專利名稱：一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法。
背景技術(shù)：
Exendin-4，胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)受體激動劑，是從一種巨蜥唾液中提取的由39個氨基酸殘基組成的生物活性多肽，與GLP-I具有一系列相同的抗糖尿病作用，其氨基酸序列如下所示His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-SerExendin-4能夠刺激胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，其調(diào)節(jié)作用具有血糖濃度依賴性。Exendin-4在生物體內(nèi)具有更長的生物學(xué)半衰期和更強的生物學(xué)活性，因此是治療2型糖尿病的理想藥物。目前獲得Exendin-4的方法主要為化學(xué)合成法和基因工程重組法。2005年4月，化學(xué)合成的腸降血糖素類似物Exenatide (酰胺化的Exendin-4)經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市，主要用于改善二甲雙胍和磺酰脲類藥物治療不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。目前，生物樣品常用的分析方法包括色譜法和免疫法。色譜法靈敏度較低，不能達到臨床和非臨床試驗要求；而且色譜法需要將血樣進行預(yù)處理(如過C18色譜柱)，試驗過程繁瑣，回收率不穩(wěn)定。免疫法是指以特異性抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法，是當(dāng)前臨床和非臨床生物樣品檢測方法中最為常用的一種，多用于蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)的檢測。免疫法依據(jù)不同的標(biāo)記物可分為放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。放射免疫分析法(RIA)是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法，由于敏感度高、特異性強、精密度高、并可測定小分子量和大分子量物質(zhì)，所以在檢驗醫(yī)學(xué)中應(yīng)用極為廣泛，常用于測定各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物等。但由于核素的放射性對人體有一定的危害性，必須加以防護，核素實驗室的建設(shè)須經(jīng)防疫部門的監(jiān)督，操作人員須經(jīng)過特殊訓(xùn)練。另外，由于核素有半衰期，有效期較短，因而放射免疫分析在應(yīng)用中有諸多不便之處。酶免疫分析法(EIA)是將酶的高效催化作用和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合，發(fā)展建立起來的一種免疫性標(biāo)記分析方法。酶的催化作用可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。酶免疫分析法試劑制備容易掌握，半衰期長，實驗操作簡便，試劑對環(huán)境污染小，并且測定的特異性和靈敏度高，因此已廣泛應(yīng)用于臨床和非臨床檢測。酶免疫分析法的底物分為普通顯色底物、熒光底物等。目前，普通顯色底物應(yīng)用廣泛，但靈敏度較低，達不到臨床和非臨床試驗要求。熒光底物具有靈敏度高、選擇性強、需樣量少和方法簡便等優(yōu)點，因此越來越多的應(yīng)用于分析檢測方法中。熒光底物在吸收特定波長的光能后，發(fā)生原子重排，同時發(fā)射出更長波長的熒光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強度，在熒光酶標(biāo)儀下可以檢測到。熒光分析利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通分析法中雜色光的影響，從而提高了光學(xué)分析的靈敏度?，F(xiàn)在常用的過氧化物酶的熒光底物包括對羥基乙酸(HPA)，3-對羥基苯丙酸(HPPA)，高香草酸(HAV)，佳味醇(CV)等。用于檢測蛋白多肽類抗原的酶免疫分析法主要是雙抗體夾心法和競爭法。蛋白大分子抗原測定多用雙抗體夾心法，而對只有單個抗原表位的小分子激素、藥物等，因其可能只有一個抗原表位，或因為分子太小，結(jié)合一個抗體后，因空間位阻，無法再結(jié)合另一個抗體，所以不適合使用雙抗體夾心方法測定。由于Exendin-4為含有39個氨基酸殘基的小分子多肽，很難找到兩個獨立的抗原決定簇，不適合使用雙抗體夾心方法測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可應(yīng)用于臨床和非臨床樣品定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法，本發(fā)明所述方法條件優(yōu)化，靈敏度高，特異性強。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法，包括以下步驟步驟1 用第二抗體包被酶標(biāo)板，洗板，BSA封閉，洗板；步驟2 加抗Exendin-4第一抗體孵育，洗板；步驟3 加Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，并設(shè)立對照，加生物素標(biāo)記Exendin-4孵育， 洗板；步驟4 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，洗板；步驟5 加pH7. 5的PBS配制的0. 