一種檢測(cè)雞肉組織中孕酮?dú)埩舻拿嘎?lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種檢測(cè)激素類孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適用于雞肉中孕酮?dú)埩舻臋z測(cè)。
技術(shù)背景
[0002]孕酮亦稱為黃體酮、孕留酮、黃體留酮、黃體激素、助孕激素、助孕素或助孕酮是一種涉及女性月經(jīng)周期、妊娠和對(duì)人類還又其他動(dòng)物的胚胎有影響的類固醇。孕酮是一種女性荷爾蒙，參與人類與其他動(dòng)物的雌性月經(jīng)周期，支援懷孕與胚胎形成。孕酮是屬于一類稱為孕激素的荷爾蒙，也是人類最重要的孕激素。激素類藥物可提高畜食的飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而達(dá)到增重的目的，但因孕酮在體內(nèi)殘留會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，如性征變化，早熟等，對(duì)兒童和青少年作用更為明顯。目前，激素類物質(zhì)已被大部分國(guó)家禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用，并不得在食品中檢出。但國(guó)內(nèi)對(duì)畜產(chǎn)品中孕酮等違禁藥物殘留的檢測(cè)幾乎是空白，根據(jù)我國(guó)對(duì)動(dòng)物源產(chǎn)品殘留監(jiān)控規(guī)定及有關(guān)進(jìn)口國(guó)的要求，研究各種檢測(cè)方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003]目前，檢測(cè)孕酮?dú)埩袅康姆椒ㄖ饕歉咝б合嗌V法(HPLC)，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程以及對(duì)檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足提供一種用于雞肉中孕酮?dú)埩魴z測(cè)酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡(jiǎn)單適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選。
[0005]本發(fā)明試劑盒，它含有:
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；
(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記半抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；
(3)孕酮抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗原時(shí)含有)；
(4)孕酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(5)底物顯色液；
(6)終止液；
(7)濃縮洗滌液；
(8)濃縮復(fù)溶液。
[0006]本發(fā)明提供的檢測(cè)孕酮?dú)埩袅康拿缆?lián)免疫試劑盒，包括孕酮特異性抗體工作液及預(yù)包被包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物工作液，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記孕酮半抗原或酶標(biāo)記孕酮特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
[0007]所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用混合酸酐或碳化二亞胺法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
[0008]所述孕酮特異性抗體為孕酮單克隆抗體，他們均是用孕酮半抗原與載體蛋白采用混合酸酐法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的，所述孕酮單克隆抗體優(yōu)選孕酮鼠單克隆抗體。
[0009]為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括孕酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
[0010]所述洗滌液優(yōu)選濃縮洗滌液為pH7.1—7.7，含有0.8%~1.2%吐溫80和
0.03—0.05%硫柳汞防腐劑，0.02—0.04mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0011]當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，底物顯色液A為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，底物顯色液B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為l~2mol/L硫酸或鹽酸緩沖液；
所述復(fù)溶液為含有0.08—0.12%吐溫20、3—8%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過(guò)程為用緩沖液將包被原稀釋成0.2~0.3μ g/ml，每孔加入100 μ L，37°C溫育2h或4°C過(guò)夜，傾去包被液，用稀釋后的洗滌液洗滌兩次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入15(T200yL封閉液，37°C溫育l~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0012]本發(fā)明中抗原的合成過(guò)程:
1.半抗原的合成
孕酮半抗原是將孕酮和琥珀酸酐通過(guò)反應(yīng)得到的；
2.孕酮抗體的制備
將孕酮半抗原與載體蛋白采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
[0013]本發(fā)明所述試劑盒中孕酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液；標(biāo)注品溶液6瓶，為0μ g/L，0.3μ g/L，
0.9 μ g/L, 2.7 μ g/L, 8.1 μ g/L, 24.3 μ g/L。
[0014]本發(fā)明的檢測(cè)原理為:
當(dāng)在微孔條上預(yù)包被孕酮抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，隨即加入酶標(biāo)二抗，再加入孕酮特異性抗體溶液，樣本中殘留的孕酮與酶標(biāo)板上包被的孕酮抗原競(jìng)爭(zhēng)孕酮特異性抗體，酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與孕酮的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可粗略判斷樣品中孕酮?dú)埩袅康臐舛确秶?br>[0015]本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)雞肉中孕酮?dú)埩舻姆椒?，它包括步驟:
(1)樣品前處理；
(2)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；
(3)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0016]樣本前處理主要是為了從樣本中獲得孕酮溶液，從而用于后續(xù)的檢測(cè)。樣本前處理的方法:稱取2.0±0.05雞肉至50mL聚苯乙烯離心管中，加入5~8mL乙酸乙酯，振蕩器振蕩10min，3000r以上離心5min，取上清液l~3mL，至10mL干凈的玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?，加入U(xiǎn)mL樣本復(fù)溶液，用渦旋儀渦旋lmin，取50 μ L用于分析。
[0017]本發(fā)明中用試劑盒檢測(cè)時(shí)，當(dāng)包被原為孕酮抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液，隨即加入酶標(biāo)二抗，再加入抗體工作液，溫育后洗滌拍干，顯色，終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。本發(fā)明中的結(jié)果分析過(guò)程為:用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(Β)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Β。)再乘以100%，即百分吸光度值，計(jì)算公式為:
百分吸光度值(%) = (B/B。)X100%
以孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用同樣的辦法計(jì)算樣品中的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)的每個(gè)樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中孕酮的殘留量。
[0018]本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液的濃度。
[0019]本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需不足lh即可完成。
[0020]本發(fā)明檢測(cè)雞肉組織中孕酮?dú)埩舻拿嘎?lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)出樣品中的孕酮的殘留量，對(duì)樣品前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)出大批量樣品，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高，靈敏度高，精確度高，準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，攜帶便利，檢測(cè)方法高效準(zhǔn)確，適于大批量樣品篩選檢測(cè)。