專利名稱：基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微量蛋白的檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及基于納米探針結(jié)合微流體芯片技術(shù)來(lái) 檢測(cè)目標(biāo)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是病毒性肝炎發(fā)病率較高的國(guó)家，乙型肝炎(HBV)的發(fā)病率均居世界首位。 慢性感染可致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(HCC)， 對(duì)患者的健康和生命危害極大，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此早期及時(shí)有效地 對(duì)患者進(jìn)行肝炎病毒的檢測(cè)就顯得尤為重要。目前臨床診斷HBV主要方法有ELISA和聚合 酶鏈反應(yīng)，但仍存在一定的局限性。前者的窗口期漏檢是當(dāng)前影響血液安全性進(jìn)一步提高 的瓶頸，后者由于交叉污染而帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。不同的檢測(cè)方法針對(duì)同一種病原有不同 的窗口期，酶免檢測(cè)的窗口期比較長(zhǎng)，而HBsAg則為56天。處于窗口期的病人具有傳染性， 但用這種檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)到其病毒標(biāo)志物，這一原因占血液漏檢的90%以上。故酶免檢 測(cè)的窗口期漏檢幾乎不可避免。為了大幅度地縮短檢測(cè)窗口期，進(jìn)一步提高血液安全性，因 此如何建立一種簡(jiǎn)單、快速、特異的乙型肝炎微量蛋白檢測(cè)方法非常關(guān)鍵。近年來(lái)，納米材料的優(yōu)良特性受到人們?cè)絹?lái)越多地關(guān)注，如在免疫檢測(cè)中受到廣 泛應(yīng)用的納米級(jí)的膠體金顆粒，由于納米金顆粒對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與蛋白 質(zhì)/核酸等非共價(jià)結(jié)合，因而在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。納 米金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些 標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于定性或 半定量的快速檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為銀染色。納 米金顆粒標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)不依賴昂貴的激光檢測(cè)儀 器，只需普通光學(xué)儀器，甚至肉眼即可辨別。目前，將納米技術(shù)應(yīng)用到臨床醫(yī)學(xué)中微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)已成為熱點(diǎn)?，F(xiàn)已有報(bào)道， 如納米金結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)腫瘤蛋白、納米金結(jié)合熒光染料對(duì)核蛋白的檢測(cè)等方 法，但這些方法都存在一定的缺陷，前者需要特定的酶標(biāo)儀，而后者需要熒光試劑及昂貴的 熒光檢測(cè)儀，容易造成污染、假陽(yáng)性。因此，需要建立一種無(wú)需特殊儀器僅靠肉眼觀察的納 米檢測(cè)微量蛋白質(zhì)的方法?；谝陨纤?，本發(fā)明擬將納米技術(shù)、微流控技術(shù)、銀染技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立一種 基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法，并將此方法用于乙型肝炎微量蛋白的檢 測(cè)，因而引導(dǎo)出本發(fā)明的主要構(gòu)思。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法，針 對(duì)在臨床血清中乙型肝炎的診斷。本發(fā)明是通過(guò)納米磁珠和納米金DNA結(jié)合微流體芯片技術(shù)，將樣品混合、反應(yīng)、分
6離及檢測(cè)功能集成一體，在納米金顆粒上同時(shí)標(biāo)記單克隆二抗及信號(hào)放大作用的Barcode DNA，通過(guò)信號(hào)的逐級(jí)放大，達(dá)到對(duì)微量目標(biāo)抗原的檢測(cè)。該方法具有高靈敏度和特異性，并 且不需要復(fù)雜的儀器以及酶反應(yīng)的PCR實(shí)驗(yàn)條件，有望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中乙型肝炎的 早期檢測(cè)和篩查。