專利名稱：微量、快速測(cè)定微藻油脂含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微藻生物能源領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種微量、快速測(cè)定微藻中油脂含量的方法。該方法僅需微量微藻藻液即可快速完成所選藻種中油脂含量的測(cè)定，可避免冗長(zhǎng)繁瑣的油脂提取步驟，大大縮短油脂含量測(cè)定的時(shí)間；同時(shí)該方法操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，無(wú)需昂貴的試劑及設(shè)備。利用該方法可快速完成富油微藻的篩選、含油微藻培養(yǎng)期間油脂含量的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而為尋找、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物柴油原料提供高效的途徑。
背景技術(shù)：
人類文明的進(jìn)步很大程度上依賴于能源的發(fā)展，目前人類所使用的能源中以化石燃料為主，而文明經(jīng)濟(jì)的迅速增長(zhǎng)導(dǎo)致人類對(duì)于能源的需求量迅速上升。當(dāng)今世界能源危機(jī)加深，化石燃料的短缺及其帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題也日益凸顯，因此尋找環(huán)境友好的可再生能源已成為世界各國(guó)所關(guān)注的問(wèn)題。生物柴油作為一種可再生、環(huán)境友好型的新型能源已備受關(guān)注，其來(lái)源以微藻最受關(guān)注，原因在于微藻具有產(chǎn)油量高、生長(zhǎng)速度快并且易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此最適宜作為生物柴油的生產(chǎn)原料。基于此，微藻生物柴油已成為新能源領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，其發(fā)展對(duì)于減少化石燃料的使用及保證國(guó)家能源安全具有重要意義。富油微藻的篩選、培養(yǎng)及其油脂含量的測(cè)定是獲取高質(zhì)量藻種的必經(jīng)之路，在此過(guò)程中，往往需要針對(duì)較多的微藻樣品進(jìn)行頻繁的油脂定量，而對(duì)于不同培養(yǎng)時(shí)期微藻油脂的跟蹤測(cè)定也較為重要。傳統(tǒng)的微藻油脂含量測(cè)定方法為有機(jī)溶劑提取法，即稱取一定量干藻粉樣品，使用醚類、正己烷或氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)行回流提取，收集提取液待溶劑揮干后烘至恒重，根據(jù)最后所獲得的油脂干重及藻粉質(zhì)量計(jì)算油脂含量。該方法所需的樣品多 (一般為干藻粉2 5g)、有機(jī)溶劑消耗量大且操作步驟繁瑣、所需時(shí)間冗長(zhǎng)，易因外界因素干擾而產(chǎn)生誤差，因此不利于系統(tǒng)操作。新興的熒光分光光度法是使用熒光染料尼羅紅配制成一定濃度的染液，并將該染液直接加入已知濃度的微藻藻液中，黑暗條件下孵育5 IOmin后測(cè)定其熒光強(qiáng)度(熒光條件激發(fā)光波長(zhǎng)480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)570 590nm)，再依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及樣品藻液染色的熒光強(qiáng)度計(jì)算油脂含量。該方法大大減少了樣品消耗量與測(cè)定時(shí)間，簡(jiǎn)便易行，但昂貴的熒光染料及檢測(cè)設(shè)備限制了該方法在生產(chǎn)中的應(yīng)用，加之需要毒性較強(qiáng)的二甲基亞砜(DMSO)或丙酮作為染色液溶劑，不利于實(shí)際操作。因此，尋找樣品消耗量低、操作快捷安全、成本低廉的油脂含量測(cè)定方法具有重要意義。香蘭素(vanillin)又稱為香草醛、香茅醛，學(xué)名為3_甲氧基_4_羥基苯甲醛，分子式為C8H8O3,分子量152. 14。香蘭素廣泛用于化妝香精及飲料、食品的增香劑，同時(shí)也是抗癲癇、多動(dòng)癥藥物。此外，香蘭素在一定的條件下還可以同脂類起顏色反應(yīng)，其原理為 香蘭素的羥基與磷酸作用產(chǎn)生磷酸香酯，并且香蘭素分子中的電子分配也發(fā)生改變，使醛基變成反應(yīng)增強(qiáng)的醛基；而脂類中的不飽和成分與濃硫酸作用水解后生成碳鐺離子，碳鐺離子與磷酸香酯的羰基起反應(yīng)，生成紅色醌化物，混合物顯示由黃色-粉紅色-紫紅色的變化情況，在波長(zhǎng)為530nm處有最大吸收，其OD53tl同脂類含量呈線性關(guān)系。因此根據(jù)生成物的顏色變化情況及其在530nm處的吸光度即可確定微藻樣品中的脂類含量。該方法操作簡(jiǎn)單、所需微藻樣品少、反應(yīng)靈敏度高、成本低廉、幾乎不受儀器使用的限制，可實(shí)現(xiàn)富油微藻的快速篩選及微藻培養(yǎng)過(guò)程中油脂含量的跟蹤測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種微量、快捷、成本低廉的油脂測(cè)定方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方法為1染色劑的配制準(zhǔn)確稱取0. 