專利名稱：一種快速檢測鉛離子的膠體金層析試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種快速檢測鉛離子的膠體金層析試紙條及其制備方法和用途， 屬于免疫學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鉛是當前工業(yè)生產(chǎn)中的一種主要原料，對人體的危害是很大的。鉛中毒可引起神經(jīng)衰弱和消化不良，嚴重的可發(fā)生鉛腦病，形成癲癰、癡呆或精神煩躁錯亂，視力減退甚至失明。1923年開始在汽油中加入鉛用作抗爆劑以后，更加速了全球性鉛的污染。鉛的污染已經(jīng)遍及全球范圍，格陵蘭和南極的冰中含鉛量已有成倍的增加。因此可以說如今世界上已難找到土壤鉛含量不受人類活動影響的一片“凈土”。我國地下水質(zhì)量標準(GB/T14848-93)中規(guī)定，主要適用于集中式生活飲用水水源及工、農(nóng)業(yè)用水的鉛離子限量彡0. 05mg/L。目前，檢測鉛離子的方法主要有儀器分析法和酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。目前常用的重金屬儀器分析檢測方法包括ICP-AES、石墨爐原子吸收法、紫外-可見分光光度法、原子熒光分析法等。以上這些檢測方法雖然能精確測量樣品中單種金屬的總量，但檢測相對費力、費時、費用昂貴，需要進行大量的樣品預(yù)處理，且樣品的檢測需在大型分析設(shè)備的室內(nèi)進行，不能用于現(xiàn)場檢測。由于上述缺點的限制，檢測的樣品數(shù)受限制，導(dǎo)致在隨后進行的重金屬污染程度和風險的評估工作存在較大的不確定性。重金屬免疫學檢測方法的建立為這類污染物的檢測提供了另一種途徑。該方法具有檢測速度較快、費用低廉、簡單易攜、 高度的靈敏度和選擇性的特點。這種方法理論上能應(yīng)用于能產(chǎn)生合適抗體的任何污染物質(zhì)。自從Reardan等人首次通過金屬-鰲合劑抗原產(chǎn)生并分離出單克隆抗體以來(Reardan 等，1985)，國外越來越多的抗Hg、In、Cd、Pb等金屬鰲合劑復(fù)合物抗體被研制出來(Johnson 等，2003)，能用于重金屬污染物的現(xiàn)場快速檢測和常規(guī)檢測，這對于重金屬污染地區(qū)的補救和恢復(fù)工作具有很大的意義，因而發(fā)展和普及應(yīng)用潛力很大。國外學者通過選擇或合成雙功能鰲合劑鰲合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián)制備出完全抗原，進一步制備出金屬特異性單抗。目前應(yīng)用免疫學檢測方法檢測環(huán)境中的重金屬離子還處于實驗室的試驗階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有檢測鉛離子的技術(shù)的不足和缺陷，提供一種快速檢測鉛離 子的金標層析試紙條的制備方法，使其能更加快速、靈敏、簡便地檢測鉛離子殘留。本發(fā)明的技術(shù)方案一種鉛離子膠體金層析檢測試紙條，由襯板(1)和在襯板上依次銜接的樣品墊(2)、金標結(jié)合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)組成金標結(jié)合墊為吸附鉛離子金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上依次有用鉛離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線(6)，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形對照線C線(7)，兩條線平行排列。所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；所述的包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜；所述的吸水墊為吸水濾紙或濾油紙。所述的鉛離子金標抗體為膠體金標記的鉛離子單克隆抗體；所述的偶聯(lián)鉛離子的載體蛋白為匙孔血藍蛋白KLH，或為牛血清白蛋白BSA，螯合劑為ITCBE。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的檢測試紙條具有下列優(yōu)點
①特異性強，敏感性高。該 膠體金層析檢測試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標記對抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，試紙條具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到5ppb。②簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條，無需任何其它試劑和儀器， 可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在IOmin內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。③結(jié)果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測結(jié)果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時，表示在被檢樣品中含有被檢物， 顯示兩條紅色線T線和C線時，表示在被檢樣品中不含被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準確， 簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。④節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條，比用儀器分析和ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟、社會效益。


