guò)氧化物酶與牙本質(zhì)磷蛋白抗原含量之間的定量 關(guān)系計(jì)算待測(cè)樣品中牙本質(zhì)磷蛋白含量。上述PH = 5. 7的B-R緩沖溶液配制方法為，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼 酸，濃度均為0. 04mol/L)中，加入40ml的0. 2mol/LNa0H,即得。上述PH = 8的B-R緩沖溶液配制方法為，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼 酸，濃度均為0. 04mol/L)中，加入60ml的0. 2mol/LNa0H,即得。由于待測(cè)樣品中辣根過(guò)氧 化物酶的量與牙本質(zhì)磷蛋白抗原的量呈定量關(guān)系，因此該方法可精確測(cè)定齦溝液中牙本質(zhì) 磷蛋白的含量。上述結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明、理解，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)
8限定。需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組
I=I O
權(quán)利要求
一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法是基于電化學(xué)酶聯(lián)免疫的測(cè)定法；包括牙本質(zhì)磷蛋白的提取及純化和電化學(xué)“雙抗體夾心”酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的含量?jī)蓚€(gè)步驟；1)牙本質(zhì)磷蛋白的提取和純化采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙本質(zhì)磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純?nèi)忧埃紫惹鍧嵖谇谎烂娌⒋蹈蓪⑽痹嚰埣舛司o貼于牙齒的頰舌側(cè)牙面的齦溝邊緣，放置30秒以上，取出后放入離心密封管作待測(cè)樣品，并于 70℃保存；待測(cè)樣品提純是在待測(cè)樣品中加入20μl蛋白提取液，冰浴20～30分鐘，于4℃下15000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，提取20μl上清液，加入等量蛋白上樣液，煮沸并冷卻，于 20℃保存待測(cè)；其中蛋白提取液配制是先以300～500ml蒸餾水溶解60.57g三羥甲基氨基甲烷，加入HCl后，用濃度為1mol/L的HCl或濃度為1mol/L的NaOH，將pH調(diào)至7～8，最后蒸餾水加至1000ml，得到濃度為0.5mol/L的蛋白提取液，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?；蛋白上樣液配制是先量?20ml上述0.5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml質(zhì)量濃度比為10％的十二烷基磺酸鈉SDS水溶液，500ml質(zhì)量濃度比為50％的甘油水溶液，50ml的2 巰基乙醇，100ml質(zhì)量濃度比為1％的溴酚蘭水溶液，最后蒸餾水加至1000ml，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?)電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白含量a.基于“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測(cè)法相結(jié)合精確測(cè)定牙本質(zhì)磷蛋白的精確含量；酶聯(lián)免疫反應(yīng)過(guò)程為將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體吸附到以聚苯乙烯容器作為固相載體上，孵育后洗滌除去未吸附的抗體；加入含有待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的抗原樣品，使之與吸附于固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體反應(yīng)，孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的特異性牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白的抗原反應(yīng)，形成所謂“雙抗體夾心抗原”結(jié)構(gòu)，此時(shí)酶與雙抗體夾心抗原之間形成等量關(guān)系；最后加入主要成分包括鄰氨基酚和過(guò)氧化氫的底物，在酶催化下，底物鄰氨基酚和過(guò)氧化氫反應(yīng)生成可進(jìn)行電化學(xué)方法精確測(cè)定的產(chǎn)物氨基吩噁嗪；b.“電化學(xué)”測(cè)試法為鄰氨基酚和過(guò)氧化氫的底物溶液在辣根過(guò)氧化物酶催化下，過(guò)氧化氫將鄰氨基酚氧化生成產(chǎn)物氨基吩噁嗪，氨基吩噁嗪在汞電極上發(fā)生還原反應(yīng)，其反應(yīng)電流的大小與氨基吩噁嗪的量呈正比定量關(guān)系，進(jìn)而與辣根過(guò)氧化物酶的量呈I＝22.6 5.5log2X，式中I為反應(yīng)電流的大小，單位為微安μA，X為辣根過(guò)氧化物酶的含量，單位為納克每毫升ng/ml，則通過(guò)測(cè)定上述反應(yīng)電流的大小，測(cè)定氨基吩噁嗪的量，進(jìn)而測(cè)定辣根過(guò)氧化物酶的量，進(jìn)而測(cè)定待測(cè)樣品中牙本質(zhì)磷蛋白的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述孵育后洗滌除去 未吸附的抗體是用包被緩沖液將兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1 10 μ g/ ml，優(yōu)選5 μ g/ml，在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C過(guò)夜，以使抗體與固相載體充分吸附； 次日，棄去容器內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去未發(fā)生吸附的抗體；其 中包被緩沖液為PH9. 