專利名稱：一種用于以hrp為酶促反應的化學發(fā)光底物液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫分析領域，可應用于HRP為酶促反應的檢測體系，如免疫檢測體系、熒光檢測體系等。
背景技術：
化學發(fā)光免疫分析技術在免疫檢測中已經(jīng)得到了廣泛的推廣，近幾十個品種在普遍應用，其范圍從普通的臨床檢驗品種到各種腫瘤標志物篩查、細胞因子、藥物等等，不僅在臨床檢驗，而且在藥物學、環(huán)境學、食品安全以及預防醫(yī)學都表現(xiàn)出了廣闊的應用前景。 同時，化學發(fā)光免疫分析技術的簡便、快捷、靈敏等優(yōu)點使在基層對疾病的普查、診斷和療效考核都具有重要的價值。在化學發(fā)光免疫分析中，通過免疫反應結(jié)合在微孔板內(nèi)的酶結(jié)合物的量直接反應了免疫結(jié)合的效率，該效率在標記抗體(抗原)和包被抗體(抗原)均過量的條件下，完全取決于待測的抗原(抗體)的濃度。由此而引起的發(fā)光信號強度(RLU)也就直接揭示了待測抗原(抗體)濃度的變化?，F(xiàn)有發(fā)光底物有效期短、本底高、不穩(wěn)定。發(fā)光底物的配方?jīng)Q定底物的這些特性， 我們主要對發(fā)光底物配方進行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種反應時間短、檢測平臺期長、穩(wěn)定性好的底物系統(tǒng)，即一種化學發(fā)光底物液。本發(fā)明的化學發(fā)光底物液主要由發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B組成；所述發(fā)光底物液A包括發(fā)光劑魯米諾和增強劑對碘苯酚；所述發(fā)光底物液B包括氧化劑過氧化脲。具體地，所述發(fā)光底物液A含有如下組分魯米諾0. 08-0. 12mg/ml對碘苯酚2. 8-3. 2mg/ml甘氨酸0.02-0.04%牛血清白蛋白0.008-0.012%。優(yōu)選地，所述發(fā)光底物液A含有如下組分魯米諾0. lmg/ml對碘苯酚3mg/ml甘氨酸0.03%牛血清白蛋白 0.01%。所述發(fā)光底物液A還含有緩沖系統(tǒng)，所述緩沖系統(tǒng)選自0.05M磷酸鹽緩沖液、 0. 05M Tris-HCl緩沖液和0. 2M硼酸鹽緩沖液中的一種，pH8. 3-8. 9 ；優(yōu)選地，所述緩沖系統(tǒng)為0. 2M硼酸鹽緩沖液，ρΗ8· 6。具體地，所述發(fā)光底物液B含有如下組分


過氧化脲0. 08-0. 12mg/ml
苯甲酸鈉0.01-0.03%。
優(yōu)選地，所述發(fā)光底物液B含有如下組分 過氧化脲0. lmg/ml
苯甲酸鈉0.02%。
所述發(fā)光底物液B還含有緩沖系統(tǒng)，所述緩沖系統(tǒng)選自0. 05M磷酸鹽緩沖液、 0. 05M Tris-HCl緩沖液和0. 2M硼酸鹽緩沖液中的一種，pH8. 3-8. 9 ；優(yōu)選地，所述緩沖系統(tǒng)為0. 2M硼酸鹽緩沖液，ρΗ8· 6。本發(fā)明的化學發(fā)光底物液可以用于以HRP為酶促反應的檢測系統(tǒng)。使用時，發(fā)光底物液A與發(fā)光底物液B的體積比為2-3 3-2;優(yōu)選地，發(fā)光底物液A與發(fā)光底物液B的體積比為1 1。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明是針對辣根過氧化物酶(HRP)的魯米諾化學發(fā)光體系(反應原理見下式)。
O
H2O2 +
^nAnh οη.