1 0. 15g香蘭素，溶于20ml蒸餾水中，之后以85 %濃磷酸定容至 100ml,即配制成染色劑。該染色劑需儲(chǔ)存在棕色瓶中，室溫下可放置1 2個(gè)月。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取植物油脂或微藻油脂或三油精作為標(biāo)準(zhǔn)物，以氯仿為溶劑，配制成一定濃度的母液，備用。按照一定的體積梯度分別取不同量植物油母液置于潔凈的玻璃試管中，氮?dú)饬鞔蹈扇軇┖蠹尤?00 μ 1的蒸餾水，之后加入1 aiil 98%濃硫酸，搖勻后沸水浴10 20min， 水冷至室溫。徐徐加入3 5ml染色劑并輕輕震蕩試管以確保其混勻，37°C水浴15 20min后， 用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值0D53(i。3微藻藻液生物量濃度的測(cè)定使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法或分光光度法或干重定量法等常規(guī)方法測(cè)定微藻藻液樣品的生物量濃度，分述如下1)血球板計(jì)數(shù)法取少量藻液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使用滅菌的滴管取稀釋藻液滴入血球計(jì)數(shù)板中，于40倍物鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)三次取其均值；2)分光光度法取少量藻液，離心，蒸餾水洗3次，使用蒸餾水懸浮藻體并混勻，于分光光度計(jì)中測(cè)定其吸光值，根據(jù)預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定藻液濃度。3)干重定量法取20 50ml藻液，使用預(yù)先稱重的濾膜過(guò)濾，之后將帶有藻體的濾膜置于100°c烘箱中烘lh，冷卻后稱重，減去濾膜重量即為藻體干重。4樣品染色及測(cè)定取已知生物量濃度的微藻藻液50-150 μ 1置于潔凈的玻璃試管，加入1 aiil 98%濃硫酸，搖勻后沸水浴10 20min，其余步驟同2)5油脂含量的計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所測(cè)定的光吸收值OD53tl的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式即可得出樣品中油脂的質(zhì)量，再依據(jù)微藻藻液的生物量濃度即可得出該樣品中的油脂含量。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。實(shí)施例1 富油微藻的篩選第一步，準(zhǔn)確稱取0. 1 0. 15g香蘭素，溶于20ml蒸餾水中，之后以85%濃磷酸定容至100ml，即配制成染色劑。該染色劑需儲(chǔ)存在棕色瓶中，室溫下可放置1 2個(gè)月。第二步，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬定準(zhǔn)確稱取IOOmg植物油脂或者微藻油脂或三油精，溶于IOOml氯仿，配制成lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)液。取10 100 μ 1標(biāo)準(zhǔn)液置于潔凈試管中，氮吹揮干氯仿后分別于試管中加入100 μ 1蒸餾水，之后加入1 2ml濃硫酸，沸水浴10 20min，迅速水冷至室溫后，加入香蘭素染液并混勻，37°C下反應(yīng)15 20min后，分別用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值OD53tl,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度及其染色后光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。第三步，取已培養(yǎng)至穩(wěn)定期后期的微藻藻液樣品，并按照常規(guī)的顯微計(jì)數(shù)法或分光光度法或干重法確定其生物量濃度。第四步，取50 150μ 1上步已確定生物量濃度的微藻藻液置于潔凈的玻璃試管中，加入濃硫酸1 2ml后混勻，并置于沸水浴中加熱10 20min，取出水冷至室溫。第五步，向各試管中緩緩加入3 5ml香蘭素染液，混勻后置于37°C水浴中15 20min,冷卻至室溫后，用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值0D53Q。第六步，根據(jù)所選微藻藻液的生物量濃度、藻液染色處理后所得的光吸收值OD53tl, 并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算待測(cè)微藻樣品中的油脂含量，篩選其中油脂含量相對(duì)較高微藻藻種，及時(shí)保種，以備后續(xù)研究。實(shí)施例2 快速監(jiān)測(cè)微藻大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中的油脂積累情況微藻的大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中，通常是以油脂累積情況及生物量的增長(zhǎng)情況來(lái)確定其最佳采收期，據(jù)此，我們可利用該發(fā)明所述方法，掌握微藻在大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中的油脂累積情況，及時(shí)確定采收時(shí)間。