6的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為1. 59g碳酸鈉Na2CO3與2. 93g碳 酸氫鈉NaHCO3溶解于蒸餾水中并稀釋至IOOOml配制而成；其中兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體為 CSB-P10111Rb-h，武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述孵育后洗滌除去未反應(yīng)的樣品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀釋液，稀釋的待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白 抗原樣品，于37°C孵育1小時(shí)，使固相載體上的兔抗牙本質(zhì)磷蛋白抗體與待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋 白抗原充分結(jié)合；用洗滌緩沖沖洗三次，每次三分鐘，洗去待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白抗原樣品中的 未反應(yīng)的樣品；其中牛血清蛋白稀釋液是由0. Ig牛血清蛋白溶解于IOOOml蒸餾水中稀釋 配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法，其特征在于，所述形成所謂“雙抗體 夾心抗原”結(jié)構(gòu)是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記牙本質(zhì)磷蛋白抗體，于37°C孵育1小時(shí)，使酶標(biāo)牙本質(zhì)磷蛋白抗體與牙本質(zhì)磷蛋白抗 原充分結(jié)合，形成所謂“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)，用洗滌緩沖液沖洗三次，每次三分鐘，洗去其他 成分。
5.一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)裝置，其特征在于，該裝置由電解池(1)、檢測(cè)儀表(3)和 儲(chǔ)汞瓶(9)串聯(lián)構(gòu)成，外加電源(2)與檢測(cè)儀表(3)連接構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述電解池為以聚苯 乙烯容器作為固相載體(7)內(nèi)裝入待測(cè)樣品溶液(6)，工作電極(4)在待測(cè)樣品溶液(6)液 面以下、參比電極(5)為具有恒定電位的飽和甘汞電極，飽和甘汞電極的頂端浸泡在待測(cè) 溶液(6)液面以下；參比電極(5)與外加電源(2)正極連接，檢測(cè)儀表(3)的電壓表連接在 外加電源(2)正極和外加電源(2)的滑線電阻滑動(dòng)臂上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述電解池中的工 作電極為汞滴電極，產(chǎn)生汞滴的裝置是在儲(chǔ)汞瓶(9)上端插入鉬絲⑶于汞中，儲(chǔ)汞瓶(9) 下端套塑料管(10)和毛細(xì)管(11)，儲(chǔ)汞瓶(9)中汞在毛細(xì)管的下端形成汞滴，汞滴浸泡在 待測(cè)溶液液面以下，儲(chǔ)汞瓶中的汞通過(guò)鉬絲與檢測(cè)儀表(3)的電流表連接，電流表接到外 加電源的滑線電阻滑動(dòng)臂上。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述固相載體的成分 為聚苯乙烯，聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，蛋白質(zhì)抗原和抗體吸附其上后保留 原來(lái)的免疫活性，待測(cè)牙本質(zhì)磷蛋白、抗體、酶標(biāo)記抗體都吸附固定在固相載體上。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述外加電源(2)在 工作電極(4)和參比電極(5)之間由計(jì)算機(jī)控制施加一個(gè)電壓，由此精確控制工作電極(4) 相對(duì)于參比電極(5)于-0. 46V的電位，在此電位下氨基吩噁嗪在汞滴表面發(fā)生電化學(xué)還原 反應(yīng)，檢測(cè)儀表(3)的電流表精確記錄工作電極(4)汞滴表面氨基吩噁嗪發(fā)生還原反應(yīng)而 產(chǎn)生的電流。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于電化學(xué)酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域的一種牙本質(zhì)磷蛋白的檢測(cè)方法及其裝置。在由電解池、檢測(cè)儀表和儲(chǔ)汞瓶串聯(lián)連接，及外加電源與檢測(cè)儀表連接構(gòu)成的裝置中采用“雙抗體夾心法”酶聯(lián)免疫反應(yīng)及“電化學(xué)”檢測(cè)法相結(jié)合精確測(cè)定牙本質(zhì)磷蛋白的精確含量，采用“濾紙吸著法”提取患者口腔齦溝液中的牙本質(zhì)磷蛋白，并采用“蛋白提取液純化法”提純提取患者口腔齦溝液中的牙本質(zhì)磷蛋白，提純后放入離心密封管作待測(cè)樣品；本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)齦溝液中牙本質(zhì)磷蛋白變化規(guī)律的精確檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)患者牙根吸收的早期診斷；本檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無(wú)輻射損傷等優(yōu)點(diǎn)，在牙根吸收的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101986158SQ20101025970
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者沙海亮, 白玉興 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院