具體的說(shuō)本發(fā)明是由微流體芯片的制備、檢測(cè)試劑及DNA的準(zhǔn)備、單克隆抗體和 DNA的標(biāo)記、檢測(cè)與結(jié)果判讀等四個(gè)過(guò)程組成的，主要通過(guò)納米磁珠標(biāo)記單克隆一抗，納 米金同時(shí)標(biāo)記單克隆二抗與Barcode DNA，兩者與抗原形成三明治結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)變性將 Barcode DNA從三明治結(jié)構(gòu)上的釋放出來(lái)，并由微芯片的捕獲區(qū)域流入檢測(cè)區(qū)域，進(jìn)一步與 金DNA、芯片DNA互補(bǔ)雜交，從而造成信號(hào)逐級(jí)放大，通過(guò)銀染顯色得出結(jié)果(流程見(jiàn)圖1)。 具體技術(shù)方案闡述如下(一 )微流體芯片的制備微流體芯片(簡(jiǎn)稱微芯片)中微結(jié)構(gòu)的示意圖如圖2所示。利用標(biāo)準(zhǔn)的光刻工藝 實(shí)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作，將點(diǎn)有DNA的醛基修飾玻璃片與微結(jié)構(gòu)封接制備了所需的微芯片。該 芯片具有將生物樣品的富集、分離和檢測(cè)連接為一體，應(yīng)用于微量蛋白質(zhì)(抗原或抗體)的 檢測(cè)。整個(gè)芯片大小為75mmX 25mm，分為捕獲區(qū)域和檢測(cè)區(qū)域，制備過(guò)程如下1、硅片為基底材料，甩SU-8光刻膠，曝光、顯影制作管道模具和閥門(mén)模具；2、將PDMS、固化劑以20 1混合(重量比)，除氣泡后澆注在管道模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作管道微結(jié)構(gòu)；3、將PDMS、固化劑以10 1混合(重量比)，除氣泡后澆注在閥門(mén)模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作閥門(mén)微結(jié)構(gòu)；4、剝離閥門(mén)模具上的PDMS，用打孔針打進(jìn)氣孔(圖2中A、B、C三個(gè)孔)；然后與
管道微結(jié)構(gòu)貼合在一起；5、然后剝離管道-閥門(mén)粘合體，打孔(圖2中1、3為進(jìn)樣孔，2、4為廢液池)，并與 點(diǎn)有DNA的玻璃片健合，完成微芯片的制作。所述步驟(一)/1中閥門(mén)(包括閥門(mén)A、閥門(mén)B、閥門(mén)C)的寬度是管道寬度的1.5 倍；所述步驟(一)/2中管道微結(jié)構(gòu)中PDMS單體與固化劑的重量混合比例20 1 ；所述步驟(一)/3中閥門(mén)微結(jié)構(gòu)中PDMS單體與固化劑的重量混合比例10 1 ；所述步驟(一)/2、3中管道與閥門(mén)微結(jié)構(gòu)的固化條件是90°C，1小時(shí)；( 二)檢測(cè)試劑及DNA的設(shè)計(jì)1、納米金溶液的制備配置濃度為ImM HAuC14 (四氯金酸)溶液及濃度為38. 8mM的檸檬酸三鈉溶液。將 HAuC14溶液加熱至120-140°C ；保證加熱過(guò)程中攪拌充分，約20分鐘時(shí)迅速加入新配好的 檸檬酸三鈉溶液(此過(guò)程中注意保溫，不要讓HAuC14溶液降溫)25ml，持續(xù)攪拌至溶液冷卻 至室溫、即形成為酒紅色溶液。以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過(guò)濾溶液，即可得到顆粒均勻的 13nm納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?、DNA鏈的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)了三條DNA探針，一條是Barcode DNA，用于標(biāo)記單克隆二抗，起信號(hào)放大作 用；第二條是信號(hào)DNA，用于標(biāo)記納米金，與Barcode DNA—部分序列雜交互補(bǔ)反應(yīng)，起信號(hào)放大作用；第三條是芯片DNA，固定于醛基修飾的玻璃片上，與Barcode DNA另一部分序列 雜交互補(bǔ)反應(yīng)。DNA探針的合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，序列如下，Barcode DNA 5 ’ -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3 ’信號(hào)DNA :5，-HS- (CH2) 3-Poly (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片DNA :5，-NH2-poly (A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3(三)單克隆抗體和DNA的標(biāo)記1、納米磁珠標(biāo)記單克隆一抗(MMP探針)將50ul 納米磁珠(Dynal Invitrogen Corp. (USA))用等量 MES (2_ (N-嗎啉)乙 磺酸，25Mm，PH6)清洗，去上清，依次加入50ul EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽)和NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，孵育后去上清、清洗；將活化好的磁珠溶于90ul 的MES，與5ul單克隆一抗混合均勻后孵育；然后加入IOOul Tris孵育，磁分離后用IOOul 的PBS (磷酸鹽緩沖液，IOmM)清洗，去上清，加入50ul的PBS重新懸浮磁珠，4°C保存。MMP探針用于捕獲待檢測(cè)的微量抗原，由于抗原抗體反應(yīng)形成MMP-抗原復(fù)合物。2、單克隆二抗、barcode DNA標(biāo)記納米金(NP探針)取200ul的納米金，用碳酸鉀調(diào)節(jié)PH為8. 2附近，加入30ul的單克隆二抗，放置1 個(gè)小時(shí)后，再加入3ul barcode DNA，孵育M小時(shí)；加5ul的10% PEG8000 (聚乙二醇8000) 孵育30min后，依次加入4ul的0. IM NaCL,0. OlM PB (磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉)，加三次，
