專利名稱：一種用于評(píng)價(jià)中藥復(fù)方治療膿毒癥藥效的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥復(fù)方的藥效評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，是創(chuàng)傷、燒傷等危重患者重要的死亡原因之一，也是I⑶病房病人死亡的第一大原因[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，美國 1995年有75萬例膿毒癥發(fā)生，其中有21萬例死亡；法國2001年有6萬例膿毒癥患者死亡。我國每年患各種感染病人達(dá)2億人次，發(fā)熱病人達(dá)3億人次，全身炎癥反應(yīng)綜合征病人達(dá)3000萬人次。每年膿毒癥病人超過300萬人，因此造成多臟衰的死亡人數(shù)高達(dá)50萬人以上。盡管對(duì)其治療給予巨大的投資，嚴(yán)重膿毒癥的病死率仍居高不下，病死率始終徘徊在 28%到50%之間。更為嚴(yán)重的是，在最近20年中，嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)生率增加了 75%，其發(fā)病率增高的原因尚不十分清楚，可能與免疫抑制病人增多、侵入性治療檢查的增加、微生物耐藥、老年人人口的增長有關(guān)。有關(guān)專家預(yù)計(jì)，隨著人口老齡化的進(jìn)程，到2020年，僅在美國每年就會(huì)有100萬例以上膿毒癥病例發(fā)生[2_1(|]。因?yàn)槟摱景Y可以形成膿毒性休克液可以造成多個(gè)功能衰竭而引起死亡。膿毒癥問題具有全球性的威脅和挑戰(zhàn)，其平均治療費(fèi)用很高，美國約為2. 2萬美元/例，年耗資近200 個(gè)億，歐洲年耗資近100億，隨著發(fā)病率的激增，對(duì)國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也是一個(gè)沉重負(fù)擔(dān)。膿毒癥的臨床治療一直主要依靠液體復(fù)蘇、廣譜抗生素、低劑量糖皮質(zhì)激素、血糖控制、活化蛋白C等支持療法。對(duì)于膿毒癥的治療，國際膿毒癥聯(lián)席會(huì)雖然推出了 “2004 嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克治療指南”，但其實(shí)際上并沒有創(chuàng)新的治療方法，只是對(duì)現(xiàn)行的一些治療方法的總結(jié)或重新評(píng)估，旨在為臨床醫(yī)生提供治療嚴(yán)重膿毒癥或膿毒性休克的指南，有助于改善患者預(yù)后，但要真正實(shí)現(xiàn)2002年巴塞羅那宣言中“降低25 %死亡率”的目標(biāo)尚有距離?？偟膩碚f，目前對(duì)膿毒癥的治療效果還非常差。由于過度炎癥反應(yīng)是膿毒癥的重要特征，一直以來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療策略一直針對(duì)促炎因子。人們?cè)囉每箖?nèi)毒素抗體、抗TNF-α抗體、IL- 1受體拮抗劑、磷脂酶A2拮抗劑、PAF拮抗劑、抗氧化劑、凝血酶抑制劑、皮質(zhì)激素、Y-干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)等治療，盡管某些治療在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中取得良好效果，但在病人中未能提高治愈率及生存率。中醫(yī)沒有膿毒癥的概念，但自春秋戰(zhàn)國時(shí)的《黃帝內(nèi)經(jīng)》至漢代張仲景的《傷寒論》 與六經(jīng)辨證，清代葉天士的《溫?zé)嵴摗放c衛(wèi)氣營血辨證，都是以急性感染性疾病而論著，且?guī)浊陙碇委熈舜罅坎∪?，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)其臨床特點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)可將其歸屬于傷寒、 溫病的范疇。可以說幾千年的中醫(yī)學(xué)發(fā)展歷史中始終貫穿著對(duì)“膿毒癥”的研究，即中醫(yī)學(xué)在治療膿毒癥方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。自上個(gè)世紀(jì)70年代，國內(nèi)以王今達(dá)教授、王寶恩教授等為代表開展的中西醫(yī)結(jié)合治療本病的臨床與基礎(chǔ)研究，國內(nèi)北京友誼醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院、天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所等單位，對(duì)膿毒癥的中西醫(yī)結(jié)合診治進(jìn)行了深入研究，取得了由單純西醫(yī)治療的效果，并總結(jié)出了對(duì)膿毒癥的病機(jī)和中醫(yī)治法的認(rèn)識(shí)、制訂出了中西醫(yī)結(jié)合診療標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范，總結(jié)篩選出多個(gè)具有良好療效的中藥復(fù)方，顯示出中醫(yī)藥治療膿毒癥具有潛在的優(yōu)勢(shì)[11_22]。