一種基于磁珠分離和dna標(biāo)記金納米粒子探針檢測atp含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁珠分離和DNA標(biāo)記金納米粒 子探針檢測ATP含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ATP (三磷酸腺苷）是人體細(xì)胞內(nèi)儲能、供能的重要物質(zhì)。ATP是體內(nèi)重要的能量來 源，是生物體和生命現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能基礎(chǔ)。在物質(zhì)代謝、機(jī)體防御、血液凝固、肌肉收 縮、細(xì)胞信息傳遞、個體生長發(fā)育、組織修復(fù)等方面發(fā)揮著不可替代的作用。當(dāng)人體遇到強(qiáng) 烈刺激，如病菌侵犯、瀕臨死亡等嚴(yán)重情況時，ATP會快速轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷，同時釋放出巨 大的能量，使機(jī)體各系統(tǒng)、各器官迅速獲得強(qiáng)大動力。所以，快速測定ATP的含量，是當(dāng)前生 命分析化學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[Yao W, Wang L, Wang H，et al.An aptamer-based electrochemiluminescent biosensor for ATP detect ion[J]·Bio sensors& Bioelectronics ,2009,24(11) :3269-3274]。文獻(xiàn)報道測定ATP的方法有生物發(fā)光法 [Branchini B R,Southworth T L,Fontaine D M,et al.An enhanced chimeric firefly luciferase-inspired enzyme for ATP detection and bioluminescence reporter and imaging applications[J] .Analytical Biochemistry，2015:148-153]、電化學(xué)法[Bao T, Shu H,ffei ff,et al.A sensitive electrochemical aptasensor for ATP detection based on exonuclease Ill-assisted signal amplification strategy[J].Analytica Chimica Acta,2015,862:64-69]、焚光法[Wang K，Jian L,Yang X，et al .A label-free aptasensor for highly sensitive detection of ATP and thrombin based on metal-enhanced PicoGreen fluorescence[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,63c:172-177 ]、酶聯(lián)吸附分析法[趙秋伶，劉玲玲，楊麗娜.基于核酸適體檢測ATP的酶聯(lián)分析新方法 [J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2014,06:1161-1165]、共振散射光譜法[歐陽輝祥，劉慶業(yè)，梁愛 惠，蔣治良.非標(biāo)記納米銀探針催化共振散射光譜檢測痕量ATP[J].化學(xué)學(xué)報，2011，20 : 2493-2498]等。近年來，基于分子適體的生化分析新方法的研究成為了熱點(diǎn)之一 [Shukoor Μ I,Altman Μ 0,Han D,et al.Aptamer-nanoparticle assembly for logic-based detection[J] .Acs Appl Mater Interfaces，2012,4(6) :3007-3011 ·]，然而，將核酸適體 技術(shù)與結(jié)晶紫(CV)適體電化學(xué)手段結(jié)合對ATP進(jìn)行檢測，至今尚未見文獻(xiàn)報道。為了進(jìn)一步 提高對ATP檢測的靈敏度和選擇性，采用CV適體電化學(xué)信號放大技術(shù)，構(gòu)建了一種高靈敏檢 測ATP的電化學(xué)新方法，并用于運(yùn)動前后小鼠心肌ATP含量的測定。在本發(fā)明中，利用ATP適 體修飾磁珠為分離載體，以電化學(xué)試劑結(jié)晶紫適體、CV、ATP適體互補(bǔ)序列修飾的膠體金CV/ DNA2/DNA3/AuNPs為探針，建立了測定ATP電化學(xué)新方法，該方法對ATP的測定表現(xiàn)出了高的 靈敏度和良好的選擇性。并利用該方法對運(yùn)動前后小鼠心肌ATP含量進(jìn)行了測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在發(fā)明一種方法簡單、成本低、靈敏度高、選擇性好的測定ATP的方法。
[0004] 實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的技術(shù)方案是：
[0005] 首先，將羧基化磁珠(MB)與氨基修飾的ATP適體DNA1結(jié)合生成MB-DNA1復(fù)合物，隨 后使得修飾有SH的CV適體DNA2、ATP適體互補(bǔ)鏈DNA3與納米金結(jié)合，并加入CV生成探針CV/ DNA2/DNA3/AuNPs，然后，MB-DNA1復(fù)合物與探針反應(yīng)，通過DNA1與DNA3結(jié)互補(bǔ)作用，生成探 針修飾的磁珠。接著向探針修飾的磁珠溶液中加入含ATP的樣品溶液，之后進(jìn)行磁分離，取 上清液。隨后，將上清液滴在金納米粒子修飾的電極上。將所得到的電極作為工作電極同參 比電極、指示電極插入電解質(zhì)溶液中，進(jìn)行電化學(xué)測定。由于在電極表面的探針CV/DNA2/ DNA3/AuNPs數(shù)量取決于ATP的濃度，因此CV的電化學(xué)信號隨ATP濃度的增大而增強(qiáng)。根據(jù)電 化學(xué)信號強(qiáng)弱，實(shí)現(xiàn)ATP含量的測定。