第一步，在微藻大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)取培養(yǎng)池中的藻液樣品進(jìn)行生物量的測(cè)定，并采用本發(fā)明所述方法測(cè)定其油脂含量。第二步，根據(jù)微藻在不同培養(yǎng)時(shí)期的生物量和油脂含量，計(jì)算微藻在大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程中油脂的積累情況，以此確定最佳采收時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種微量、快速測(cè)定微藻油脂含量的方法，其特征在于它是由下列步驟實(shí)現(xiàn)的a)取培養(yǎng)過(guò)程中的微藻藻液，并采用常規(guī)方法確定其生物量濃度；b)取適量上述已確定生物量濃度的藻液用處理劑進(jìn)行簡(jiǎn)單處理；c)加入一定量的染色劑，充分反應(yīng)后用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值OD53tl；d)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算供試微藻中的油脂含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所取的微藻藻液可以采用血球板計(jì)數(shù)法或分光光度法或干重法確定其生物量濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，取50 150μ 1已確定生物量濃度的藻液用處理劑進(jìn)行簡(jiǎn)單處理即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求3所述的方法，所用處理劑為98%濃硫酸，簡(jiǎn)單處理方法為于藻液中直接加入處理劑，震蕩均勻后，沸水浴10 20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，染色劑是用香蘭素與85%濃磷酸按照常規(guī)溶液配制方法配制而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，測(cè)定過(guò)程中需緩緩加入染色劑時(shí)振搖混勻，并于37°C 水浴15 20min，待其冷卻至室溫后，于2小時(shí)內(nèi)用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值0D53(1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法所用標(biāo)準(zhǔn)曲線是由以下途徑獲得于潔凈試管中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物，之后加入50 150 μ 1蒸餾水，按權(quán)利要求1至權(quán)利要求6所述方法分別加入濃硫酸處理劑和香蘭素染色劑，充分反映后用分光光度計(jì)測(cè)定光吸收值 OD53tl，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度及其染色后光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用所選微藻藻液的生物量濃度、藻液染色處理后所得的光吸收值OD53tl，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算待測(cè)微藻樣品中的油脂含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述，所選擇的標(biāo)準(zhǔn)物可以是植物油脂或微藻油脂或三油精。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微量、快速測(cè)定微藻油脂含量的方法，其原理是微藻中的油脂同香蘭素染色劑相互作用后生成具有顏色的物質(zhì)，在波長(zhǎng)為530nm條件下有最大吸收值，且油脂含量與吸光度成正比。該方法是將已知生物量濃度的微藻藻液與處理劑和染色劑反應(yīng)后，測(cè)定其光吸收值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)藻液中的油脂含量，從而完成微藻油脂的快速定量，具有快速、所需樣品少、靈敏度高、易于實(shí)施及不需昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。利用該方法可實(shí)現(xiàn)微藻樣品油脂含量的快速檢測(cè)、掌握微藻規(guī)模化培養(yǎng)油脂累積情況以及富油藻種的快速篩選。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102288558SQ201110118919
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月30日
發(fā)明者劉平懷, 劉洋洋, 張森, 時(shí)杰, 楊勛, 汪春牛, 許瓊情, 郝宗娣, 陳德力 申請(qǐng)人:海南大學(xué)