使溶液維持一定鹽濃度，4°C保存。NP探針可以與MMP-抗原復(fù)合物反應(yīng)，形成三明治結(jié)構(gòu)，信號(hào)初次放大。3、信號(hào)DNA與納米金(金DNA)取Iml納米金溶液4°C、9000rpm離心50min，棄上清，加入97 μ 1滅菌水和3 μ 1信 號(hào)DNA到金顆粒中，混合均勻后，4°C靜置12小時(shí)；然后依次加入3 μ 1的0. IM PBUM NaCL, 總體積為18 μ 1 (1小時(shí)/次，三次)；混合均勻后，4°C靜置48小時(shí)，再加入PB/NaCL混合液 (0. OlM PB,0. IM NaCL)使總體積為Iml ；離心50min后，棄上清，加入IOOul的PB/NaCL混 合液，4 °C保存。金DNA可與Barcode DNA雜交反應(yīng)，信號(hào)再次放大。所述步驟(三)/1中磁珠的用量為500 μ g，抗體的用量為5 μ g ；所述步驟(三)/2中納米金顆粒大小為13nm，納米金溶液濃度為12. 2nM，單克隆 二抗的濃度為0. lmg/ml.；所述步驟(三)/3中信號(hào)DNA的濃度為300PM ；(四)檢測(cè)與結(jié)果判讀1、取10 μ 1的乙肝表面抗原加入微芯片的進(jìn)樣口 1，與MMP探針室溫孵育30分 鐘，抗原抗體免疫反應(yīng)形成了抗原-MMP復(fù)合物；磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸鹽、 ΡΗ7. 4清洗，將未反應(yīng)的多余抗原沖洗掉，廢液從廢液池2流走(閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài))。2、加入20 μ 1的NP探針，孵育30分鐘，形成了三明治結(jié)構(gòu)NP-抗原-ΜΜΡ，信號(hào)通 過(guò)NP探針上Barcode DNA初次放大；磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸鹽清洗，將未反 應(yīng)的NP探針沖洗掉，廢液從廢液池2流走(閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài))。3、去磁場(chǎng)，加入20 μ 1 DTT，變性15min。打開(kāi)閥門(mén)B，使釋放的BarcodeDNA流入檢 測(cè)區(qū)域，與微芯片上DNA雜交。
4、同時(shí)將20μ 1金DNA加入進(jìn)樣口 3，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片雜交復(fù)合 物，信號(hào)通過(guò)金DNA再次放大，孵育15min后，加入銀染試劑，5min后觀察結(jié)果。當(dāng)銀離子遇 到DNA-Barcode DNA-金DNA復(fù)合物時(shí)，由于納米金將銀離子還原為銀顆粒，造成銀顆粒的 沉積放大，通過(guò)肉眼或顯微鏡觀察可見(jiàn)黑褐色顆粒。綜上所述，本發(fā)明涉及一種基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法，其 特征在于采用標(biāo)準(zhǔn)的光刻工藝實(shí)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作，用玻璃片(點(diǎn)有DNA探針)與微結(jié)構(gòu) 封接制備了所需的微流體芯片；在納米金顆粒上同時(shí)標(biāo)記單克隆二抗及信號(hào)放大作用的 Barcode DNA，并在磁珠上標(biāo)記單克隆一抗；在微流體芯片管道內(nèi)，通過(guò)抗原抗體免疫反應(yīng) 以及信號(hào)的逐級(jí)放大、銀染顯色，從而達(dá)到對(duì)微量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。所述的方法將生物樣品 的富集、分離和檢測(cè)連接為一體，具有特異、快速和高靈敏的特點(diǎn)，可望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)醫(yī) 學(xué)中微量蛋白(抗原或抗體)的診斷和檢測(cè)。靈敏度可達(dá)pg/ml，比臨床中普通的LEISA法 提高了 1000倍。


圖1為基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的流程圖；圖2為微流體芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為乙肝表面抗原(a)和小牛血清(b)的檢測(cè)結(jié)果；圖4為臨場(chǎng)血清樣本的檢測(cè)結(jié)果，(a)稀釋1000倍，(b)稀釋100倍，(c)稀釋10倍。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)

