一種基于蛋白納米線的3d探針-磁性微珠復合物及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫檢測領域，特別涉及一種基于蛋白納米線的3D探針-磁性微珠復合物及其在免疫檢測中的應用。
【背景技術】
[0002]各種傳染性疾病大范圍的流行傳播，對我國的國家安全和人口健康造成嚴重威脅。發(fā)展靈敏、準確的病原分析方法和檢測技術對于相關疾病的快速診斷和及時治療、生物恐怖和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的有效防范和快速處置具有重要意義。經(jīng)典的微生物分離鑒定麻煩費時，難以應用于致病微生物的現(xiàn)場快速檢測;基于病原核酸的檢測方法大多具有較高的檢測靈敏度，但需要復雜的核酸抽提過程，而且容易出現(xiàn)假陽性;免疫學方法因基于抗體對病原的特異性識別作用而具有較好的特異性，同時操作簡單，因此，廣泛應用于臨床和基礎研究的各個領域。
[0003]常規(guī)的免疫分析方法，如ELISA，其過程主要依賴于抗體的特異性捕獲和固相親和分離等過程，因此有著特異性好，背景信號低，靈敏度高等特點。但隨著社會的不斷發(fā)展，在海關、口岸和CDC等進出口人員、貨物密集交通的地方，對現(xiàn)場、快速、高靈敏的病原檢測有著非常高的要求，也是國家疾病防控的重要關口。目前，常規(guī)的ELISA檢測中，固定蛋白探針是通過物理吸附作用，使得蛋白探針隨機取向，且吸附作用是在二維平面上的，其固定密度較低，導致捕獲檢測物的效率降低而限制其靈敏度;在操作過程中，包被、封阻、結合、洗滌需要花費大量時間，限制了對樣品的現(xiàn)場檢測。而快速免疫分析方法，如試紙條等，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，但由于該方法通常通過肉眼識別納米金聚集顯色，其靈敏度更是低于ELISA。針對于此，我們亟需開發(fā)一種快速、高靈敏的免疫檢測方法。
[0004]現(xiàn)有提高蛋白探針固定有效方向和密度而調(diào)高靈敏度的方法有:親和作用(Analytical Chemistry,1999,71(17): 3846-3852.)、娃納米線介導(Natureb1technology ,2005,23(10): 1294-1301.)、病毒納米顆粒介導(Nature nanotechnology,2009，4(4): 259-264.)、巨磁阻介導(Nature nanotechnology，2011,6(5): 314-320.)等。
[0005]親和作用介導的固定法是通過親和素-生物素系統(tǒng)，使得探針的固定隨機性降低，從而提高有效探針密度;硅納米線介導的固定法是在硅納米線表面修飾上醛基，將抗體探針通過氨基與醛基形成化學鍵而在其表面展示，達到高密度的固定;病毒納米顆粒介導的固定法是將SPA融合在病毒衣殼蛋白亞基上，通過SPA與抗體的作用而展示抗體，另外通過病毒衣殼蛋白上的His-tag與鎳納米陣列作用，達到高密度的固定;巨磁阻介導的固定法是利用親和素-生物素系統(tǒng)將抗體結合在磁顆粒上，磁顆粒通過巨磁阻效應固定在界面上，從而達到抗體探針的高密度展示。
[0006]上述方法中，提高蛋白探針的固定密度主要通過兩種途徑來實現(xiàn):一、通過特異性的固定代替隨機的物理吸附；二、提高固定蛋白探針的數(shù)量。前者提高探針數(shù)量有限，如親和作用介導的固定只能在一定程度上解決探針隨機取向的問題，并不能提高真實探針密度；而病毒納米顆粒介導的固定法受限于病毒顆粒的大小，固定的探針數(shù)量有限，且His-tag與鎳的作用不穩(wěn)定。后者需要通過復雜的化學修飾過程，或者需要復雜的儀器和操作步驟，成本高昂，如納米材料雖然能夠提高比表面積，但其修飾方法隨機、復雜，且在修飾過程中會損傷蛋白探針的生物活性，導致捕獲能力降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術問題是提供一種快速、高靈敏的免疫檢測產(chǎn)品及方法，實現(xiàn)高效、高密度的在三維(3D)空間上的免疫檢測。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0009]本發(fā)明一方面提供一種基于蛋白納米線的3D探針-磁性微珠復合物，包括磁性微珠和蛋白納米線，所述蛋白納米線通過成線蛋白自組裝形成，且所述蛋白納米線表面包括至少一種功能配體和至少一種連接配體，所述蛋白納米線通過連接配體連接在磁性微珠表面。
