專利名稱：電化學(xué)傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)定葡萄糖的電化學(xué)傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
利用酶反應(yīng)的特異性，酶電極(在下文中也被稱為生物傳感器)被廣泛用作專門(mén)監(jiān)測(cè)各種生理活性物質(zhì)的傳感器。作為這種酶電極的例子，可以通過(guò)電化學(xué)方法或光學(xué)方法分析樣品組成的酶電極被廣泛使用。通過(guò)電化學(xué)方法分析樣品的酶電極通常指的是其中酶被固定在電極(例如金電極、鉬電極或碳電極)表面的電極。特別地，酶電極被廣泛用作葡萄糖傳感器，用于測(cè)定作為糖尿病重要標(biāo)志的血液中葡萄糖濃度。雖然葡萄糖傳感器的基本結(jié)構(gòu)及其制備方法是眾所周知的，專利文獻(xiàn)1公開(kāi)了一種制備具體的葡萄糖傳感器的方法。即專利文獻(xiàn)1公開(kāi)了下列技術(shù)通過(guò)在載體(例如電極基材)上形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)(磷脂2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(MPC))而使電極基材的表面改性。載體結(jié)構(gòu)的形狀并未限制，其例子包括膜、毛細(xì)管的內(nèi)壁、流道溝槽和顆粒。通過(guò)以自組織方式使膜結(jié)合蛋白(酶或抗體)在MPC改性表面的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上穩(wěn)定化，可以使蛋白質(zhì)(酶或抗體)被固定在基材、通道壁或載體的表面上，從而使蛋白質(zhì)具有方向性。專利文獻(xiàn)1中描述的這種方法與各種用于固定蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法相比，不同之處在于能模仿體內(nèi)行為，并且新的固定方法屬于新類型，這是一種通過(guò)蛋白質(zhì)自組織(使用任意一種具有膜結(jié)合性的蛋白質(zhì))的固定方法。通過(guò)這種方法可以實(shí)現(xiàn)多種應(yīng)用(產(chǎn)品) 的性能增強(qiáng)。在本發(fā)明上述的現(xiàn)有專利文獻(xiàn)1中，從酶的定向固定的視角來(lái)看，蛋白質(zhì)中的電子轉(zhuǎn)移是一種非常有效的技術(shù)。但是，在其中酶電極是通過(guò)膜結(jié)合的氧化還原酶的固定而構(gòu)建的情況下，描述了為了從膜結(jié)合的氧化還原酶到電極“僅通過(guò)酶的固定”獲得高效率的電子轉(zhuǎn)移通道的嘗試，并且在實(shí)施例中僅提到將通用的碳作為基材，并沒(méi)有談到用于改善作為基材的電極材料的給予和接受電子的能力的方法。因?yàn)榛碾姌O的制備方法或電極形狀對(duì)酶電極傳感器性能的影響非常大，傳感器可以最優(yōu)化為制備效率高、穩(wěn)定性高和可用性高的傳感器，所以酶電極仍具有改善的空間。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 特開(kāi)2006-322889號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備效率高、響應(yīng)性高、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好且可用性高的傳感器。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供一種電化學(xué)傳感器，包括基材；配置在基材上的由碳粒子制成的導(dǎo)電層；
配置在導(dǎo)電層上的包含酶的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，所述酶存在于仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層內(nèi)和仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層界面上兩者中的至少一個(gè)位置。通過(guò)使用本發(fā)明，可以使蛋白質(zhì)(例如氧化還原酶)高定向固定，因此沒(méi)有出現(xiàn)少量酶的活性波動(dòng)，適當(dāng)?shù)厍页杀旧嫌欣乇磉_(dá)出期望的活性，并且由于酶和電極之間電子轉(zhuǎn)移效率的增加，酶電極的信號(hào)也進(jìn)一步增大。此外，通過(guò)酶的固定使酶電極具有膜結(jié)合性，能在其中模擬體內(nèi)行為，從而使酶可以更牢固地固定在電極表面，因而令人驚訝地改善了傳感器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。通過(guò)使用本發(fā)明，電化學(xué)傳感器的制備效率可以明顯改善通過(guò)使用碳粒子(炭黑)作為含有粘結(jié)劑和溶劑的絲網(wǎng)印刷油墨，以絲網(wǎng)印刷法在基材(例如樹(shù)脂)上進(jìn)行圖案印刷并形成電極，其中傳感器之間的差異可以變得很小。此外，因?yàn)橥ㄟ^(guò)絲網(wǎng)印刷方法的傳感器圖案化是可能的，便可以制備出更微小的電化學(xué)傳感器；因?yàn)椴皇褂脤?duì)生物有毒的附加介體而改善了體內(nèi)安全性；因?yàn)閭鞲衅骶哂虚L(zhǎng)期穩(wěn)定性；所以預(yù)計(jì)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器可能非常適用于植入式連續(xù)測(cè)量傳感器。對(duì)該電化學(xué)傳感器，可以通過(guò)填充碳粒子來(lái)制備導(dǎo)電層，并且可以簡(jiǎn)單地估算對(duì)葡萄糖的響應(yīng)靈敏度。如果電化學(xué)傳感器是用本發(fā)明的方法通過(guò)使膜結(jié)合的氧化還原酶固定在電極上來(lái)構(gòu)建，可以得到膜結(jié)合酶的高效電子轉(zhuǎn)移通道，同時(shí)能模擬膜結(jié)合酶的體內(nèi)行為。