[0006] 測定步驟為：
[0007] (1)金納米粒子的制備
[0008] 制備金納米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶等用王水(濃鹽酸 和濃硝酸體積比為1:3)浸泡30分鐘，然后用二次水沖洗干凈，烘干備用。在250mL圓底燒瓶 中加入100mL，0.01 %的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入500yL，1 %的Na3C6H5〇7，再加 熱10分鐘，攪拌15分鐘，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移在棕色瓶中保存。
[0009] (2)探針 CV/DNA2/DNA3/AuNPs 的制備
[0010] 在 2mL 的離心管中加入 10yL 1.0X10-5M 的 DNA3、30yL 1.0X10-5M 的 DNA2 和 10yL pH 5.2的醋酸緩沖溶液以及1 OyL 1 OmM的TCEP反應(yīng)lh。隨后向其中加入制備好的lmL的 AuNPs溶液，放入搖床輕搖反應(yīng)16h。使巰基DNA與AuNPs通過Au-S鍵連接起來，生成DNA2/ DNA3/AuNPs。再向其中加入過量的CV溶液，37°C條件下恒溫反應(yīng)65min，生成探針CV/DNA2/ DNA3/AuNPs〇
[0011] (3)MB-DNA1 的制備
[0012] 取10yL羧基化磁珠至lmL的小離心管管中，并用100yL pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶 液清洗兩遍，并分散于Tris-HCl緩沖溶液中得磁珠懸浮液。將40mM EDC和10mM NHS加到處 理好的磁珠懸浮液中，將該混合物在室溫下輕搖lh。然后，將50yL，5.0 X 10_6M的DNA1加到上 述所得溶液中。在4°C條件下，振動反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，將所得產(chǎn)物經(jīng)過磁性分離，并將得 到的DNA1修飾磁珠產(chǎn)物MB-DNA1分散在lmL pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中。
[0013] (4)ATP 的檢測
[0014] 在1.5mL樣品管中加入制備好的100yL探針CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100yL MB-DNA1溶液，反應(yīng)lh。然后用pH 7.4的磷酸緩沖溶液洗三次，并將其分散在lmL pH7.4的 Tris-HCl緩沖溶液中。然后將含有不同濃度的ATP溶液加入，在37°C條件下反應(yīng)一定時間， 經(jīng)過磁性分離，取磁性分離清液l〇yL均勻滴涂在工作電極上，室溫下靜置1小時，然后進(jìn)行 電化學(xué)測定。在室溫下將三電極體系放在含有10mM K3[Fe(CN)6]和0.5M KC1溶液中進(jìn)行表 征。利用差分脈沖伏安法在含0.1M KC1的pH 8.0的磷酸緩沖溶液中以100mV/s的掃速掃描， 電位掃描范圍為-0.7~0.1 V。
[0015] (5)所使用的儀器與試劑
[0016] CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司）;Anke-TGL-16C飛翁牌高速離心機(jī)(上 海市安亭科學(xué)儀器廠）；Z-82A氣浴恒溫振蕩器(全壇市醫(yī)療儀器廠）；PHS-3D型酸度計(jì)(上海 雷磁儀器廠）；實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KC1) 電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。
[0017] 濃度為25mg/mL的羧基化磁性納米顆粒(粒徑為100nm)溶液購于阿拉丁試劑有限 公司；TCEP(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽）、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等購自上?；瘜W(xué)試劑有限 公司；EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）購自 Sigma公司；氯金酸（HAuCU)，檸檬酸三鈉(Na3C6H5〇7)均購于天津市博迪化工有限公司； Tris-HCl緩沖溶液包含lOOmM Tris，0.1%(v/v)Tween 20和 1M NaCl。
[0018] DNA由賽百盛公司合成，序列如下：
[0019] DNA1:5'-NH2-(CH2)6-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3'（ATP適體）。
[0020] DNA2:5'-SH-(CH2)6-TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCT TTC CCC C-3'（CV 適體）。
[0021] DNA3:5，-SH-(CH2)6-TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCA AAC-3'（ATP適體互補(bǔ) 鏈)。
[0022] 醋酸緩沖溶液組成:醋酸-醋酸鈉溶液。
[0023] 磷酸鹽緩沖液組成:磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液。
【附圖說明】
[0024]圖1測定ATP原理示意圖。
[0025]圖2 MB-DNA1用量(A)，探針用量⑶和ATP與適體結(jié)合時間（C)對信號強(qiáng)度的影響。 [0026]圖3 ATP濃度與信號關(guān)系圖。
[0027]圖4方法測定ATP的選