和具體實(shí)施例的解釋，以進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯 著的進(jìn)步。圖1為本發(fā)明提供的檢測(cè)微量蛋白的流程圖，圖中①微結(jié)構(gòu)與DNA芯片封接構(gòu)成 了微流體芯片，簡(jiǎn)稱微芯片；②將MMP探針加入微芯片進(jìn)樣孔1中，在磁場(chǎng)作用下，固定于微管壁；③加入待測(cè)抗原(進(jìn)樣孔1)，與MMP探針抗原抗體反應(yīng)，緩沖液沖洗；④加入NP探針(進(jìn)樣孔1)，與抗原-MMP形成三明治結(jié)構(gòu)NP-抗原-MMP ；⑤加入DTT(進(jìn)樣孔1)孵育后，打開(kāi)閥門(mén)B，Barcode DNA釋放到微芯片的檢測(cè)區(qū) 域；⑥同時(shí)在進(jìn)樣孔3中加入金DNA，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片復(fù)合物；⑦加入銀染試劑顯色，由于銀離子被納米金氧化還原為銀粒子，從而造成銀沉積 顯黑褐色；上述步驟1、2、3、4中閥門(mén)B和閥門(mén)C處于關(guān)閉狀態(tài)；步驟6、7中閥門(mén)A和閥門(mén)B 處于關(guān)閉狀態(tài)。圖2為微流體芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，微流體使用是1)將閥門(mén)PDMS模型作好后，打閥 門(mén)A、B、C的進(jìn)氣孔；2)將閥門(mén)與管道PDMS粘合后，打進(jìn)樣孔1、3，廢液池2、4 ；3)當(dāng)反應(yīng)在捕獲區(qū)域時(shí)，通過(guò)氣壓來(lái)控制閥門(mén)B、閥門(mén)C處于關(guān)閉狀態(tài)；
9
4)當(dāng)反應(yīng)在檢測(cè)區(qū)域時(shí)，通過(guò)氣壓來(lái)控制閥門(mén)B、閥門(mén)A處于關(guān)閉狀態(tài)。實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)品乙肝表面抗原的檢測(cè)(一)微流體芯片的制備1、硅片為基底材料，甩SU-8光刻膠，曝光、顯影制作管道模具和閥門(mén)模具；2、將PDMS、固化劑以20 1混合(重量比)、除氣泡后澆注在管道模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作管道微結(jié)構(gòu)；3、將PDMS、固化劑以10 1混合(重量比)、除氣泡后澆注在閥門(mén)模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作閥門(mén)微結(jié)構(gòu)；4、剝離閥門(mén)模具上的PDMS，用打孔針打進(jìn)氣孔(圖2中A、B、C三個(gè)孔)；然后與
管道微結(jié)構(gòu)貼合在一起；5、然后剝離管道-閥門(mén)粘合體，打孔(圖2中1、3為進(jìn)樣孔，2、4為廢液池)，并與 點(diǎn)有DNA的玻璃片健合，完成微芯片的制作。 (二)檢測(cè)試劑及DNA的準(zhǔn)備1、納米金溶液的制備配置濃度為ImM HAuC14(四氯金酸)溶液及濃度為38. 8mM的，檸檬酸三鈉溶液。 將HAuC14溶液加熱至130°C，保證加熱過(guò)程中攪拌充分，約20分鐘時(shí)迅速加入新配好的檸 檬酸三鈉溶液(此過(guò)程中注意保溫，不要讓HAuC14溶液降溫)25ml，持續(xù)攪拌至溶液冷卻 至室溫、即形成為酒紅色溶液。以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過(guò)濾溶液，即可得到顆粒均勻的 13nm納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?、DNA鏈的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)了三條DNA探針，一條是Barcode DNA，用于標(biāo)記單克隆二抗，起信號(hào)放大作 用；第二條是信號(hào)DNA，用于標(biāo)記納米金，與Barcode DNA—部分序列雜交互補(bǔ)反應(yīng)，起信號(hào) 放大作用；第三條是芯片DNA，固定于醛基修飾的玻璃片上，與Barcode DNA另一部分序列 雜交互補(bǔ)反應(yīng)。DNA探針的合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，序列如下，Barcode DNA :5， -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3，信號(hào)DNA :5，-HS- (CH2) 3-Poly (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片DNA :5，-NH2-poly (A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3(三)單克隆抗體和DNA的標(biāo)記1、納米磁珠標(biāo)記單克隆一抗(MMP探針)將50ul 納米磁珠(Dynal Invitrogen Corp. (USA))用等量 MES (2_ (N-嗎啉)乙 磺酸，25Mm，PH6)清洗，去上清，依次加入50ul EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽)和NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，孵育后去上清、清洗；將活化好的磁珠溶于90ul 的MES，與5ul單克隆一抗混合均勻后孵育；然后加入IOOul Tris孵育，磁分離后用IOOul 的PBS (磷酸鹽緩沖液，IOmM)清洗，去上清，加入50ul的PBS重新懸浮納米磁珠，4°C保存。MMP探針用于捕獲待檢測(cè)的微量抗原，由于抗原抗體反應(yīng)形成MMP-抗原復(fù)合物。2、單克隆二抗、barcode DNA標(biāo)記納米金(NP探針)取200ul的納米金，用碳酸鉀調(diào)節(jié)PH為8. 2附近，加入30ul的單克隆二抗，放置1 個(gè)小時(shí)后，再加入3ul barcode DNA，孵育M小時(shí)；加5ul的10% PEG8000 (聚乙二醇8000) 孵育30min后，依次加入4ul的0. IM NaCL,0. OlM PB (磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉)，加三次，