圖1是顯示本發(fā)明的電化學(xué)傳感器在被用于進(jìn)行葡萄糖的定量分析時(shí)的響應(yīng)靈敏度的圖，其中BLACK PEARLS 2000被用作碳粒子，而含有碳的導(dǎo)電層是通過(guò)絲網(wǎng)印刷制備的。圖2是本發(fā)明的電化學(xué)傳感器被用于連續(xù)測(cè)定時(shí)的穩(wěn)定性的圖，其中BLACK PEARLS 2000被用作碳粒子，而含有碳的導(dǎo)電層是通過(guò)絲網(wǎng)印刷制備的。圖3是顯示本發(fā)明的電化學(xué)傳感器在被用于進(jìn)行葡萄糖的定量分析時(shí)的響應(yīng)靈敏度的圖，其中Ketjen Black被用作碳粒子，而含有碳的導(dǎo)電層是通過(guò)絲網(wǎng)印刷制備的。圖4是本發(fā)明的電化學(xué)傳感器被用于連續(xù)測(cè)定時(shí)的穩(wěn)定性的圖，其中Ketjen Black被用作碳粒子，而含有碳的導(dǎo)電層是通過(guò)填充碳粒子制備的。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式本發(fā)明的主要部分是炭黑的使用和通過(guò)使用仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)使酶固定化。其詳細(xì)說(shuō)明如下本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的上述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層優(yōu)選是磷脂膜。仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層是用于固定酶同時(shí)模擬體內(nèi)行為。所述酶存在于仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層內(nèi)和仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層界面上的至少一個(gè)位置。作為上述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的磷脂膜優(yōu)選是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿(MPC)聚合物。其中MPC單獨(dú)聚合的那些或其中MPC與疏水性單體(例如甲基丙烯酸酯，諸如甲基丙烯酸丁酯)共聚的那些可以被用作MPC聚合物。MPC聚合物還可以是其中MPC與陰離子單體或陽(yáng)離子單體共聚的那些?？梢酝ㄟ^(guò)將一滴包含上述磷脂聚合物的溶液分配到基材(例如工作電極或?qū)﹄姌O)的任意部分(例如絕緣膜圍住的外露部分)然后進(jìn)行干燥而配置這種仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層。在本發(fā)明中，仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的配置包括仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的形成。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的酶優(yōu)選是葡萄糖脫氫酶。和葡萄糖氧化酶不同，葡萄糖脫氫酶在反應(yīng)期間不受氧介導(dǎo)，其優(yōu)點(diǎn)是不受例如測(cè)試樣品中氧分壓的影響。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的葡萄糖脫氫酶優(yōu)選是具有細(xì)胞色素作為亞基的葡萄糖脫氫酶(在下文中也被稱為“Cy-GDH”)。當(dāng)使用具有細(xì)胞色素作為亞基的葡萄糖脫氫酶時(shí)，不必額外使用介體(例如堿金屬鐵氰化物)。此處，本發(fā)明所用的Cy-GDH指的是包含至少一個(gè)具有葡萄糖脫氫酶活性的α-亞基和一個(gè)具有電子傳遞功能的細(xì)胞色素C的那些，也涵蓋進(jìn)一步含有不同于α-亞基或細(xì)胞色素C的亞基的那些。W002/36779中公開(kāi)了這些Cy-GDH的例子。該國(guó)際申請(qǐng)中所描述的Cy-GDH來(lái)自屬于Burkholderia c印acia (洋蔥伯克霍爾德菌)的微生物；其分子量通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在還原條件下測(cè)定為約60kDa ；其中包含F(xiàn)AD作為輔因子并且包含具有葡萄糖脫氫酶活性的α _亞基(其分子量通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在還原條件下測(cè)定為約43kDa)并且包含具有電子傳遞功能的細(xì)胞色素C。