[0010]本發(fā)明中，所述磁性微珠是指具有一定磁性及特殊表面結構的納米或微米尺度的微球，其可由無機磁性物質(zhì)及各種含活性功能基團的材料組合而成。其中，所述無機磁性材料包括磁性納米/微米材料或磁性納米/微米復合材料，優(yōu)選的，所述磁性納米/微米材料包括磁性元素(如鐵、鈷、鎳、釹、硼、錯、絡等)摻雜的納米/微米材料，例如，氧化鐵(Y-Fe2O3,γ -Fe304)、鐵氧體(CoFe204，BaFei20i9)、氧化絡(Cr02)、氧化錯(Zr02)、氮化鐵(Fe4N)、金屬合金(Fe、Co、N1、Al)等。所述含活性功能基團的材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙醇酸、聚丙烯酸、硅烷衍生物等合成高分子材料或纖維素及其衍生物、瓊脂糖、明膠、葡聚糖、殼聚糖及其衍生物、透明質(zhì)酸、海藻酸等天然高分子材料。
[0011 ]本發(fā)明中，磁性微珠一方面可在外加磁場的作用下快速定位、導向和分離，另一方面可通過表面改性或化學聚合等賦予磁性微珠表面多種活性功能基團，如羥基、羧基、醛基、氨基等，此外，磁性微珠也可以通過共價鍵來結合抗體、細胞、DNA等生物活性物質(zhì)。
[0012]在本發(fā)明一【具體實施方式】中，所述成線蛋白為含有能夠組裝成線性納米結構自組裝結構域的蛋白，例如可為酵母朊蛋白Sup35、淀粉樣蛋白Ure2、絲素蛋白等。優(yōu)選的，成線蛋白為酵母朊蛋白，311?35的第1-61位氨基酸為自組裝結構域。
[0013]在本發(fā)明一【具體實施方式】中，所述功能配體和連接配體可相同或不同，并獨立的選自以下組中的一種或多種:抗原、具有特異性結合能力的功能化抗體、蛋白A(Protein A，SPA)、蛋白G(Protein G，SPG)、SPL蛋白、本周蛋白(BJP)、β2_巨球蛋白(f32m)、降鈣素(CT)、人絨毛膜性腺激素(hCG)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTG)、甲狀腺激素(PHT)、熒光蛋白、生物素和未和素等。
[0014]本發(fā)明中，所述抗原包括與自身免疫缺陷、惡性細胞或癌癥相關的抗原、病毒抗原或微生物抗原，包括但不限于，能夠引起免疫應答的任何病毒肽、微生物肽、多肽蛋白、糖類、多糖脂質(zhì)分子，如 HIV-p24、HIV-gp41、HIV-gpl20、HIV-gpl60、HIV-nef、HAl、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HBsAg、HBcAg、EboIa、EV71、SV40、HTLV-1、CBV、EB、SARS、CEA、AFP、PSA、POA、PSCA、PSMA、CA125、CA19-9、CAl5-3、CA50、CA242、TNF-α、RSV-F、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD56、CD70、CD79、CD79b、CD90、CD125、CD134、CD147、CD152/CTLA-4等。
[0015]本發(fā)明中，可通過連接配體將蛋白納米線與磁性微珠相連，蛋白納米線結合磁性微珠大的比表面積形成3D結構，提高固定密度;通過融合在蛋白納米線上的功能配體實現(xiàn)與目標分子的特異性結合，提高抗原或抗體等固定取向性，從而進行抗體篩選或病原或疾病檢測。
[0016]優(yōu)選的，所述連接配體為生物素。
[0017]優(yōu)選的，所述功能配體選自抗原、SPA、SPG或SPL等，優(yōu)選自以下組中的一種或多種:HIV-p24、HIV-gp41、HIV-gpl20、HIV-gpl60、HIV-nef、HAl、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HBsAg、HBcAg、EboIa、EV71、SV40、HTLV-1、CBV、EB、SARS、CEA、AFP、PSA、POA、PSCA、PSMA、CAl25、CAl9-9、CAl5-3、CA50、CA242、SPA、SPG等。
[0018]在本發(fā)明一【具體實施方式】中，所述蛋白納米線通過生物素-親和素相互作用、化學共價交聯(lián)(例如表面羧基功能化的磁性微珠與蛋白納米線上的氨基共價交聯(lián)，過渡金屬離子如Co、N1、Cu、Zn等離子與特定氨基酸側鏈之間的相互作用，如天然組氨酸標簽HAT、聚組氨酸標簽His tag與NTA-Ni(亞硝基三乙酸-鎳)或Co-CMA(鈷-羧甲基天冬氨酸)之間的相互作用、GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)的結構域與蛋白之間的相互作用、纖維素結構域與纖維素之間的相互作用或者其它相互作用多肽)、特異性DNA-蛋白相互作用(例如表面特異性DNA功能化的磁性微珠與特異性蛋白融合的蛋白納米線相互作用)或其它高親和力和強特異性結合的方式連接在磁性微珠表