10使溶液維持一定鹽濃度，4°C保存。NP探針可以與MMP-抗原復(fù)合物反應(yīng)，形成三明治結(jié)構(gòu)，信號(hào)初次放大。3、信號(hào)DNA與納米金(金DNA探針)取Iml納米金溶液4°C、9000rpm離心50min，棄上清，加入97 μ 1滅菌水和3 μ 1信 號(hào)DNA到金顆粒中，混合均勻后，4°C靜置12小時(shí)；然后依次加入3 μ 1的0. IM PBUM NaCL, 總體積為18 μ 1 (1小時(shí)/次，三次)；混合均勻后，4°C靜置48小時(shí)，再加入PB/NaCL混合液 (0. OlM PB,0. IM NaCL)使總體積為Iml ；離心50min后，棄上清，加入IOOul的PB/NaCL混 合液，4 °C保存。金DNA可與Barcode DNA雜交反應(yīng)，信號(hào)再次放大。(四)檢測(cè)與結(jié)果判讀1、取10 μ 1的乙肝表面抗原加入微芯片的進(jìn)樣口 1，與MMP探針室溫孵育30分鐘， 抗原抗體免疫反應(yīng)形成了抗原-MMP復(fù)合物；在磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸鹽、 ΡΗ7. 4清洗，將未反應(yīng)的多余抗原沖洗掉，廢液從廢液池2流走(閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài))。2、加入20 μ 1的NP探針，孵育30分鐘，形成了三明治結(jié)構(gòu)NP-抗原-ΜΜΡ，信號(hào)通 過(guò)NP探針上Barcode DNA初次放大；在磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸鹽清洗，將未 反應(yīng)的NP探針沖洗掉，廢液從廢液池2流走(閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài))。3、去磁場(chǎng)，加入20 μ 1 DTT，變性15min。打開(kāi)閥門(mén)B，使釋放的BarcodeDNA流入檢 測(cè)區(qū)域，與微芯片上DNA雜交。4、同時(shí)將20μ 1金DNA加入進(jìn)樣口 3，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片雜交復(fù)合 物，信號(hào)通過(guò)金DNA再次放大，孵育15min后，加入銀染試劑，5min后觀察結(jié)果。結(jié)果判讀，抗原與磁珠上抗體結(jié)合，然后與NP探針形成三明治結(jié)構(gòu)，通過(guò)Barcode DNA釋放，與芯片DNA、金-DNA雜交，銀染顯色。見(jiàn)圖3。本發(fā)明對(duì)比了標(biāo)準(zhǔn)品乙肝表面抗原與標(biāo)準(zhǔn)品小牛血清的對(duì)照結(jié)果，由于MMP抗體 可以捕獲到乙肝表面抗原，并于NP探針形成三明治結(jié)構(gòu)，從而B(niǎo)arcode DNA的釋放，進(jìn)一步 與芯片DNA、金DNA雜交反應(yīng)，通過(guò)銀染可以顯示出黑褐色(見(jiàn)圖3-a)；而標(biāo)準(zhǔn)品小牛血清 中不含靶抗原，不會(huì)形成三明治結(jié)構(gòu)及Barcode DNA的釋放，也沒(méi)有雜交反應(yīng)，銀染顯示無(wú) 黑褐色出現(xiàn)(見(jiàn)圖3-b)。實(shí)施例2 臨床血清樣品檢測(cè)(lng/ml乙肝血清標(biāo)本)(一)微流體芯片的制備與實(shí)施案例1中(一)相同。( 二)檢測(cè)試劑及DNA的準(zhǔn)備與實(shí)施案例1中(二)相同。(三)單克隆抗體和DNA的標(biāo)記與實(shí)施案例1中(三)相同。(四)檢測(cè)與結(jié)果判讀1、樣品的處理將臨床血清樣品用小牛血清稀釋，濃度為lpg/ml、10pg/ml、100pg/ml，取IOul加 入進(jìn)樣口 1。2、方法與實(shí)施案例1中(四)相同，結(jié)果見(jiàn)圖4。
本發(fā)明將臨床血清樣本稀釋了 1000、100、10倍做靈敏度試驗(yàn)，由于MMP抗體可以 捕獲到臨床血清樣本中乙肝表面抗原，并于NP探針形成三明治結(jié)構(gòu)，從而B(niǎo)arcode DNA的 釋放，進(jìn)一步與芯片DNA、金DNA雜交反應(yīng)，通過(guò)銀染可以顯示出黑褐色。如圖4-a為稀釋 1000倍的血清(lpg/ml)，圖4-b稀釋100倍的血清(10pg/ml)，圖4_c稀釋10倍的血清 (100pg/ml)。因此，本方法的靈敏度可達(dá)到lpg/ml，比普通方法高了 1000倍。通過(guò)對(duì)臨床血清樣品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)納米金結(jié)合微流體方法的靈敏度可達(dá)pg/ml，比 臨床中普通的ELISA法高了 1000倍。