本發(fā)明的Cy-GDH還包括通過(guò)利用轉(zhuǎn)化子得到的那些，其中編碼從屬于 Burkholderia cepacia的微生物中得到Cy-GDH的基因被轉(zhuǎn)移到該轉(zhuǎn)化子中。本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的上述酶優(yōu)選在上述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上以酶相對(duì)于仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層自組織的狀態(tài)形成。例如，因?yàn)閬?lái)自屬于Burldiolderia cepacia的微生物的 Cy-GDH是膜結(jié)合蛋白質(zhì)，其原本存在于細(xì)胞膜上，當(dāng)這種Cy-GDH被用在膜上時(shí)，可以通過(guò)以如下?tīng)顟B(tài)使Cy-GDH被固定在膜上而形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層=Cy-GDH相對(duì)于仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層是自組織的并且Cy-GDH具有與Cy-GDH在細(xì)胞膜中相同方式的取向。酶的這種自組織固定化并不限于來(lái)自屬于Burldiolderia cepacia的微生物的Cy-GDH，當(dāng)使用存在于細(xì)胞膜中的膜結(jié)合酶時(shí)都可以得到。除了碳粒子，本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的上述導(dǎo)電層還可以包含粘結(jié)劑。通過(guò)采用這種構(gòu)造成，碳粒子(炭黑)可以在生產(chǎn)過(guò)程中被制成含有粘結(jié)劑和溶劑的絲網(wǎng)印刷油墨。 為此，通過(guò)使用絲網(wǎng)印刷法在基材(例如樹(shù)脂)上進(jìn)行圖案印刷形成電極，可以顯著改善酶電極的制備效率，其中不同傳感器之間的差異可以變得很小。制備過(guò)程中所含的溶劑通過(guò)干燥而蒸發(fā)，因此不包含在酶電極的構(gòu)造中。作為用于配置上述導(dǎo)電層與碳粒子的粘結(jié)劑，可以在制備過(guò)程中溶解或分散在溶劑中的各種粘結(jié)劑都可以使用，特別地可優(yōu)選使用丁縮醛樹(shù)脂粘結(jié)劑和聚酯樹(shù)脂粘結(jié)劑。 優(yōu)選地，卡必醇乙酸酯(二甘醇一乙醚乙酸酯)、異佛爾酮和環(huán)己烷可以被用作溶劑。在本發(fā)明中，導(dǎo)電層的配置包括導(dǎo)電層的形成。在本發(fā)明的電化學(xué)傳感器中，上述導(dǎo)電層和上述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層可以組合。即，其中上述導(dǎo)電層和上述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層結(jié)合雜一起的一層可以通過(guò)如下形成預(yù)先制備并混合包含碳粒子的絲網(wǎng)印刷油墨(用于形成導(dǎo)電層)和包含磷脂聚合物的溶液(用于形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層)，并將一滴混合溶液分配到基材(諸如工作電極和對(duì)電極)上，然后干燥。 以這種方式組合的層在制備中非常有用。此外，最終的酶電極可以在一步中制備通過(guò)預(yù)先使膜結(jié)合酶混入上述絲網(wǎng)印刷油墨和磷脂聚合物的混合物并通過(guò)絲網(wǎng)印刷法在基材上進(jìn)行圖案印刷。一種用于制備本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的方法，其包括
將由碳粒子制成的導(dǎo)電層配置在基材上；將仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層配置在導(dǎo)電層上；使酶固定在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上。膜結(jié)合酶在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上的固定(即自組織固定)可以在例如其外露部分上形成有仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的基材上進(jìn)行，將所述基材浸入含有膜結(jié)合酶的溶液中，然后干燥; 或者將上述酶溶液噴在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，然后干燥。當(dāng)膜結(jié)合酶通過(guò)自組織方式被固定在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上時(shí)，膜結(jié)合酶在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層內(nèi)和/或仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的界面上定向形成。