5_2mg/ml HPPA和過氧化物溶液的混合液避光孵育，加甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)；步驟6 于熒光酶標(biāo)儀上讀取相對熒光單位值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的相對熒光單位值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中Exendin-4含量。本發(fā)明所述酶免疫分析方法采用競爭抑制法對Exendin-4進行檢測，競爭抑制法的原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。本發(fā)明所述酶免疫分析方法具體程序為將第二抗體吸附于固相載體表面，孵育后洗板；加抗Exendin-4的第一抗體孵育后洗板，加入可能含抗原的待檢溶液和生物素標(biāo)記Exendin-4，孵育后洗板；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，孵育后洗板，加入辣根過氧化物酶作用的底物HPPA及過氧化物，反應(yīng)產(chǎn)生熒光，以甘氨酸緩沖液終止酶反應(yīng)，同時使熒光增強。HPPA脫氫生成一種熒光物質(zhì)DPDPA，該熒光物質(zhì)吸收320nm波長的光能后，發(fā)生原子重排，發(fā)射出405nm波長的光，在熒光酶標(biāo)儀下檢測相對熒光單位(RFU)值。根據(jù)已知Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的RFU值分別標(biāo)于X-軸(對數(shù)標(biāo)度) 和Y-軸(線性標(biāo)度)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適模型為四參數(shù)方程模型，經(jīng)四參數(shù) Logistic函數(shù)曲線模型擬合，求得曲線斜率，IC50，及上下端漸進線間的線性范圍，其數(shù)學(xué)模型為
(A1-A2)Υ = [ι+(χιχογγΑ1
函數(shù)中Al為曲線的上端漸近線的估計值，A2為曲線下端漸近線的估計值，P為校正曲線的斜率，X0(IC50)為50%吸光度所對應(yīng)的樣品濃度值，通過擬合最優(yōu)即擬合誤差最小的曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而計算出未知樣品濃度。Exendin-4濃度對數(shù)值與相應(yīng)RFU值呈反S型的負相關(guān)，即當(dāng)Exendin-4濃度升高時，RFU值下降。本發(fā)明基于競爭抑制法的以上原理，對待測樣品中Exendin-4含量進行定量檢測，檢測范圍為10-400pg/ml。作為優(yōu)選，所述第二抗體濃度為5-30 μ g/ml。第二抗體簡稱二抗，是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗結(jié)合的抗體。二抗需與一抗的類別或亞類相匹配，如一抗是IgG類免疫球蛋白，相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體；如果一抗是小鼠IgG，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。在本發(fā)明的具體實施方式
中，抗 Exendin-4第一抗體為鼠源IgG，可選用的第二抗體為羊抗鼠IgG ；抗Exendin-4第一抗體為兔源IgG，可選用的第二抗體為羊抗兔IgG。競爭性酶免疫分析方法常規(guī)選用一抗進行包被，但是包被用抗體一般是過量的， 用量大，成本高。本發(fā)明選用成本很低的二抗進行包被，可節(jié)省成本。同時，用二抗包被可以提高方法的精密度和準(zhǔn)確度，減少各孔之間的差異。常規(guī)選用一抗包被時，可能因為包被條件、清洗處理等各種因素而使該抗體包被量有所差異，影響試驗結(jié)果。本方法先用過量的第二抗體包被固相載體，封閉后再加入等量的一抗，過量的第二抗體即使在數(shù)量上有所差異，也仍能保留足夠的位點與第一抗體結(jié)合，這樣即可避免孔間第一抗體數(shù)量上的差異，大大提高試驗結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。作為優(yōu)選，所述生物素標(biāo)記Exendin-4濃度為1 μ g/ml。作為優(yōu)選，所述Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的基質(zhì)選自血清、血漿。作為優(yōu)選，底物HPPA濃度為1. 25mg/ml。作為優(yōu)選，所述過氧化物溶液為30%雙氧水。所述Exendin-4可通過基因工程重組或化學(xué)合成，是一種由39個氨基酸殘基組成的生物活性多肽。對本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4酶免疫分析方法的重復(fù)性、特異性、方法穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果顯示，板內(nèi)和板間5次重復(fù)檢測的精密度均小于15%，準(zhǔn)確度均在士 15% 以內(nèi)；樣品的回收率在85-115%之間，精密度小于15% ；高、中、低濃度質(zhì)控樣品凍融1次后、室溫放置8小時、或者在-70°C放置3個月后，分別重復(fù)測定，結(jié)果顯示高濃度與中濃度的精密度均小于15%，低濃度的精密度均小于20% ；高濃度與中濃度的準(zhǔn)確度均在士 15% 以內(nèi)，低濃度的準(zhǔn)確度均在士20%以內(nèi)。對底物HPPA優(yōu)化結(jié)果顯示本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4酶免疫分析方法的底物HPPA的最佳濃度為1. 25mg/ml，用緩沖液為pH7. 