專利名稱：林可霉素elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測林可霉素殘留量的試劑盒，特別是檢測蜂蜜中林可霉素殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA (Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測定的簡稱，它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種酶免技術(shù)。( 二)背景技術(shù)林可霉素(lincomycin)又稱潔霉素或林肯霉素，是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，有較強(qiáng)的抑菌活性。其殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國都對其作出限量要求。林可霉素殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MQ、紙色譜等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的林可霉素殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中林可霉素殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種林可霉素ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗工作液、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜； 標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶標(biāo)二抗工作液用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明 PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標(biāo)二抗工作液1瓶，7ml ；抗體工作液 1瓶，7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶， 40ml ；濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標(biāo)板、 蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測時(shí)，樣本中的林可霉素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的林可霉素偶聯(lián)抗原競爭抗林可霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含林可霉素的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中林可霉素殘留量，其操作簡便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度蜂蜜樣本的最低檢測限為2 μ g/kg ；相對于其他林可霉素檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、離心機(jī)、振蕩機(jī)、渦旋儀和微量加樣器等，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于林可霉素殘留量的檢測。


圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖fe為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖恥為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖5c為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖5d為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條O)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料試劑瓶( 用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液， 紅色帽(6)的黑色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶( 用于封裝7ml酶標(biāo)二抗工作液，綠色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml林可霉素抗體工作液，黑色帽的半透明PE塑料試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)下凹瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復(fù)溶液(11)，7ml顯色液A 液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位(1 ，7ml終止液瓶位(1 ，7ml林可霉素抗體工作液瓶位(16)，7ml酶標(biāo)二抗工作液瓶位(1 ，7瓶Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，盒體為(19) 是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理1.配液配液1 復(fù)溶工作液用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液2 洗滌工作液[0027]用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2.蜂蜜樣本處理步驟稱取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，用渦旋儀渦動(dòng)至蜂蜜全部溶解，再使用振蕩器振蕩5min ；3000g以上，室溫O0_25°C )離心5min ；取上層清液1ml，加入Iml復(fù)溶工作液用渦旋儀渦動(dòng)308 ；取50μ 1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫Q0-25°C )平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品溶液/樣本溶液加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液/樣本溶液50 μ 1到對應(yīng)的微孔中， 隨即加入酶標(biāo)二抗50 μ 1/孔，再加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)40min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。8、測定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔 OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與林可霉素殘留量成負(fù)相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(yg/L)。 假設(shè)樣本ι的吸光度值為0. 113，樣本2的吸光度值為0. 554，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是 0 μ g/L 為 2. 155 ；0. 2 μ g/L 為 1. 345 ；0. 6 μ g/L 為 0. 891 ； 1. 8 μ g/L 為 0. 340 ；5. 4 μ g/L 為0.131 ； 16. 2 μ g/L為0.060。則樣本1的濃度范圍是5. 4 μ g/L-16. 2 μ g/L再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中林可霉素殘留量的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0. 6 μ g/ L-1. 8 μ g/L再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中林可霉素殘留量的濃度范圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0-O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值[0047](2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中林可霉素實(shí)際殘留量。四、測定前的注意事項(xiàng)1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫Q0-25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2-8 °C，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度G50/630nm) 值小于0. 5(A450nm < 0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15-20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時(shí)間，但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種林可霉素ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于 酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別7瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗工作液、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶標(biāo)二抗工作液用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A 液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE 塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被林可霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶，Iml/ 瓶；酶標(biāo)二抗工作液1瓶，7ml ；抗體工作液1瓶，7ml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1 瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶，40ml ；濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種蜂蜜中林可霉素殘留量檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗工作液、林可霉素抗體工作液、林可霉素7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的林可霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗林可霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中林可霉素的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在林可霉素的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/544GK201993363SQ201020586539
公開日2011年9月28日 申請日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者何麗霞, 何方洋, 馮月君, 段盈盈, 王建霞, 羅貴昆, 趙正苗 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司