當(dāng)酶是Cy-GDH(即具有細(xì)胞色素作為亞基的葡萄糖脫氫酶)時(shí)，酶被固定在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上，從而使具有葡萄糖脫氫酶活性的α-亞基的活性部位被固定在最接近測(cè)試樣品的酶電極的表層上，同時(shí)細(xì)胞色素最接近電極或與電極接觸。來(lái)自屬于Burkholderia c印acia的微生物的Cy-GDH是膜結(jié)合蛋白質(zhì)。因?yàn)樯鲜鰜?lái)自微生物的Cy-GDH原本存在于細(xì)胞膜上，當(dāng)使用這種Cy-GDH時(shí)，Cy-GDH可以以如下?tīng)顟B(tài)被固定=Cy-GDH相對(duì)于仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層是自組織的并且Cy-GDH具有與Cy-GDH在細(xì)胞膜中相同方式的取向。酶的這種自組織固定化并不限于來(lái)自屬于Burldiolderia cepacia的微生物的Cy-GDH，當(dāng)使用存在于細(xì)胞膜中的膜結(jié)合酶時(shí)都可以得到。在制備本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的方法中，其中引入硅烷偶聯(lián)劑的那些聚合物也可以被用作磷脂聚合物。如果其中硅烷偶聯(lián)劑以這種方式被引入仿細(xì)胞膜物質(zhì)，仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層可以在仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的配置步驟中通過(guò)與導(dǎo)電層上的OH基反應(yīng)而在導(dǎo)電層上形成，這同時(shí)可以增強(qiáng)磷脂聚合物對(duì)導(dǎo)電層的外露部分的親和性。在制備本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的方法中，當(dāng)其中引入硅烷偶聯(lián)劑的那些被用作磷脂聚合物時(shí)，通過(guò)預(yù)先在導(dǎo)電層上進(jìn)行親水處理并在親水部位形成引入硅烷偶聯(lián)劑的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，該親水基被連接在硅烷偶聯(lián)劑上，而磷脂聚合物可以更牢固地固定在外露部分。通過(guò)在導(dǎo)電層表面的VUV處理而進(jìn)行的親水處理之后再形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，可以使磷脂聚合物更牢固地被固定。在本文中，磷脂聚合物中硅烷偶聯(lián)劑的用量例如為基于100份重量的聚合物組分10到500份重量。硅烷偶聯(lián)劑的例子包括四乙氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、三O-甲氧基乙氧基)乙烯基硅烷、Y -甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、Y -甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、β-(3，4_環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷、Y-縮水甘油基丙基三乙氧基硅烷、Y -氨丙基三乙氧基硅烷、N-苯基-Y -氨基丙基三甲氧基硅烷、Y -氯丙基三甲氧基硅烷和Y-硫醇基丙基三甲氧基硅烷，這些硅烷偶聯(lián)劑可以單獨(dú)使用或者可以其中多個(gè)組合使用。(導(dǎo)電層材料的選擇)本發(fā)明人尋找用于改善電子從酶到電極的交換效率的優(yōu)選材料，并發(fā)現(xiàn)考慮到導(dǎo)電粒子的顆粒尺寸和比表面積，如下的組合是優(yōu)選的由一次粒徑和處于結(jié)合狀態(tài)的二次粒徑都很小、密度小且比表面積非常大的材料(碳粒子)制成的導(dǎo)電層和仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的組合。特別地，已發(fā)現(xiàn)一級(jí)粒徑為30nm-100nm、比表面積為200m2/g-1400m7g的碳粒子優(yōu)選用于制備生物傳感器。碳粒子的例子包括炭黑，易于得到的炭黑的代表性例子包括 BLACK PEARLS (商標(biāo)；由 Cabot Corporation 制造)和 Ketjen Black (商標(biāo)；由 AkzoNobelChemicals Co. ,Ltd.制造)。粒徑和比表面積的測(cè)定方法的例子包括通過(guò)透射式電子顯微鏡進(jìn)行的測(cè)試和BET比表面積法。(通過(guò)使用導(dǎo)電層材料的絲網(wǎng)印刷油墨來(lái)制備傳感器的方法的優(yōu)化)當(dāng)使用上述碳材料時(shí)，可以將礦物油或類似物混入碳材料(粉末)制備糊狀物，但其粘附性差，傳感器的結(jié)構(gòu)往往不穩(wěn)定。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選通過(guò)制備上述浸漬有粘結(jié)劑和溶劑的碳粒子來(lái)制造絲印油墨。通過(guò)絲網(wǎng)印刷法將油墨圖案化印刷在基材(例如樹(shù)脂)并通過(guò)印刷形成電極，將顯著改善制備過(guò)程的效率。