雖然，目前臨床上所采用的中藥復(fù)方顯示了良好的治療效果，但由于目前卻沒有客觀有效的中藥復(fù)方藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法，故無法知道所用復(fù)方是否是最佳的，也無法進(jìn)行進(jìn)一步的藥物開發(fā)研究。因此，從中醫(yī)藥理論及其用藥原則出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，重新建立一種與中藥復(fù)方的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特征相適應(yīng)的新的藥效評(píng)價(jià)模式是本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)。在此處鍵入技術(shù)領(lǐng)域描述段落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的中藥復(fù)方治療膿毒癥的藥效評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明所指的動(dòng)物模型是大鼠膿毒癥模型。本發(fā)明所指的評(píng)價(jià)指標(biāo)是血漿內(nèi)源性總代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。本發(fā)明所用的測(cè)定技術(shù)是氫核磁共振。本發(fā)明所指的數(shù)據(jù)處理方法是主成分分析和最小偏二乘法
本發(fā)明涉及大鼠膿毒癥模型，樣品采集、處理，氫核磁共振測(cè)定、數(shù)據(jù)處理和分析以及結(jié)果判斷方式由下述方式完成。1.大鼠膿毒癥模型的制作
模型組以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，體重210 230g。實(shí)驗(yàn)前1 禁食、不限水，實(shí)驗(yàn)時(shí)以10%水合氯醛按lml/kg劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸， 在距其末端2cm處以1號(hào)絲線結(jié)扎，再用18號(hào)針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹造模。正常組以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，體重210 230g。實(shí)驗(yàn)前12h禁食、 不限水，實(shí)驗(yàn)時(shí)以10%水合氯醛按lml/kg劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，逐層關(guān)腹。治療組以健康Wistar大鼠9只，雌雄各半，體重210 230g。在造模后，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、6g生藥/kg，每日 1次，連續(xù)72h。2.樣品的采集處理
正常組、模型組、中藥復(fù)方治療組分別進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。血液經(jīng)高速低溫離心(轉(zhuǎn)速15, OOOrpm ；時(shí)間10分鐘；溫度:4°C )。取上清400 1，添加200 1 0. 05%TSP重水溶液？ 5mm核磁共振樣品管中，混勻，于4 °C冰箱保存，備用。3.氫核磁共振測(cè)定
上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調(diào)用CPMG馳豫編輯脈沖序列。采用預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為^，譜寬8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64k，累加次數(shù)1 次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置，獲得自由衰減信號(hào)(FID信號(hào))。FID信號(hào)經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標(biāo)準(zhǔn)1，將所有數(shù)據(jù)以表格EXCEL格式儲(chǔ)存。4.數(shù)據(jù)處理和分析
將EXCEL格式儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，先對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，然后導(dǎo)入SIMPCA-11軟件， 啟動(dòng)主成分分析模式進(jìn)行分析。5.結(jié)果判斷方式
將獲得的各主成分分別為坐標(biāo)進(jìn)行二維圖形制作。將治療組的二維分布點(diǎn)區(qū)域與正常組的二維分布點(diǎn)區(qū)域和模型組二維分布點(diǎn)區(qū)域比較，如治療組回歸正常組局域，則判斷該中藥復(fù)方為有效；如治療組沒有回歸正常組局域，仍處于模型組局域，則判定該中藥復(fù)方為無效；如治療組沒有回歸正常組局域，也不同于模型組局域，則判定該中藥復(fù)方為有毒副作用。


圖1是實(shí)施例1正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結(jié)果圖示。圖2是實(shí)施例1正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識(shí)別分析結(jié)果圖示。圖3是實(shí)施例2正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結(jié)果圖示。圖4是實(shí)施例2正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識(shí)別分析結(jié)果圖示。
