檢測辛硫磷的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測辛硫磯的酶聯(lián)免疫試劑 盒，其適用于飼料（原料、配合料、濃縮料）中辛硫磯測定。 技術背景
[0002] 辛硫磯又稱巧硫磯、倍臘松、臘巧磯.易與±壤中有機質結合.適合于防治地下害 蟲.對危害農作物、果樹、蔬菜、桑、茶等作物的多種鱗翅目害蟲的幼蟲有良好的防治效果. 對蟲卵也有一定的殺傷作用。目前.辛硫磯作為高效、廣普、低毒的殺蟲劑.被認為是甲胺 磯、樂果等高毒農藥的替代品.在當前應用較廣.我國對辛硫磯的檢測限量標準有GB 14858 1994。為評價辛硫磯施用后的環(huán)境行為有必要研究辛硫磯在玉米深加工產品如蛋白 粉、蛋白飼料中的殘留檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于辛硫磯含量測定的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡 單，適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。
[0004] 本發(fā)明試劑盒，它包括： (1) 包被有辛硫磯偶聯(lián)抗原的酶標板； (2) 辛硫磯標準品溶液； (3) 濃縮酶結合物； (4) 酶結合物稀釋液； (5) 底物顯色液； (6) 終止液。
[0005] 所述辛硫磯偶聯(lián)抗原為辛硫磯半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白可為卵 清蛋白、牛血清白蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。
[0006] 所述辛硫磯半抗原制備過程： 1)取20mg辛硫磯，lOul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基化巧溶解于2ml N，Ν'-二甲基甲醜胺中，得到I液； 2) 取20mg Ν，Ν' -二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0. 5mlDMF中，得到II液； 3) 在0°C條件下，將II液緩慢滴加至I液中，恢復室溫后，繼續(xù)反應20 h ; 4)蒸除溶劑，柱層析（洗脫液二氯甲焼/甲醇，體積比20 ;1)，得到辛硫磯半抗原。
[0007] 所述濃縮酶結合物為酶標記的辛硫磯單克隆抗體，所述標記酶為辣根過氧化物 酶；酶結合物是采用過賄酸鋼法將標記酶與抗體進行偶聯(lián)得到的。
[0008] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括辛硫磯標準品溶液、酶 結合物稀釋液、底物顯色液、終止液。
[0009] 所述的終止液為廣2mol/L的硫酸或鹽酸溶液，所述底物顯色液由底物液A液和底 物液B液組成，底物液A液為過氧化脈溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。
[0010] 所述的酶結合物稀釋液為PH7. 2~7. 4,0. 5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L的磯酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量百分比。
[0011] 其中酶標板在制各過程中所用的包被緩沖液為PH9. 6,0.1mol/L碳酸鹽緩沖液， 所用封閉液為PH7. 2~7. 4,0. 5%~1%牛血清白蛋白，0.1mol/L磯酸鹽緩沖液，所述百分 比為重量百分比。
[0012] 本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成0.廣0.化g/ml，每 孔加入100 ul，37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用洗涂液洗涂2次，每次30s，拍干，然 后在每孔中加入150~200ul封閉液，37°C溫育廣化，傾去孔內液體拍干，干燥后用鉛膜真空 密封保存。
[0013] 本發(fā)明的檢測原理為： 當在微孔條上預包被辛硫磯偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標準品溶液后，樣本中殘留的 辛硫磯與酶標板上預包被的辛硫磯偶聯(lián)抗原競爭辛硫磯的酶結合物，用底物顯色液顯色， 樣本吸光值與所含辛硫磯的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中辛硫磯的含 量。同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的辛硫磯標準品溶液顏色的比較可粗略判 斷樣品中辛硫磯的濃度范圍。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒辛硫磯的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進行檢測； (3) 分析檢測結果。
[0015] 本發(fā)明檢測辛硫磯的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭化ISA方法檢測樣品中辛硫 磯的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品，主 要試劑W工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、準確度高、精確 度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，攜帶便利、使用方便、結構簡單、檢測方法快速、簡 便、適于大批量樣品篩選。
【附圖說明】
[0016] 圖1為辛硫磯半抗原結構式。
[0017] 圖2為試劑盒的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，送些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范闡。
[0019] 實施例1試劑盒組分的制備 1、辛硫磯半抗原制各 1) 取20mg辛硫磯，lOul，1,3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基化巧溶解于2mlN，N' -二 甲基甲醜胺中，得到I液； 2) 取20mg N，Ν'-二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0. 5mlDMF中，得到II液； 3) 在0°C條件下，將II液緩慢滴加至I液中，恢復室溫后，繼續(xù)反應20 h ; 4)蒸除溶劑，柱層析（洗脫液二氯甲焼/甲醇，體積比20 ;1)，得到辛硫磯半抗原，如 圖1。
[0020] 2、抗原的制備 免疫原制備一辛硫磯半抗原與牛血清白蛋白度SA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0021] 1)取辛硫磯半抗原5. 3mg用0. 5ml DMF溶解，得到I液； 2) 取BSA 30mg用2. 0ml，pH7. 0,0.1mol/L磯酸鹽緩沖液溶解，得到II液； 3) 取碳化二業(yè)胺（邸C) lOmg用0. 5ml，pH7. 0,0.1mol/L磯酸鹽緩沖液溶解，得到III 液： 4) 將I液與II液混合，在攬拌下緩慢滴加入III液，室溫反應2小時，4°C透析二天， 每天換液Η次，得到免疫原。
[0022] 包被原制備--辛硫磯半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到包被原。
[002引 1)取辛硫磯半抗原5. 3mg用0. 5ml DMF溶解，得到I液； 2) 取OVA 18mg用2. 0ml，pH7. 0,0.1mol/L磯酸鹽緩沖液溶解，得到II液； 3) 取邸ClOmg用0. 5ml，pH7. 0,0.1mol/L磯酸鹽緩沖液溶解，得到III液： 4) 將I液與II液混合，在攬拌下緩慢滴加入ΙΠ 液，室混反應2小時，4°C透析二天，每 天換液Η次，得到包被原。
[0024] 3、辛硫磯單克隆抗體的制備 a.動物免疫 將上述步驟得到的免疫抗原注入到Ba化/c小鼠體內，免疫劑最為150ug/只，使其產生 抗血清。
[0025] b.細胞融合和克隆化 取免疫Bal b/c小鼠脾細胞，按9:1(數(shù)最配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合篩選得 到穩(wěn)定分泌髓辛硫磯單克隆抗體的辛硫磯單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0026] C.細胞凍存和復蘇 將雜交瘤細胞用凍存液制成1X1 〇9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時 取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離必去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。
[0027] d.單克隆抗體的制各與純化 增量培養(yǎng)法：將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37Γ條件下進行培養(yǎng)，用辛酸一飽 和硫酸倭法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-2(TC保存。
[002引 4、酶標板的制備 用包被緩沖液將包被原稀釋成0.廣0.化g/ml，每孔加入100 U 1，37°C溫育化或4°C過 夜，傾去包被液，用洗涂液洗涂2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入1 50-200 U 1封閉 液