(通過(guò)填充碳材料來(lái)制備傳感器的方法的優(yōu)化)在本發(fā)明中，對(duì)葡萄糖的響應(yīng)靈敏度可以通過(guò)如下簡(jiǎn)單地估算通過(guò)填充糊狀物 (通過(guò)向上述碳粒子中添加液體石蠟得到)來(lái)制備導(dǎo)電層并將該層用于電化學(xué)傳感器。(酶在導(dǎo)電層材料上的定向固定)在上述導(dǎo)電層上，通過(guò)使用MPC或類似物來(lái)改性電極表面而形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) (磷脂)。此外，通過(guò)例如如下方法來(lái)制備酶電極(電化學(xué)傳感器)將上述改性的電極浸入膜結(jié)合酶溶液或?qū)⒛そY(jié)合酶溶液分配到改性的電極表面并且通過(guò)使酶固定在上述改性電極上而制備工作電極。電極體系通常由工作電極、對(duì)電極和參比電極組成。實(shí)施例1在實(shí)施例1中，進(jìn)行電化學(xué)傳感器的響應(yīng)靈敏度和穩(wěn)定性的檢測(cè)，其中在所述電化學(xué)傳感器上通過(guò)絲網(wǎng)印刷法形成導(dǎo)電層，其中BLACK PEARLS被用作碳粒子，而基材的表面上含有這種BLACK PEARLS。所示的本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的應(yīng)用效果作為其中來(lái)自屬于 Burkholderia c印acia的微生物的葡萄糖脫氫酶(Cy-GDH)(其具有細(xì)胞色素作為亞基)的一個(gè)實(shí)施例的數(shù)據(jù)。作為電極體系，使用了 工作電極酶固定化電極；對(duì)電極鉬電極；和參比電極銀/氯化銀電極。上述的酶固定化電極是工作電極，是使用本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的電化學(xué)傳感器；而使用具有常規(guī)吸附型酶固定化電極的電化學(xué)傳感器作為對(duì)比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。在本發(fā)明中，在聚酰亞胺基材的表面上，根據(jù)本發(fā)明形成了導(dǎo)電層(碳層)、仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層(磷脂聚合物層)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作為碳粒子，所制備的BLACK PEARLS 2000 (在下文中被稱為BP)的粒徑為50nm， 比表面積為1400m2/g，孔隙率為60體積％?；谥亓勘龋瑢?0%的BP、作為粘結(jié)劑的40% 聚酯樹(shù)脂以及作為溶劑的20%的異佛爾酮混合以得到印刷油墨。將該油墨印在聚酰亞胺基材的表面上，使油墨的厚度為ΙΟμπι，然后在150°C下干燥30分鐘從而得到導(dǎo)電層。通過(guò)利用在導(dǎo)電層表面的VUV處理而進(jìn)行親水處理、隨后將MPC聚合物溶液涂布在導(dǎo)電層的表面上并干燥，形成仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層。VUV處理是通過(guò)在空氣中使用 “MECL-M3-750” (由MD Excimer Co.，Ltd.制造)以Imm的輻照距離將波長(zhǎng)為172nm的準(zhǔn)分子激光輻照在導(dǎo)電層表面180秒而進(jìn)行的。作為磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶聯(lián)劑的 MPC 聚合物(產(chǎn)品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。
通過(guò)將其上形成磷脂聚合物層的導(dǎo)電層浸入Cy-GDH溶液中10分鐘而形成Cy-GDH 層。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的濃度被設(shè)為按照活性基準(zhǔn)100U/μ L。通過(guò)使用所制備的酶電極作為工作電極、Pt作為對(duì)電極且Ag/AgCl參比電極作為參比電極，而構(gòu)建出使用了本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的酶電極體系。另一方面，通過(guò)與實(shí)施例1相同的方式形成對(duì)比例1，不同之處在于磷脂聚合物沒(méi)有在工作電極上形成，而是使用常規(guī)吸附型酶固定化電極，其中未使用MPC，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。通過(guò)使用這些電極體系，不用附加的介體，通過(guò)計(jì)時(shí)電流法測(cè)定對(duì)葡萄糖的響應(yīng)靈敏度，其中將600mV的電勢(shì)差施加在電極體系上。在響應(yīng)靈敏度的測(cè)量中，將實(shí)施例1和對(duì)比例1的酶電極體系(工作電極/對(duì)電極/參比電極)中的每一個(gè)浸入0. IM的磷酸鹽緩沖溶液(pH= 7.0)中。然后，向各個(gè)酶電極施加恒定的電壓(600mV，相對(duì)于Ag/AgCl)，同時(shí)將2. OM的葡萄糖水溶液連續(xù)滴入溶液中，在最終的葡萄糖濃度為100mg/dl和600mg/dl 時(shí)測(cè)量恒定電流密度(nA/mm2)。恒定電流密度與響應(yīng)靈敏度相對(duì)應(yīng)。結(jié)果顯示在圖1中。 