圖1、鉛離子膠體金層析檢測試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。1、襯板，2、樣品墊，3、金標結(jié)合墊，4、包被膜，5、吸水墊，6、T線，7、C線。圖2、鉛離子膠體金層析檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。6、T線，7、C線。
具體實施例方式要制成鉛離子檢測試紙條，首先需要制備偶聯(lián)鉛離子的載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測線(T線)和抗體；而且需要制備鉛金標抗體，用于制備相應(yīng)的金標抗體纖維棉；另外需要制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備對照線(C線)。1、鉛與載體蛋白偶聯(lián)
免疫抗原鉛_對硫氰芐基_乙二氨四乙酸_匙孔血藍蛋白(Pb-ITCBE-KLH)的制備。先將2mg的ITCBE和4. 5mg的KLH蛋白在pH9. 4的HEPES緩沖液中反應(yīng)24h后， 在4°C、6000r/min的條件下，超濾IOmin去除未偶聯(lián)上的ITCBE，再用pH7. 4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入1 mol/L的Pb2+標準溶液100 μ L反應(yīng)Ih后，超濾去除未鰲合上的Pb2+，再用ρΗ7. 4的HEPES緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液。使用前，用0. 1 mol/L EDTA和0. lmol/L pH7. 4的HEPES緩沖液對超濾離心管預(yù)處理。包被抗原鉛-對硫氰芐基-乙二氨四乙酸-牛血清白蛋白(Pb-ITCBE-BSA)的制備，用BSA代替KLH，方法同上。無Pb2+檢測抗原對硫氰芐基_乙二氨四乙酸_牛血清白蛋白(ITCBE-BSA)的制備，用三蒸水替代Pb2+的標準溶液即可，用BSA替代KLH，其余步驟同上。2、抗鉛離子單克隆抗體的制備
單抗制備用鉛離子載體蛋白結(jié)合的免疫抗原(Pb-ITCBE-KLH)免疫6_8周齡雌性 BALB/c小鼠，免疫劑量為IOOyg/次，采用快速佐劑，腿部肌肉注射。首免，用鉛離子載體蛋白免疫抗原與等體積快速佐劑1 1混合，充分混勻；首免3周后進行加強免疫，方法同上， 連續(xù)免疫3-4次，每次間隔3周，最后一次免疫后10 15天。完全抗原金屬離子-螯合劑_載體蛋白與螯合劑_載體蛋白同時包被酶標板，以間接ELISA檢測小鼠血清效價，結(jié)果顯示小鼠血清效價可達1 8000 1 128000，并金屬離子-螯合劑-載體蛋白的OD值遠大于螯合劑_載體蛋白檢測值，說明制備的抗原具有較好的免疫原性。免疫3-4次后對小鼠進行尾靜脈加強免疫3、單克隆抗體的制備和腹水純化
取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗鉛離子與ITCBE螯合劑絡(luò)合物的單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養(yǎng)，注射細胞進小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腹水；采用辛酸硫酸銨法純化。4、鉛離子金標抗體和金標物結(jié)合墊的制備
檸檬酸三鈉還原法制備膠體金由于氯化金極易吸濕，因此使用小劑量封裝的氯化金時，必須一次配完。將Ig的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4°c冰箱內(nèi)保存，保存時間長達幾個月至1年左右。再取1%的氯金酸溶液10mL，配制成濃度為0. Ig/ L的氯金酸溶液。取0. lg/L氯金酸溶液50 mL放入錐形瓶，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰并持續(xù)2min，在lOOr/min磁力攪拌下，加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，保持溫度和攪拌速度不變，繼續(xù)攪拌加熱6min，直至溶液呈透亮的酒紅色。室溫冷卻，4°C保存?zhèn)溆?。獲得直徑為20nm的膠體金溶液。用0. 1 mol/L K2CO3或0. 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液為pH 9.0，將10 mL膠體金溶液加入50 mL燒杯中，用電磁攪拌器250 rpm攪拌，逐滴加入150 μ L抗體溶液，平衡過夜。逐滴加入5% BSA，使BSA的終濃度為1%，持續(xù)攪拌5 min，用以飽和游離的膠體金。再將金標抗體溶液常溫低速(3000 rpm)離心15 min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀。取紅色上清溶液于4°C以11000 rpm離心40 min。溶液分為二層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀。輕吸并棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液混懸，恢復(fù)原體積后再離心， 所用重懸液為0.05M的CBS緩沖液。如此重復(fù)2 4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10，4°C保存?zhèn)溆茫@得鉛離子膠體金標記抗體。用0. 05M的CBS緩沖液以1 100 500稀釋的膠體金標記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，37 °C干燥，制得鉛離子的金標結(jié)合墊。4、鉛離子膠體金層析試紙條檢測反應(yīng)原理
