專利名稱：一種精漿γ-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種體外診斷用試劑盒及其應用， 具體地說是一種精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
精漿Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(簡稱Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶)主要來源于前列腺，其含量約是血清中的200-500倍，其活性的檢測可用于評價前列腺的功能；另外，精漿 Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶是谷胱甘肽代謝的關(guān)鍵酶，在保護精子免受氧自由基損害方面也起著非常重要的作用。在前列腺功能低下患者中，其Y-L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性明顯下降；在前列腺癌以及前列腺良性增生患者中，其活性顯著增高。目前，檢測精漿Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的方法主要是化學比色法，該法多為手工或半自動操作，由于其活性過高，樣本需要預稀釋，加樣程序多，操作步驟復雜，試劑和樣品混勻一定的時間后，通過分光光度計逐一比色測定，再根據(jù)公式計算出結(jié)果，不但耗時耗材耗力，不符合規(guī)模效益，而且人為誤差也比較大，結(jié)果一致性不是很好?，F(xiàn)在，臨床生化檢驗基本上都實現(xiàn)了自動化分析。全自動生化儀就是將原始手工操作過程中的取樣、混勻、溫育、檢測、結(jié)果計算、判斷、顯示和打印結(jié)果及清洗等步驟全部或者部分自動運行，由于其測量速度快、準確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)已在防疫站、各級醫(yī)院、計劃生育服務站得到了廣泛使用，配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗的收益及效率。遺憾的是，截止到目前，無論是國外還是國內(nèi)，對于精漿Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶項目的檢測， 除了早期的科研成果外，尚沒有一種可與全自動生化儀相配套的、商品化的檢測試劑盒問世，因此，建立一種與全自動生化儀相配套使用的精漿Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒及檢測方法就顯得尤為迫切和重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，填補市場上的空缺，提供一種與全自動生化儀相配套使用的精漿Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供所述精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒在檢測精漿Y-L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性中的應用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案一種精漿γ -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒，包括Rl試劑和R2試劑； 其中，Rl試劑包括含量的組份100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3三羥甲基氨基甲烷緩沖液、 90-110mmol/L雙甘氨肽和0. 01-0. 防腐劑；R2試劑包括以下含量的組份100-200mmol/ L、ρΗ8· 0-8. 3三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0. 5-3. Ommol/L底物和0. 01-0. 防腐劑；其中， 所述底物為L-Y-谷氨?；?ρ-硝基苯胺或L-Y-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基苯胺；所述的防腐劑為疊氮鈉、硫柳汞、慶大霉素或ftx)Clin系列防腐劑中的任何一種。
所述的精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒在測定精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性中的應用。所述的精漿Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒在測定精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性中的應用，包括如下步驟1)樣品制備新鮮精液液化后通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上