如圖1所示，已證實(shí)與具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化電極的對(duì)比例的電化學(xué)傳感器相比，具有其中使用MPC的本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的酶固定化電極的電化學(xué)傳感器的響應(yīng)靈敏度更高。然后，評(píng)估本發(fā)明的電極體系的穩(wěn)定性。在評(píng)估穩(wěn)定性的方法中，測(cè)定實(shí)施例和對(duì)比例的各個(gè)酶電極體系的初始響應(yīng)靈敏度。隨后，將體系浸入室溫下的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 0)中3天之后測(cè)定實(shí)施例和對(duì)比例的各個(gè)酶電極體系的響應(yīng)靈敏度。響應(yīng)靈敏度的測(cè)定方法在與上述檢測(cè)響應(yīng)靈敏度一樣的條件下進(jìn)行。結(jié)果顯示在圖2中。圖2 中的圖形顯示相對(duì)于初始值的相對(duì)活性(最終的葡萄糖濃度為100mg/dl)。結(jié)果，證實(shí)與具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化電極的電化學(xué)傳感器相比，具有其中使用MPC的酶固定化電極的電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性更高。實(shí)施例2在實(shí)施例2中，Ketjen Black被用作碳粒子，檢測(cè)電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性，其中在所述電化學(xué)傳感器上通過(guò)使用這種Ketjen Black的絲網(wǎng)印刷法在基材表面上形成導(dǎo)電層。 所示的本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的應(yīng)用效果作為其中來(lái)自屬于Burliholderia cepacia的微生物的葡萄糖脫氫酶(Cy-GDH)(其具有細(xì)胞色素作為亞基)的一個(gè)實(shí)施例的數(shù)據(jù)。作為電極體系，使用了 工作電極酶固定化電極；對(duì)電極鉬電極；和參比電極銀/氯化銀電極。上述的酶固定化電極是工作電極，是使用本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的電化學(xué)傳感器，而使用具有常規(guī)吸附型酶固定化電極的電化學(xué)傳感器作為對(duì)比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。在本發(fā)明中，在聚酰亞胺基材的表面上，根據(jù)本發(fā)明形成了導(dǎo)電層(碳層)、仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層(磷脂聚合物層)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作為碳粒子，所制備的Ketjen Black EC600JD(在下文中被稱為KB)的粒徑為 34nm,比表面積為1270m2/g，孔隙率為60體積％。基于重量比，將40%的KB、作為粘結(jié)劑的40%聚酯樹(shù)脂以及作為溶劑的20%的異佛爾酮混合以得到印刷油墨。將該油墨印在聚酰亞胺基材的表面上，使油墨的厚度為ΙΟμπι，然后在150°C下干燥30分鐘從而得到導(dǎo)電層。通過(guò)如下方法在上述導(dǎo)電層的表面上形成磷脂聚合物層將上述導(dǎo)電層層浸入MPC聚合物溶液(0. 05%的MPC水溶液，使用0. IM的磷酸鹽緩沖溶液作為溶劑)中六小時(shí)。作為磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶聯(lián)劑的MPC聚合物(產(chǎn)品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。通過(guò)用蒸餾水沖洗、之后將其上形成磷脂聚合物層的導(dǎo)電層浸入Cy-GDH溶液 (lmg/ml的Cy-GDH溶液)中一整夜而形成Cy-GDH層。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的濃度被設(shè)為按照活性基準(zhǔn)lOOU/μ L。通過(guò)使用所制備的酶電極作為工作電極、Pt作為對(duì)電極且Ag/ AgCl參比電極作為參比電極，而構(gòu)建出使用了本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的酶電極體系。另一方面，通過(guò)與實(shí)施例2相同的方式形成對(duì)比例2，不同之處在于磷脂聚合物沒(méi)有在工作電極上形成，而是使用常規(guī)吸附型酶固定化電極體系，其中未使用仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。通過(guò)使用這些電極體系，不用附加的介體，通過(guò)計(jì)時(shí)電流法測(cè)定對(duì)葡萄糖的響應(yīng)靈敏度，其中將600mV的電勢(shì)差施加在電極體系上。