權(quán)利要求
1.基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法，其特征在于是通過(guò)納米磁珠和納 米金DNA結(jié)合微流體芯片技術(shù)，將樣品混合、反應(yīng)、分離及檢測(cè)功能集成一體，通過(guò)納米磁 珠標(biāo)記單克隆一抗，納米金同時(shí)標(biāo)記單克隆二抗與Barcode DNA，兩者與抗原形成三明治結(jié) 構(gòu)，然后通過(guò)變性將BarcodeDNA從三明治結(jié)構(gòu)上的釋放出來(lái)，并由微芯片的捕獲區(qū)域流入 檢測(cè)區(qū)域，進(jìn)一步與金DNA、芯片DNA互補(bǔ)雜交，從而造成信號(hào)逐級(jí)放大，通過(guò)銀染顯色得出 結(jié)果。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(A)微流體芯片的制備利用標(biāo)準(zhǔn)的光刻工藝實(shí)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作，將點(diǎn)有DNA的醛基修飾玻璃片與微結(jié)構(gòu)封接 制備了所需的微流體芯片；所制作的微流體芯片具有將生物樣品的富集、分離和檢測(cè)連接 為一體，應(yīng)用于微量蛋白質(zhì)抗原或抗體的檢測(cè)；制備過(guò)程如下a)硅片為基底材料，用SU-8光刻膠，曝光、顯影制作管道模具和閥門(mén)模具；b)將PDMS、固化劑以質(zhì)量比為20 1比例混合，除氣泡后澆注在管道模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作管道微結(jié)構(gòu)；c)將PDMS、固化劑以質(zhì)量比為10 1比例混合，除氣泡后澆注在閥門(mén)模具上，90°C加 熱固化1小時(shí)，制作閥門(mén)微結(jié)構(gòu)；d)剝離閥門(mén)模具上的PDMS，用打孔針打A、B、C三個(gè)進(jìn)氣孔；然后與管道微結(jié)構(gòu)貼合在 一起；e)然后剝離管道-閥門(mén)粘合體，打進(jìn)樣孔和廢液池孔，并與點(diǎn)有DNA的玻璃片健合，完 成微芯片的制作；(B)檢測(cè)試劑及DNA的設(shè)計(jì)a)納米金溶液的制備配置濃度為ImM四氯金酸溶液及濃度為38. SmM的檸檬酸三鈉溶液。將四氯金酸溶液加 熱至120-140°C，加熱過(guò)程中攪拌充分，20分鐘時(shí)迅速加入新配好的檸檬酸三鈉溶液25ml， 持續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫、即形成為酒紅色溶液；以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過(guò)濾溶液， 即可得到顆粒均勻的13nm納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆茫籦)DNA鏈的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)了三條DNA探針，一條是Barcode DNA，用于標(biāo)記單克隆二抗，起信號(hào)放大作用，同 時(shí)連接到納米金顆粒上；第二條是信號(hào)DNA，用于標(biāo)記納米金，與Barcode DNA 一部分序列 雜交互補(bǔ)反應(yīng)，起信號(hào)放大作用；第三條是芯片DNA，固定于醛基修飾的玻璃片上，并且與 Barcode DNA另一部分序列雜交互補(bǔ)反應(yīng)；(C)單克隆抗體和DNA的標(biāo)記a)納米磁珠標(biāo)記單克隆一抗-MMP探針將50 μ 1納米磁珠用等量MES清洗，去上清，依次加入50 μ 1 EDC和NHS，孵育后去上 清、清洗；將活化好的磁珠溶于90 μ 1的MES，與5 μ 1單克隆一抗混合均勻后孵育；然后加 入100 μ 1 Tris孵育，磁分離后用100 μ 1的磷酸鹽緩沖液，IOmM清洗，去上清，加入50 μ 1 的IOmM磷酸鹽緩沖液重新懸浮磁珠，4°C保存；MMP探針用于捕獲待檢測(cè)的微量抗原，由于抗原抗體反應(yīng)形成MMP-抗原復(fù)合物；其中，①M(fèi)ES為2-(N-嗎啉)乙磺酸，25Mm，PH6 ；②EDC為1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；③NHS為N-羥基硫代琥珀酰亞胺；b)單克隆二抗、barcodeDNA標(biāo)記納米金-NP探針取200 μ 1的納米金，用碳酸鉀調(diào)節(jié)PH為8. 2，加入30 μ 1的單克隆二抗，放置1個(gè)小時(shí) 后，再加入3μ 1 barcode DNA，孵育M小時(shí)；加5 μ 1的10% PEG8000孵育30min后，依次 加入4 μ 1的0. IM NaCL,0. OlM ΡΒ，使溶液維持一定鹽濃度，4°C保存；PB為磷酸氫二鈉的縮 寫(xiě)；NP探針可與MMP-抗原復(fù)合物反應(yīng)，形成三明治結(jié)構(gòu)，信號(hào)初次放大；c)信號(hào)DNA與納米金構(gòu)筑成金-DNA取Iml納米金溶液4°C、9000rpm離心50min，棄上清，加入97 μ 1滅菌水和3 μ 1信號(hào) DNA到金顆粒中，混合均勻后，4°C靜置12小時(shí)；然后依次加入3μ 1的0. IM PBUM NaCl，總 體積為18 μ 1，每次1小時(shí)，共三次；混合均勻后，4°C靜置48小時(shí)，再加入PB/NaCL混合液 使總體積為Iml ；離心50min后，棄上清，加入100 μ 1的PB/NaCl混合液，4°C保存；所述PB/ NaCl 混合液為 0. OlM PB,0. IM NaCl ；金-DNA與Barcode DNA雜交反應(yīng)，信號(hào)再次放大；(D)檢測(cè)與結(jié)果判讀a)取10μ 1的乙肝表面抗原加入微流體芯片的進(jìn)樣口(1)，與MMP探針室溫孵育30分 鐘，抗原抗體免疫反應(yīng)形成了抗原-MMP復(fù)合物；磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸鹽、 ΡΗ7. 