清液即是；2)在全自動生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測項目Y-GT ；樣品試劑比1 100 ；檢測方法速率法；定標方法因子法；主波長405-410nm ；反應方向上升；反應時間36巧4秒；檢測時間90-120秒；3)定標操作采用因子法定標，直接輸入理論因子F值即可；4)樣本檢測將制備好的精漿樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動生化儀的相應位置上，全自動生化儀根據(jù)理論因子計算出樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放lymol p_硝基苯胺所需的酶量為一個酶活性單位；精漿中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF；其中，ΔΑ/min即每分鐘吸光度的變化率，F(xiàn)為已知。所述Rl試劑為液體溶液，所述緩沖溶液為PH8. 0-8. 3的Tris緩沖液，用于為反應提供適宜的反應條件；Rl試劑中，雙甘氨肽是與Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶催化足量底物分解產(chǎn)生的L-Y-谷氨酰基的有效結(jié)合量，用作L-Y-谷氨?；氖荏w。所述R2試劑為液體溶液，所述緩沖溶液為PH8. 0-8. 3的三羥甲基氨基甲烷(Tris) 緩沖液，用于為反應提供適宜的反應條件；R2試劑中的底物為L-Y-谷氨?；?ρ-硝基苯胺(L- Y -glutamyl-p-nitroanilide)，還可以是L- γ -谷氨酰基_3_羧基-4-硝基苯胺(L -Y -glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide)，用于γ -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶作用的底物；所述R2試劑中，底物的含量為0. 5-3. Ommol/L，低于底物的下限0. 5mmol/L時，會導致試劑盒的線性范圍降低，還會縮短試劑反應的線性期，高于底物的上限3. Ommol/L時，會使試劑盒的成本增加，吸光度不在儀器的檢測范圍內(nèi)，在0. 5-3. 0mmol/L范圍內(nèi)，底物的濃度越高， 每分鐘吸光度的變化速率越快。所述防腐劑為疊氮鈉，含量為0.01-0. 1%，該范圍在有效殺菌的同時不會對反應起任何副作用，可延長試劑盒的有效期；還可以是其它具有防腐作用的硫柳汞、慶大霉素或 ProClin系列防腐劑中的任何一種等，在緩沖溶液中起防腐的作用。上述應用的方法中，所述步驟1)中，所制備的精漿樣本可于分離當天檢測，也可于-20°C以下凍存?zhèn)溆?，至少可保?周以上，但應避免反復凍融；所述步驟2)中，樣本試劑比應根據(jù)全自動生化儀的參數(shù)而定，應考慮到全自動生化儀的最小加樣量，比色皿的反應液體積范圍等；所述步驟幻中，理論因子F值在不同的全自動生化儀上會有所不同，理論
因子F值的計算公式為:K= 103x^xt1000，其中，IO3為mmol至μ mol的轉(zhuǎn)化系數(shù)；Vt為
ε χ LxVs
反應液總體積；ε為P-硝基苯胺的理論摩爾消光系數(shù)；L為比色皿光徑(Icm) ；Vs為樣品體積；所述步驟4)中，當樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性過高，超出試劑盒的線性范圍時，應用生理鹽水稀釋后重測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即可。本發(fā)明的檢測方法是酶法檢測，所述的Rl試劑、R2試劑為含L-Y-谷氨?；?ρ-硝基苯胺、雙甘氨肽、Tris、防腐劑的緩沖溶液，檢測原理是，
L-γ-谷氨?；?ρ-硝基苯胺+雙甘氨肽y"GT > ρ-硝基苯胺+γ-谷氨?；p甘氨肽以L- Y -谷氨?；?ρ-硝基苯胺為底物，雙甘氨肽為谷氨?；氖荏w，在Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶的催化下，谷氨酰基轉(zhuǎn)移到雙甘氨肽分子上，同時釋放出有色產(chǎn)物P-硝基苯胺，P-硝基苯胺在405-410nm波長處有最大吸收峰，通過監(jiān)測405-410nm波長處ρ-硝基苯胺的每分鐘吸光度變化率，進而檢測出樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，突出的技術(shù)效果在于1、本試劑盒采用速率法檢測精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性，僅采用2種液體試劑，可于4°C保存?zhèn)溆?，與手工法的終點法相比，速率法更適于Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性的檢測，且試劑不需于_20°C凍存，試劑的種類和用量都大大減少；2、采用本試劑盒及檢測方法，樣本制備好后不需再稀釋200倍以上，檢測過程也不需單獨再做空白管、標準管，簡化了操作步驟，降低了人為誤差；所選底物特異性好，與酶的親和力強，反應速度快，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠；3、本發(fā)明實現(xiàn)了從手工向全自動檢測方法的轉(zhuǎn)變，填補了市場上的空缺，采用全自動生化儀進行自動化、規(guī)?；臋z測，釋放了大量的人力，節(jié)約了大量的耗材，對反應時間、反應過程的準確控制和監(jiān)測，顯著提高了檢測結(jié)果的準確性和可靠性；4、采用本發(fā)明可以在檢測同一份樣本Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性的同時，還可以與全自動生化儀相配套的精漿果糖、α-糖苷酶、鋅等試劑盒聯(lián)合使用，并同時檢測這些項目，檢測結(jié)束后，可以以報告的形式打印出同一份樣本所測項目的所有結(jié)果，可滿足醫(yī)院男性不育相關(guān)科室、人類精子庫、計劃生育研究所等機構(gòu)對精液質(zhì)量、精子篩選的需要，以及對于男性不育癥的輔助診斷等，大大提高了精液常規(guī)生化分析的效率和收益，非常適于常規(guī)檢測和推廣。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好的理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1本實施例中的一種精漿Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒為雙試劑，包括Rl試劑和R2試劑，分別按以下成分和用量配制