在響應(yīng)靈敏度的測(cè)量中，將實(shí)施例2和對(duì)比例2的酶電極體系(工作電極/對(duì)電極/參比電極)中的每一個(gè)浸入0. IM的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7.0)中。然后，向各個(gè)酶電極施加恒定的電壓(600mV，相對(duì)于Ag/AgCl)， 同時(shí)將2. OM的葡萄糖水溶液連續(xù)滴入溶液中，在最終的葡萄糖濃度為25mg/dl、100mg/dl 和600mg/dl時(shí)測(cè)量恒定電流密度(nA/mm2)。恒定電流密度與響應(yīng)靈敏度相對(duì)應(yīng)。結(jié)果顯示在圖3中。如圖3所示，已證實(shí)與具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化電極的對(duì)比例的電化學(xué)傳感器相比，具有其中使用MPC的本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的酶固定化電極的電化學(xué)傳感器的響應(yīng)靈敏度更高。實(shí)施例3在實(shí)施例3中，Ketjen Black被用作碳粒子，檢測(cè)電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性，其中在所述電化學(xué)傳感器上通過(guò)填充這種Ketjen Black的方法而在基材的表面形成導(dǎo)電層。所示的本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的應(yīng)用效果作為其中來(lái)自屬于Burliholderia cepacia的微生物的葡萄糖脫氫酶(Cy-GDH)(其具有細(xì)胞色素作為亞基)的一個(gè)實(shí)施例的數(shù)據(jù)。作為電極體系，使用了 工作電極酶固定化電極；對(duì)電極鉬電極；和參比電極銀/氯化銀電極。上述的酶固定化電極是工作電極，是使用本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的電化學(xué)傳感器，而使用具有常規(guī)吸附型酶固定化電極的電化學(xué)傳感器作為對(duì)比例，其中未使用MPC，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。在本發(fā)明中，在聚酰亞胺基材的表面上，根據(jù)本發(fā)明形成了導(dǎo)電層(碳層)、仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層(磷脂聚合物層)和固定化酶膜(Cy-GDH膜)。作為碳粒子，所制備的Ketjen Black EC600JD(在下文中被稱為KB)的粒徑為 34nm,比表面積為1270m2/g，孔隙率為80體積％。向60mg這種粉末中加入100 μ L的液體石蠟，混合均勻之后加工成糊狀物。為了制備直徑為3mm的糊電極(由BAS Co.，Ltd.制造的CPE碳糊電極)而用該糊狀物填充基體電極，并將電極壓縮至厚度為2mm從而得到導(dǎo)電層。通過(guò)如下方法在上述導(dǎo)電層的表面上形成磷脂聚合物層將上述導(dǎo)電層層浸入MPC聚合物溶液(0. 05%的MPC水溶液，使用0. IM的磷酸鹽緩沖溶液作為溶劑)中六小時(shí)。作為磷脂聚合物溶液，使用引入了硅烷偶聯(lián)劑的MPC聚合物(產(chǎn)品名“LIPIDURE CR-1702” ；由 NOF CORPORATION 制造)。通過(guò)用蒸餾水沖洗、之后將其上形成磷脂聚合物層的導(dǎo)電層浸入Cy-GDH溶液 (lmg/ml的Cy-GDH溶液)中一整夜而形成Cy-GDH層。Cy-GDH溶液中Cy-GDH的濃度被設(shè)為按照活性基準(zhǔn)lOOU/μ L。通過(guò)使用所制備的酶電極作為工作電極、Pt作為對(duì)電極且Ag/ AgCl參比電極作為參比電極，而構(gòu)建出使用了本發(fā)明的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層的酶電極體系。另一方面，通過(guò)與實(shí)施例3相同的方式形成對(duì)比例3，不同之處在于磷脂聚合物沒(méi)有在工作電極上形成，而是使用常規(guī)吸附型酶固定化電極體系，其中未使用仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，酶被直接吸附在導(dǎo)電層上。評(píng)估本發(fā)明的電極體系的穩(wěn)定性。在評(píng)估穩(wěn)定性的方法中，測(cè)定實(shí)施例3和對(duì)比例3的各個(gè)酶電極體系的初始響應(yīng)靈敏度。隨后，將體系浸入室溫下的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 0)中1、2、3、6、7、10、14、15天之后測(cè)定實(shí)施例3和對(duì)比例3的各個(gè)酶電極體系的響應(yīng)靈敏度。響應(yīng)靈敏度的測(cè)定方法在與實(shí)施例1所示的檢測(cè)響應(yīng)靈敏度一樣的條件下進(jìn)行。結(jié)果顯示在圖4中。圖4中的圖形顯示相對(duì)于初始值的相對(duì)活性(最終的葡萄糖濃度為100mg/dl)。結(jié)果，證實(shí)與具有其中未使用MPC的吸附型酶固定化電極的電化學(xué)傳感器相比，具有其中使用MPC的酶固定化電極的電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性更高。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)傳感器，包括基材；配置在基材上的由碳粒子制成的導(dǎo)電層；配置在導(dǎo)電層上的包含酶的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層，所述酶存在于所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層內(nèi)和所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層界面上兩者中的至少一個(gè)位置。