I I OH ( ι NH, ONH
CO0
光 (425nm)檢測系統(tǒng)是由發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B組成。發(fā)光底物液A含有發(fā)光劑魯米諾和增強劑對碘苯酚，底物液B中含有氧化劑過氧化脲。底物的穩(wěn)定性、靈敏度以及檢測方式?jīng)Q定了是否有利于臨床免疫分析。以此目的為研究方向，發(fā)明人對化學發(fā)光底物液的緩沖體系，主要原料的濃度，以及配方進行了研究和優(yōu)化，較目前商品化的底物有明顯的改進。主要體現(xiàn)在反應時間短、檢測平臺期長、穩(wěn)定性好等性能上。緩沖體系的選擇及優(yōu)化分別對磷酸鹽、Tris-HCl、硼酸鹽等緩沖系統(tǒng)進行了穩(wěn)定性、靈敏度等性能測試，根據(jù)測試結(jié)果優(yōu)選PH8. 6的硼酸鹽緩沖液。其配制方法為配制 0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然后按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即得pH8. 6硼酸鹽緩沖液。不同增強劑、穩(wěn)定劑的選擇及優(yōu)化對碘苯酚、過硼酸鈉、甘氨酸、牛血清白蛋白等多種增強劑和穩(wěn)定劑等物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，并對其使用濃度進行了優(yōu)化；然后進行穩(wěn)定性、靈敏度等性能測試，最終確定包括增強劑、穩(wěn)定劑(甘氨酸、牛血清白蛋白)等物質(zhì)在內(nèi)的發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B優(yōu)選的和最優(yōu)選的組分及其濃度配比。主要原料的濃度優(yōu)化對魯米諾和過氧化脲分別進行實驗設計，然后按設計中的濃度配制工作液，再進行性能測試，最終確定了發(fā)光底物液A中魯米諾的濃度為 0. 08-0. 12mg/ml，最優(yōu)濃度為0. lmg/ml ；發(fā)光底物液B中過氧化脲的濃度為0. 08-0. 12mg/ ml，最優(yōu)濃度為0. lmg/ml。性能測試分別進行了酶促發(fā)光反應動力學研究、反應溫度研究、靈敏度、穩(wěn)定性等研究。本發(fā)明研究得到的化學發(fā)光底物液，其有效期達到12個月以上，靈敏度達到 10_18mOl，有效延長反應平臺期(一般會延長5到20分鐘，不同的酶濃度，其反應速度不一致)。本發(fā)明的化學發(fā)光底物液主要應用于以HRP為酶促反應的檢測體系，如免疫檢測體系、熒光檢測體系等。在免疫診斷體系中，該發(fā)光底物可以增加試劑盒靈敏度、試劑盒的有效期和檢查的線性范圍(光度法常見的有效吸光度范圍在0 2. 0之間；化學發(fā)光法檢測的發(fā)光信號強度(RLU)受檢測儀器的限制；本發(fā)明所用儀器的可檢測范圍在0 2290萬之間)，并方便用戶使用、快捷的操作。


圖1為酶促發(fā)光反應動力學曲線，即RLU隨反應時間變化的曲線圖；圖2為靈敏度梯度曲線，即RLU(S/N)隨HRP濃度變化的曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1緩沖液的配制分別配制0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然后按11 9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩沖液。室溫靜置待用。發(fā)光底物液A的配制分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白 0. Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然后將上述物質(zhì)加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中；稱取魯米諾O.oig，先用5ml純水溶解，然后加入到上述緩沖液中，混勻，得發(fā)光底物液A，4°C保存。發(fā)光底物液B的配制稱取苯甲酸鈉0. 02g,加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中，然后直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發(fā)光底物液B，4°C保存。實施例2 緩沖液的配制分別配制0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然后按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩沖液。室溫靜置待用。發(fā)光底物液A的配制分別稱取對碘苯酚0J8g、甘氨酸0.02g、牛血清白蛋白 0. 008g，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然后將上述物質(zhì)加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中；稱取魯米諾0. 008g，先用5ml純水溶解，然后加入到上述緩沖液中，混勻，得發(fā)光底物液A，4°C保存。發(fā)光底物液B的配制稱取苯甲酸鈉0. Olg,加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中，然后直接加入過氧化脲0. 008g,溶解，混勻，得發(fā)光底物液B，4°C保存。實施例3緩沖液的配制分別配制0. 05M硼砂溶液和0. 2M硼酸溶液，然后按11:9的體積比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即為0. 2M pH8. 6的硼酸鹽緩沖液。室溫靜置待用。發(fā)光底物液A的配制分別稱取對碘苯酚0.32g、甘氨酸0.04g、牛血清白蛋白 0. 012g，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然后將上述物質(zhì)加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中；稱取魯米諾0. 012g，先用5ml純水溶解，然后加入到上述緩沖液中，混勻，得發(fā)光底物液A，4°C保存。發(fā)光底物液B的配制稱取苯甲酸鈉0. 03g，加入到IOOml 0. 2M的硼酸鹽緩沖液中，然后直接加入過氧化脲0. 012g，溶解，混勻，得發(fā)光底物液B，4°C保存。