鉛(Pb)原子量僅為207，屬于小分子物質(zhì)。抗體對游離鉛不能捕獲，需要檢測Pb-ITCBE 絡(luò)合物。本發(fā)明采用競爭法，即樣品中的Pb-ITCBE絡(luò)合物和固定在包被膜上的包被抗原 Pb-ITCBE-BSA競爭膠體金標記的抗Pb-ITCBE單克隆抗體。當試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細作用從下往上泳動，溶解金標墊上干燥的金標抗體，若待測樣品中鉛含量小于lOng/mL，則金標抗體會直接泳動到檢測線(T)和硝酸纖維膜上的Pb-ITCBE-BSA發(fā)生免疫反應(yīng)，從而膠體金顆粒發(fā)生聚集，形成紅色的線條，然后其他未結(jié)合的金標抗體繼續(xù)通過毛細管作用向前泳動，與控制線(C)的羊抗鼠二抗發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，同樣形成紅色線條，這樣包被膜上就會有兩條紅色線條，表示樣品為陰性。若待測樣品中鉛含量大于lOng/mL，金標抗體全部和樣品中的 Pb-ITCBE發(fā)生免疫結(jié)合，就不會再有抗體與T線包被原結(jié)合，從而T線就不會有紅色線條出現(xiàn)，表示樣品為陽性。C線是為檢驗金標免疫層析方法本身是否有效而設(shè)定的，所以無論樣品中是否存在Pb，控制線都應(yīng)該顯色。如果控制線不顯色，則說明試紙條失效。實施例1、把選定濃度的包被抗原及羊抗鼠IgG噴在包被膜上，分別作為檢測線 (T)和控制線(C)，在37°C烘箱干燥10 Hiin0以同樣方法，將一定濃度的金標抗體包被在結(jié)合墊上。試紙條組成為一個襯板，在其上按順序粘上樣品墊、金標結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。 將貼好的板切割成3mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。檢測樣品前處理成消化液取l.Og豬肉勻質(zhì)樣品，在聚四氟乙烯坩堝中加入硝酸 2mL，室溫放置4h。將樣品轉(zhuǎn)移到消化管中，用2mL硝酸多次潤洗坩堝，全部轉(zhuǎn)移進消化管， 再加 入1. 5mL的30%過氧化氫。放入微波消化儀，微波加熱，消化15 min。取出靜置至冷卻，調(diào)節(jié)PH到7. 2，將消化液轉(zhuǎn)移到20mL容量瓶，定容待測。操作方法按照1 1的體積比將豬肉樣品消化液和4mmol/L的ITCBE螯合劑混勻， 使鉛離子和ITCBE充分螯合，得到豬肉樣品溶液。將鉛離子膠體金層析檢測試紙條樣品墊端插入待測樣品液100 μ L中，插入深度不超過標記線，約3-5 min讀取試紙條檢測結(jié)果，讀取時，試紙條水平放置，正面觀察。結(jié)果判定如果在包被膜上僅有C線一條紅線顯色，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中鉛離子濃度大于lOng/mL ；如果在包被膜上C線和T線兩條紅線都顯色，表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中鉛離子濃度低于lOng/mL ；如果在包被膜上C線紅線不顯色，則表明試紙條已失效。
權(quán)利要求
1.一種鉛離子膠體金層析檢測試紙條，其特征在于由襯板(1)和在襯板上依次銜接的樣品墊(2)、金標結(jié)合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)組成金標結(jié)合墊為吸附鉛離子金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上依次有用鉛離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線(6)，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形對照線C線(7)，兩條線平行排列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的樣品墊為玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；所述的包被膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜、或羧化纖維素膜；所述的吸水墊為吸水濾紙或濾油紙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征是所述的鉛離子金標抗體為膠體金標記的鉛離子單克隆抗體；所述的偶聯(lián)鉛離子的載體蛋白為匙孔血藍蛋白KLH，或為牛血清白蛋白BSA，螯合劑為對硫氰芐基-乙二氨四乙酸ITCBE。
全文摘要
一種快速檢測鉛離子的膠體金層析試紙條，屬于免疫學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成金標結(jié)合墊為吸附鉛離子金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上依次有用鉛離子偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式隱形對照線C線，兩條線平行排列。所提供的快速檢測鉛離子的金標層析試紙條特異性強，敏感性高；能更加快速、靈敏、簡便地檢測鉛離子殘留；結(jié)果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判；節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣；具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟、社會效益。
文檔編號G01N33/532GK102253213SQ20111018747
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者劉麗強, 匡華, 宋珊珊, 王利兵, 胥傳來, 趙媛, 邢常瑞, 馬文蔚 申請人:江南大學