具體實(shí)施方式
實(shí)施方式1:
實(shí)驗(yàn)以健康Wistar大鼠27只，雌雄各半，體重210 230g，分為正常組、模型組、清熱解毒方治療組，每組9只。模型組實(shí)驗(yàn)前1 禁食、不限水，實(shí)驗(yàn)時(shí)以10%水合氯醛按Iml/ kg劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸，在距其末端2cm處以1號(hào)絲線結(jié)扎， 再用18號(hào)針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹造模。清熱解毒方治療組在造模后，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、 6g生藥/kg，每日1次，連續(xù)72h。然后正常組、模型組、清熱解毒方治療組治療組分別進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。血液經(jīng)高速低溫離心(轉(zhuǎn)速15，OOOrpm ；時(shí)間10分鐘；溫度4°C )。取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振樣品管中，混勻，于4 °C冰箱保存，上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調(diào)用CPMG 馳豫編輯脈沖序列。采用預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為^，譜寬8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64k， 累加次數(shù)1 次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。FID信號(hào)經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標(biāo)準(zhǔn)1，將所有數(shù)據(jù)以表格EXCEL格式儲(chǔ)存，用于模式識(shí)別分析。模式識(shí)別采用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析結(jié)果如下(分別用二維圖形直觀表示)。1.正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結(jié)果(見圖1)
圖1中的每個(gè)點(diǎn)都代表一個(gè)樣本(Δ正常組；+模型組)。可以看出，每個(gè)樣本并不重疊，說明樣本之間存在個(gè)體差異，與實(shí)際狀況一致。但正常組和模型組內(nèi)的樣本分別相對(duì)集中，且樣本的組與組間有明顯的差異，說明樣本個(gè)體差異小于組間差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明不同生理狀態(tài)下的總代謝物譜確實(shí)是不同的。2.正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識(shí)別分析結(jié)果(圖2): 從圖2中( 正常組；Δ模型組；+清熱方治療組)可以看出，模型大鼠經(jīng)清熱解毒方
治療7 后，其中7個(gè)樣本的血漿總代謝物確實(shí)已基本回歸正常組區(qū)域，但尚未完全與正常組的樣本重合，說明該方在給藥7 后顯示了非常良好的治療效果，但尚未完全治愈。另一個(gè)樣本則處于既不同于正常組，也不同于模型組的第三方，說明該方對(duì)個(gè)別模型動(dòng)物有毒副作用?？膳袛嗲鍩峤舛痉綄?duì)膿毒癥的有效率約為87. 5%的治療，至完全治愈尚需要延長治療時(shí)間。但該方有一定的毒副作用，需要進(jìn)一步確定。
實(shí)施方式2:
實(shí)驗(yàn)以健康Wistar大鼠27只，雌雄各半，體重210 230g，分為正常組、模型組、涼血活血方治療組，每組9只。模型組實(shí)驗(yàn)前1 禁食、不限水，實(shí)驗(yàn)時(shí)以10%水合氯醛按Iml/ kg劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸，在距其末端2cm處以1號(hào)絲線結(jié)扎， 再用18號(hào)針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔后逐層關(guān)腹造模。涼血活血方治療組在造模后，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、 6g生藥/kg，每日1次，連續(xù)72h。然后正常組、模型組、清熱涼血活血方治療組治療組分別進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。血液經(jīng)高速低溫離心(轉(zhuǎn)速15，OOOrpm ；時(shí)間10分鐘；溫度4°C )。 取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振樣品管中，混勻，于4°C冰箱保存，備用。