2.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器，其中所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層是磷脂膜。
3.如權(quán)利要求2所述的電化學(xué)傳感器，其中所述磷脂膜是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿聚合物。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述酶是葡萄糖脫氫酶。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述酶以相對(duì)于所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層自組織的狀態(tài)被固定在所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述碳粒子的一級(jí)粒徑為 IOOnm或更小，比表面積為200m2/g或更大。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述碳粒子是Ketjen Black (商標(biāo))或 BLACK PEARLS (商標(biāo))。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述導(dǎo)電層通過(guò)絲網(wǎng)印刷碳粒子而形成。
9.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的電化學(xué)傳感器，其中所述所述導(dǎo)電層通過(guò)填充碳粒子而形成。
10.一種用于制備電化學(xué)傳感器的方法，其包括將由碳粒子制成的導(dǎo)電層配置在基材上；將仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層配置在所述導(dǎo)電層上；使酶固定在所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層是磷脂膜。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述磷脂膜是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿聚合物。
13.如權(quán)利要求10至12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶是葡萄糖脫氫酶。
14.如權(quán)利要求10至13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶以相對(duì)于所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層自組織的狀態(tài)被固定在所述仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層上。
15.如權(quán)利要求10至14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述碳粒子的一級(jí)粒徑為IOOnm 或更小，比表面積為200m2/g或更大。
16.如權(quán)利要求10至15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述碳粒子是KetjenBlack (商標(biāo))或 BLACK PEARLS (商標(biāo))。
17.如權(quán)利要求10至16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述導(dǎo)電層通過(guò)絲網(wǎng)印刷碳粒子而形成。
18.如權(quán)利要求10至16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述所述導(dǎo)電層通過(guò)填充碳粒子而形成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種電化學(xué)傳感器，其包含基材、排列在基材上且包含碳粒子的導(dǎo)電層、以及排列在導(dǎo)電層上且其內(nèi)部和/或其界面上包含酶的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)層。
文檔編號(hào)G01N27/327GK102308204SQ20108000727
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者塚田理志, 村瀨陽(yáng)介, 勝木幸治, 藤繩義明 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社