5的PBS進行配制，達到最佳檢測效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述酶免疫分析方法具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法靈敏度可以達到10pg，靈敏度來自酶的放大效應(yīng)、生物素親和素系統(tǒng)以及熒光底物HPPA的選擇及優(yōu)化，從而根據(jù)顯色反應(yīng)現(xiàn)象進行檢測分析，解決了臨床和非臨床藥代動力學(xué)試驗中Exendin-4含量檢測的問題。2、本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法采用競爭法進行檢測，符合Exendin-4為小分子多肽的特點。3、本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法特異性強，其特異性來自抗體或抗原的選擇性，抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，符合臨床和非臨床試驗的要求。4、本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法用第二抗體包被酶標(biāo)板，封閉后再加入等量的一抗，與常規(guī)的一抗包被酶標(biāo)板相比，不僅大大提高試驗結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，減少各孔之間的差異，還降低了成本；另外，選用HPPA作為熒光底物，進一步降低了檢測成本，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法測定血漿Exendin-4濃度的四參數(shù)函數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2示本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法中不同濃度底物HPPA 的RFU值；圖3示本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法中由不同pH值的PBS 作為底物HPPA緩沖液對發(fā)光的影響。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例1 本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法檢測樣品中 Exendin-4 含量1.試劑配制1)包被緩沖液(ρΗ9· 6、0· 05Μ碳酸鹽緩沖液)Na2CO3 1. 59gNaHCO3 2. 93g加蒸餾水至1000ml。2)緩沖液 PBS (ρΗ7· 4，0. 1Μ)KH2PO4 0. 2gNa2HPO4 1. 44gNaCl8. OgKCl0. 2g加蒸餾水至1000ml。
3)洗滌緩沖液 PBST(pH7. 4PBS+0. 05% Tween-20)IL PBS 中加入 Tween-200. 5ml。4)封閉液(含 1-5% B SA 的 PBST) 牛血清白蛋白(BSA) 0. 1-0. 5g加洗滌緩沖液至IOml。5)底物終止液(甘氨酸緩沖液):50ml 0. 2M 甘氨酸，加入 IM NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 10. 3，稀釋至 200ml。2具體試驗步驟1).包被。用包被緩沖液(pH9.6，50mM)稀釋羊抗鼠IgG純化抗體，濃度為 5-30yg/ml，每孔加入100 μ 1，封膜，置于4°C冰箱中過夜。2).洗板。第二天，將酶標(biāo)板從4°C冰箱中取出，倒掉孔內(nèi)溶液，用PB ST緩沖液 (0. 05% Tween-20)洗板 3 次，每次 5min。3).封閉。每孔加入200 μ 1的1-5%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，室溫孵育lh。 洗板，方法見步驟2)。4).加鼠抗 Exendin-4 抗體(購自 Abcam，貨號:ab23407，批號=712880) 除空白對照孔外，其余各孔均加入50 μ 1鼠抗Exendin-4抗體(1 2000稀釋)。室溫孵育lh。洗板，方法見步驟2)。5).加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品。分別取50 μ 1不同濃度的Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品(用空白人血漿系列稀釋 3. 14mg/ml Exendin-4 標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為 10000、1000、500、100、10、lpg/ml)、 待測樣品，加入預(yù)先設(shè)計的孔內(nèi)，PB ST緩沖液作為陰性對照，并設(shè)陽性對照孔。6).加生物素標(biāo)記Exendin-4。除空白對照孔外，其余各孔加入25μ 1濃度為1 μ g/ ml的生物素標(biāo)記Exendin-4，室溫孵育1. 5h。洗板，方法見步驟2)。7).加酶標(biāo)鏈霉親和素(Str印tavidin/HRP)。各孔加入100μ 1 1 1000稀釋的酶標(biāo)鏈霉親和素，室溫孵育lh。洗板，方法見步驟2)。8) ·加底物。HPPA底物液(濃度為0. 5_2mg/ml，用ρΗ7· 5的PB S緩沖液進行配制)和30%雙氧水混合，各孔加入100 μ 1，室溫避光孵育lh。9).加終止液。各孔加入100 μ 1甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)。輕輕敲打熒光酶標(biāo)板， 使其混合均勻，20分鐘內(nèi)進入下一步驟。10).讀數(shù)。將酶標(biāo)板置于熒光酶標(biāo)儀上，讀取各孔的RFU值。激發(fā)(excitation) 和發(fā)射(emission)波長分別為320和405nm。3結(jié)果計算將已知Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的RFU值分別標(biāo)于X-軸(對數(shù)標(biāo)度)和