上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調(diào)用CPMG 馳豫編輯脈沖序列。采用預(yù)飽和方式抑制水峰，飽和時(shí)間為^，譜寬8000Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64k， 累加次數(shù)1 次，預(yù)飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。FID信號(hào)經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為一維NMR譜圖。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，設(shè)為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標(biāo)準(zhǔn)1，將所有數(shù)據(jù)以表格EXCEL格式儲(chǔ)存，用于模式識(shí)別分析。模式識(shí)別采用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析結(jié)果如下(分別用二維圖形直觀表示)。1.正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結(jié)果(見圖3)
圖3中的每個(gè)點(diǎn)都代表一個(gè)樣本(Δ正常組；+模型組)?？梢钥闯觯總€(gè)樣本并不重疊，說明樣本之間存在個(gè)體差異，與實(shí)際狀況一致。但正常組和模型組內(nèi)的樣本分別相對(duì)集中，且樣本的組與組間有明顯的差異，說明樣本個(gè)體差異小于組間差異。2.正常組、模型組與涼血活血方治療組血清總代謝物的模式識(shí)別分析結(jié)果(圖4): 從圖4中可看出( 正常組；Δ模型組；+涼血方治療組)，模型大鼠經(jīng)涼血活血方治療
7 后，8個(gè)治療樣本中有4個(gè)樣本，即50%樣本的血清漿總代謝物確實(shí)已回歸正常組，顯示了良好的治療效果，而另4個(gè)樣本(50%)樣本還處于模型組區(qū)域附近，但也顯示了向正常組區(qū)域回歸的趨勢(shì)，說明該方在給藥7 后，對(duì)膿毒癥有50%的治療效果。在此處鍵入技術(shù)領(lǐng)域描述段落。
權(quán)利要求
1.一種中藥復(fù)方治療膿毒癥的藥效評(píng)價(jià)方法，其內(nèi)容包括(1)動(dòng)物模型；(2)樣品采集；(3)測(cè)定方法；(4)數(shù)據(jù)處理和分析；(5)藥效判斷等部分。
2.如權(quán)利要求1中所述的(1)動(dòng)物模型，動(dòng)物可以為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴等；造模方法可以是本發(fā)明中的盲腸結(jié)扎穿孔法等手術(shù)法，也可以是藥物致模法；權(quán)利要求1中所述的(2)樣品采集，可以是本發(fā)明中的采集血漿，也可以是采集尿液、 糞便、唾液、或組織勻漿液。
3.如權(quán)利要求1中所述的(3)測(cè)定方法，可以是本發(fā)明中的氫核磁共振法，也可以是高速液相層析法、超高速液相層析法、毛細(xì)管電泳法，質(zhì)譜法、以及以上技術(shù)的聯(lián)用方法， 如高速液相層析-氫核磁共振連用法，超高速液相層析-氫核磁共振連用法，高速液相層析-質(zhì)譜連用法，超高速液相層析-質(zhì)譜連用法，質(zhì)譜-質(zhì)譜連用法等。
4.如權(quán)利要求1中所述的(4)數(shù)據(jù)處理和分析，可以是本發(fā)明中的主成分分析法，也可以是PLS法，PLS-DA法，或者是采用各種數(shù)據(jù)過濾后的分析法。
5.如權(quán)利要求1中所述的(5)藥效判斷方法，主要是以治療后的內(nèi)源性總代謝產(chǎn)物在以各種提取的主成分為坐標(biāo)所作的二維或三維中樣品點(diǎn)分布區(qū)域，以正常和模型樣品點(diǎn)分布區(qū)域?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行比較，如治療后的樣品點(diǎn)分布區(qū)域回歸正常樣品點(diǎn)分布區(qū)域，可判定該藥為有效；如治療后的樣品點(diǎn)分布區(qū)域沒有回歸正常樣品點(diǎn)分布區(qū)域，仍處于模型樣品點(diǎn)分布區(qū)域，可判定該藥為無效；如治療后的樣品點(diǎn)分布區(qū)域既沒有回歸正常樣品點(diǎn)分布區(qū)域，又與模型樣品點(diǎn)分布區(qū)域不同，可判定該藥為有毒副作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥復(fù)方治療膿毒癥的藥效評(píng)價(jià)方法。以膿毒癥模型大鼠為對(duì)象，以其血漿中的總代謝產(chǎn)物為分析對(duì)象，以1H-NMR為檢測(cè)手段，采用主成分分析或最小偏二乘法為數(shù)據(jù)處理方法，以正常組、模型組和治療組的血漿中總代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律為指標(biāo)，以治療后的血漿中總代謝產(chǎn)物是否回歸正常判斷中藥復(fù)方是否具有藥效的方法。
文檔編號(hào)G01N33/15GK102183618SQ20111005214
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者劉洪斌, 吳咸中, 李云志, 李文華, 羅喬奇, 黃連, 黃靜 申請(qǐng)人:四川大學(xué)