實施例4緩沖液的配制0. 05M磷酸鹽緩沖液，pH8. 9。發(fā)光底物液A的配制分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白 0. Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然后將上述物質(zhì)加入到IOOml 0. 05M磷酸鹽緩沖液中；稱取魯米諾0. Olg，先用5ml純水溶解，然后加入到上述緩沖液中，混勻，得發(fā)光底物液A，4°C保存。發(fā)光底物液B的配制稱取苯甲酸鈉0. 02g，加入到IOOml 0. 05M磷酸鹽緩沖液中，然后直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發(fā)光底物液B，4°C保存。實施例5緩沖液的配制0. 05M Tris-HCl緩沖液，pH8. 3。發(fā)光底物液A的配制分別稱取對碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白O.Olg，其中對碘苯酚先用Iml無水乙醇溶解，然后將上述物質(zhì)加入到IOOml 0. 05M Tris-HCl緩沖液中；稱取魯米諾0. Olg，先用5ml純水溶解，然后加入到上述緩沖液中，混勻，得發(fā)光底物液A，4°C保存。發(fā)光底物液B的配制稱取苯甲酸鈉0. 02g，加入到100ml 0. 05MTris-HCl緩沖液中，然后直接加入過氧化脲0. Olg,溶解，混勻，得發(fā)光底物液B，4°C保存。實驗例1酶促發(fā)光反應動力學研究1.反應動力學曲線微孔板中加入10μ1 HRP(10ng/ml)，每孔中加入實施例1制備的發(fā)光底物液A 50μ1和發(fā)光底物液B 50μ1，檢測RLU 30分鐘，繪制反應動力學曲線。實驗結(jié)果見圖1。2.反應溫度研究微孔板中分別加入10 μ 1 PBS和10 μ 1 HRP (10ng/ml)，于每孔中加入實施例1制備的發(fā)光底物液A 50 μ 1和發(fā)光底物液B 50 μ 1，分別在室溫(20°C ^°C)，37°C、45°C下避光反應5分鐘，觀察HRP和PBS的RLU值，來比較不同溫度的影響，以S/N進行評價與分析。實驗結(jié)果見表1。表1不同溫度對發(fā)光反應的影響
權利要求
1.一種化學發(fā)光底物液，其特征在于，主要由發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B組成； 其中所述發(fā)光底物液A含有如下組分魯米諾0. 08-0. 12mg/ml對碘苯酚2. 8-3. 2mg/ml甘氨酸0.02-0.04%牛血清白蛋白0.008-0.012%;所述發(fā)光底物液B含有如下組分 過氧化脲0. 08-0. 12mg/ml苯甲酸鈉0.01-0.03%。
2.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述發(fā)光底物液A含有如下組分魯米諾0. lmg/ml對碘苯酚3mg/ml甘氨酸0.03%牛血清白蛋白0.01%。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述發(fā)光底物液A還含有緩沖系統(tǒng)，所述緩沖系統(tǒng)選自0. 05M磷酸鹽緩沖液、0. 05M Tris-HCl緩沖液和0. 2M硼酸鹽緩沖液中的一種，PH8. 3-8.9。
4.根據(jù)權利要求3所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述緩沖系統(tǒng)為0.2M硼酸鹽緩沖液，PH8. 6。
5.根據(jù)權利要求1所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述發(fā)光底物液B含有如下組分過氧化脲0. lmg/ml苯甲酸鈉0.02%。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述發(fā)光底物液B還含有緩沖系統(tǒng)，所述緩沖系統(tǒng)選自0. 05M磷酸鹽緩沖液、0. 05M Tris-HCl緩沖液和0. 2M硼酸鹽緩沖液中的一種，PH8. 3-8.9。
7.根據(jù)權利要求6所述的化學發(fā)光底物液，其特征在于，所述緩沖系統(tǒng)為0.2M硼酸鹽緩沖液，PH8. 6。
8.權利要求1-7任一項所述的化學發(fā)光底物液在以HRP為酶促反應的檢測系統(tǒng)中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，使用時，發(fā)光底物液A與發(fā)光底物液B的體積比為2-3 3-2。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，使用時，發(fā)光底物液A與發(fā)光底物液B的體積比為1 1。
全文摘要
本發(fā)明公開一種化學發(fā)光底物液，主要由發(fā)光劑魯米諾及增強劑對碘苯酚和氧化劑過氧化脲組成，用于以HRP為酶促反應的檢測體系。該化學發(fā)光底物液具有反應時間短、檢測平臺期長、穩(wěn)定性好等特點，可以增加試劑盒靈敏度、拓寬線性范圍和延長試劑盒的有效期。
文檔編號G01N33/52GK102156121SQ20101062396
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者徐晶, 謝晶, 那鑫 申請人:中生北控生物科技股份有限公司