Y-軸(線性標(biāo)度)，見圖1，結(jié)果說明Exendin-4濃度對數(shù)值與相應(yīng)RFU值呈反S型的負相
關(guān)，即當(dāng)Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度升高時，RFU值下降。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適模型為四參數(shù)方程模
型，經(jīng)四參數(shù)Logistic函數(shù)曲線模型擬合，求得曲線斜率，IC50，及上下端漸進線間的線性
范圍。其數(shù)學(xué)模型為
(A1-A2)Υ = [ι+(χιχογ]+Α2函數(shù)中Al為曲線的上端漸近線的估計值，Α2為曲線下端漸近線的估計值，P為校正曲線的斜率，X0(IC50)為50%吸光度所對應(yīng)的樣品濃度值，通過擬合最優(yōu)即擬合誤差最小的曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而計算出未知樣品濃度。實施例2 本發(fā)明所述定量檢測Exendin-4酶免疫分析方法的重復(fù)性制備高、中、低三個濃度(100、50和25pg/ml)的質(zhì)控樣品，板內(nèi)每個質(zhì)控濃度重復(fù)測定5次；板間每個質(zhì)控濃度重復(fù)測定5次；計算方法的板內(nèi)及板間精密度、準(zhǔn)確度。精密度用變異系數(shù)(CV)表示，結(jié)果見表1-2。結(jié)果表明，板內(nèi)和板間5次重復(fù)檢測的精密度均小于15%，準(zhǔn)確度均在士 15%以內(nèi)。表1.方法的板內(nèi)重復(fù)性
權(quán)利要求
1.一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法，包括以下步驟 步驟1 用第二抗體包被酶標(biāo)板，洗板，B SA封閉，洗板；步驟2 加抗Exendin-4第一抗體孵育，洗板；步驟3 加Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，并設(shè)立對照，加生物素標(biāo)記Exendin-4孵育，洗板；步驟4 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，洗板；步驟5 加pH7. 5的PBS配制的0. 5-2mg/ml HPPA和過氧化物溶液的混合液避光孵育， 加甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)；步驟6 于熒光酶標(biāo)儀上讀取相對熒光單位值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的相對熒光單位值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中Exendin-4含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，所述第二抗體濃度為 5-30 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，所述Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的基質(zhì)選自血清、血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，生物素標(biāo)記Exendin-4濃度為 1 μ g/mlο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，HPPA濃度為1.25mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，所述過氧化物溶液為30%雙氧水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶免疫分析方法，其特征在于，Exendin-4為通過基因工程重組或化學(xué)合成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種定量檢測Exendin-4的酶免疫分析方法，包括第二抗體包被酶標(biāo)板，BSA封閉；加抗Exendin-4第一抗體孵育；加Exendin-4標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，并設(shè)立對照，加生物素標(biāo)記Exendin-4孵育；加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育；加pH7.5的PBS配制的0.5-2mg/ml HPPA和過氧化物溶液的混合液避光孵育；加甘氨酸緩沖液終止反應(yīng)，于熒光酶標(biāo)儀上讀取相對熒光單位(RFU)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)的RFU值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中Exendin-4含量。本發(fā)明所述方法靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好，成本低，可廣泛應(yīng)用于臨床和非臨床樣品Exendin-4含量的檢測。
文檔編號G01N33/543GK102175872SQ201010620868
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者周青青, 曹衛(wèi)榮, 王曉婧, 竇燕峰, 解鳳立, 解茹, 趙麗艷, 趙艷娥, 鄒衛(wèi) 申請人:石藥集團中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司