4清洗，將未反應(yīng)的多余抗原沖洗掉，廢液從廢液池( 流走，閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài)；b)加入20μ 1的NP探針，孵育30分鐘，形成了三明治結(jié)構(gòu)NP-抗原-ΜΜΡ，信號(hào)通過(guò)NP 探針上Barcode DNA初次放大；磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmM磷酸鹽緩沖液清洗，將未反應(yīng) 的NP探針沖洗掉，廢液從廢液池( 流走，此時(shí)閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài)；c)去磁場(chǎng)，加入20μ 1 DTT，變性15min;打開(kāi)閥門(mén)B，使釋放的Barcode DNA流入檢測(cè) 區(qū)域，與微流體芯片上DNA雜交；d)同時(shí)將20μ 1金DNA加入進(jìn)樣口(；3)，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片雜交復(fù)合 物，信號(hào)通過(guò)金DNA再次放大，孵育15min后，加入銀染試劑，5min后觀察結(jié)果；e)當(dāng)銀離子遇到DNA-BarcodeDNA-金-DNA復(fù)合物時(shí)，納米金將銀離子還原為銀顆粒， 使銀顆粒沉積放大，通過(guò)肉眼或顯微鏡觀察可見(jiàn)黑褐色顆粒。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于a)步驟A所述的微流體芯片分為捕獲區(qū)域和檢測(cè)區(qū)域，芯片尺寸為75mmX25mm；b)步驟A步驟a)中閥門(mén)的寬度是管道寬度的1.5倍；c)步驟B中步驟b)中涉及的三條DNA探針的序列分別為Barcode DNA :5’ -GTGCCTTGGGTGGCTTTG-PEG9mer_AGCTACGAATAA-(CH2)3-SH-3’信號(hào) DNA:5，-HS-(CH2)3-PoIy (A) 10-TTA TTC GTA GCT-3，芯片 DNA :5，-NH2-poly(A) 16-CAAAGCCACCCAAGGCAC-3d)步驟(C)步驟a)中磁珠的用量為500μg，抗體的用量為5μ g ；e)步驟(C)步驟b)中納米金顆粒大小為13nm，納米金溶液濃度為12.2nM，單克隆二抗 的濃度為0. lmg/ml.；f)所述步驟(C)步驟c)中信號(hào)DNA的濃度為300PM。
4.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于對(duì)于乙肝表面抗原檢測(cè)步驟是(A)微流體芯 片的制備1、硅片為基底材料，甩SU-8光刻膠，曝光、顯影制作管道模具和閥門(mén)模具；2、將PDMS、固化劑以質(zhì)量比為20 1比例混合、除氣泡后澆注在管道模具上，90°C加熱 固化1小時(shí)，制作管道微結(jié)構(gòu)；3、將PDMS、固化劑以質(zhì)量比為10 1比例混合、除氣泡后澆注在閥門(mén)模具上，90°C加熱 固化1小時(shí)，制作閥門(mén)微結(jié)構(gòu)；4、剝離閥門(mén)模具上的PDMS，用打孔針打A、B、C三個(gè)進(jìn)氣孔；然后與管道微結(jié)構(gòu)貼合在 一起；5、然后剝離管道-閥門(mén)粘合體，打2個(gè)進(jìn)樣孔和2個(gè)廢液池孔，并與點(diǎn)有DNA的玻璃片 健合，完成微芯片的制作；(B)檢測(cè)試劑及DNA的準(zhǔn)備a)納米金溶液的制備配置濃度為ImM四氯金酸溶液及濃度為38. SmM的檸檬酸三鈉溶液；將四氯金酸溶液加 熱至130°C，且加熱過(guò)程中攪拌充分，20分鐘時(shí)迅速加入新配好的檸檬酸三鈉溶液25ml，持 續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫，即形成為酒紅色溶液；以0. 22 μ m硝酸纖維尼龍膜過(guò)濾溶液，即 可得到顆粒均勻的13nm納米金溶液，4°C保存?zhèn)溆?；b)DNA鏈的設(shè)計(jì)及合成設(shè)計(jì)了三條DNA探針，一條是Barcode DNA，用于標(biāo)記單克隆二抗，起信號(hào)放大作用；第 二條是信號(hào)DNA，用于標(biāo)記納米金，與Barcode DNA 一部分序列雜交互補(bǔ)反應(yīng)，起信號(hào)放大 作用；第三條是芯片DNA，固定于醛基修飾的玻璃片上，與Barcode DNA另一部分序列雜交 互補(bǔ)反應(yīng)，并進(jìn)行DNA探針的合成；(C)單克隆抗體和DNA的標(biāo)記a)納米磁珠標(biāo)記單克隆一抗-MMP探針將50 μ 1納米磁珠用等量MES清洗，去上清，依次加入50 μ 1 EDC和NHS，孵育后去上 清、清洗；將活化好的磁珠溶于90 μ 1的MES，與5 μ 1單克隆一抗混合均勻后孵育；然后加 入100 μ 1 Tris孵育，磁分離后用100 μ 1的PBS清洗，去上清，加入50 μ 1的PBS重新懸浮 納米磁珠，4°C保存；MMP探針用于捕獲待檢測(cè)的微量抗原，由于抗原抗體反應(yīng)形成MMP-抗 原復(fù)合物；b)單克隆二抗、barcodeDNA標(biāo)記納米金-NP探針取200 μ 1的納米金，用碳酸鉀調(diào)節(jié)PH為8. 2附近，加入30 μ 1的單克隆二抗，放置1個(gè) 小時(shí)后，再加入3 μ 1 barcode DNA，孵育24小時(shí)；加5μ 1的10% PEG8000孵育30min后， 依次加入4μ 1的0. IM NaCL,0. OlM ΡΒ，加三次，使溶液維持一定鹽濃度，4°C保存；NP探針 可以與MMP-抗原復(fù)合物反應(yīng)，形成三明治結(jié)構(gòu)，信號(hào)初次放大；c)信號(hào)DNA與納米金，即金-DNA探針取Iml納米金溶液4°C、9000rpm離心50min，棄上清，加入97 μ 1滅菌水和3 μ 1信號(hào) DNA到金顆粒中，混合均勻后，4°C靜置12小時(shí)；然后依次加入3μ 1的0. IM PBUM NaCl，總 體積為18 μ 1，每次1小時(shí)，共三次；混合均勻后，4°C靜置48小時(shí)，再加入PB/NaCl混合液 使總體積為Iml ；離心50min后，棄上清，加入100 μ 1的PB/NaCl混合液，4°C保存；金DNA可與Barcode DNA雜交反應(yīng)，信號(hào)再次放大；(D)檢測(cè)與結(jié)果a)取10μ1的乙肝表面抗原加入微芯片的進(jìn)樣口(1)，與MMP探針室溫孵育30分鐘， 抗原抗體免疫反應(yīng)形成了抗原-MMP復(fù)合物；在磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmM PBS磷酸鹽、 ΡΗ7. 4清洗，將未反應(yīng)的多余抗原沖洗掉，廢液從廢液池(2)流走，此時(shí)閥門(mén)B、C處于關(guān)閉 狀態(tài)；b)加入20μ 1的NP探針，孵育30分鐘，形成了三明治結(jié)構(gòu)NP-抗原-ΜΜΡ，信號(hào)通過(guò)NP 探針上Barcode DNA初次放大；在磁場(chǎng)作用下，用30 μ 1的IOmMPBS磷酸鹽，ΡΗ7. 4清洗，將 未反應(yīng)的NP探針沖洗掉，廢液從廢液池2流走，此時(shí)閥門(mén)B、C處于關(guān)閉狀態(tài)；c)去磁場(chǎng)，加入20μ 1 DTT，變性15min ；打開(kāi)閥門(mén)B，使釋放的Barcode DNA流入檢測(cè) 區(qū)域，與微芯片上DNA雜交；d)同時(shí)將20μ 1金-DNA加入進(jìn)樣口(；3)，形成金DNA-Barcode DNA-DNA芯片雜交復(fù)合 物，信號(hào)通過(guò)金DNA再次放大，孵育15min后，加入銀染試劑，5min后觀察結(jié)果；結(jié)果是抗原 與磁珠上抗體結(jié)合，然后與NP探針形成三明治結(jié)構(gòu)，通過(guò)Barcode DNA釋放到檢測(cè)區(qū)域，與 互補(bǔ)芯片DNA、金-DNA雜交，銀染顯色。
5.按權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于臨床乙肝血清標(biāo)本檢測(cè)步驟與權(quán)利要求 2或4中A、B、C步驟相同，只是樣品處理時(shí)將臨床血清樣品用小牛血清稀釋，取濃度為Ipg/ ml、10pg/ml、100pg/ml，各取 10 μ 1 加入進(jìn)樣 口 中。
6.按權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法的靈敏度可達(dá)pg/ml，比 臨床中普通的ELISA法高了 1000倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于納米探針的微流體芯片檢測(cè)微量蛋白的方法，其特征在于采用標(biāo)準(zhǔn)的光刻工藝實(shí)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)的制作，用玻璃片(點(diǎn)有DNA探針)與微結(jié)構(gòu)封接制備了所需的微流體芯片；在納米金顆粒上同時(shí)標(biāo)記單克隆二抗及信號(hào)放大作用的Barcode DNA，并在磁珠上標(biāo)記單克隆一抗；在微流體芯片管道內(nèi)，通過(guò)抗原抗體免疫反應(yīng)以及信號(hào)的逐級(jí)放大、銀染顯色，從而達(dá)到對(duì)微量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。所述的方法將生物樣品的富集、分離和檢測(cè)連接為一體，具有特異、快速和高靈敏的特點(diǎn)，可望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中微量蛋白(抗原或抗體)的診斷和檢測(cè)。靈敏度可達(dá)pg/ml，比臨床中普通的LEISA法提高了1000倍。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102147414SQ201010617918
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者張宏蓮, 毛紅菊, 趙建龍, 郭慧, 金慶輝, 陳強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所