3)定標操作采用因子法定標，直接輸入理論因子F值10202即可；F值的計算公式如下

理論因子
其中，IO3為mmol至μ mol的轉(zhuǎn)化系數(shù)；Vt為反應液總體積即404 μ 1 ； ε為ρ-硝基苯胺的理論摩爾消光系數(shù)即9. 9 X IO3 ；L為比色皿光徑(Icm) ；Vs為樣品體積即4 μ 1。4)樣本檢測將1)中制備好的精漿樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動生化儀的相應位置上， 輸入樣本的檢測信息后，開始檢測。測試結(jié)束后，全自動生化儀根據(jù)理論因子自動計算出樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性。酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放Iymol ρ-硝基苯胺所需的酶量為一個酶活性單位；精漿中Y-L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF，其中，ΔΑ/min即每分鐘吸光度的變化率在全自動生化儀上自動測定給出，理論因子為已知。例如，全自動生化儀測得某份精漿中的ΔΑ/min為0. 1826，則該份精漿中谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性=0. 1826X10202 = 1862. 89U/L實施例6利用實施例3中的試劑盒檢測精漿中Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性的方法，具體操作步驟如下1)樣品制備新鮮精液液化后通過5000rpm離心lOmin，所獲得的上清液即是；2)在Olympus AU640全自動生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測項目Y-GT ；樣品量2μ1;Rl試劑和R2試劑用量比為4 1，Rl試劑量:160 μ 1 ；R2試劑量:40 μ 1 ；檢測方法速率法；定標模式MB (因子法)；主波長410nm;反應方向上升；主讀數(shù)點1:12;主讀數(shù)點2:17;3)定標操作采用因子法定標，直接輸入理論因子F值10202即可；F值的計算公式如下
Γ 、人門 IO3 X VtxlOOO IO3 χ 202 χ 1000理論因子F=-=---=10202
ε χ LxVs 9.9χ103 xlx2其中，IO3為mmol至μ mol的轉(zhuǎn)化系數(shù)；Vt為反應液總體積即202 μ 1 ； ε為ρ-硝基苯胺的理論摩爾消光系數(shù)即9. 9 X IO3 ；L為比色皿光徑(Icm) ；Vs為樣品體積即2 μ 1。4)樣本檢測
8
將1)中制備好的精漿樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動生化儀的相應位置上， 輸入樣本的檢測信息后，開始檢測。測試結(jié)束后，全自動生化儀根據(jù)理論因子自動給出樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性；酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放lymol p_硝基苯胺所需的酶量為一個酶活性單位；精漿中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF，其中，ΔΑ/min即每分鐘吸光度的變化率在全自動生化儀上自動測定給出，理論因子為已知；例如，某份精漿用生理鹽水稀釋2倍后，全自動生化儀測得的ΔΑ/min為0. 1060， 則該份精漿中Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性=0. 1060 X 10202X2 = 2162. 82U/L。實施例7在實施例1和實施例4的基礎(chǔ)上進行批內(nèi)和批間精密度的檢測(即本發(fā)明的試劑盒的檢測結(jié)果的重現(xiàn)性)選擇Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性低、高值的混合精漿樣本各1份，準備5個批次的檢測試劑盒，每個批次試劑盒測同一個濃度精漿樣本8次，共有40個數(shù)據(jù)，從5個批次中每一樣本重復測定8次的結(jié)果算出批內(nèi)精密度，從所有40個結(jié)果計算出批間精密度，結(jié)果均以變異系數(shù)的百分數(shù)即CV%表示。其中，CV%=標準差/平均值X100%，該系數(shù)越小，表明同一份樣本重復檢測結(jié)果的離散程度越小，即檢測結(jié)果的重現(xiàn)性越好。表1是采用所述試劑盒及檢測方法與手工或半自動檢測的精密度結(jié)果比較，表明采用本發(fā)明檢測精漿 Y -L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶的活性，結(jié)果重現(xiàn)性好。表1手工、半自動和全自動的精密度結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種精漿Y-L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒，其特征在于，包括Rl試劑和R2試劑；其中，Rl試劑包括以下含量的組份100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3三羥甲基氨基甲烷緩沖液、90-110mmol/L雙甘氨肽和0. 01-0. 防腐劑；R2試劑包括以下含量的組份 100-200mmol/L、pH8. 0-8. 3 三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0. 5-3. Ommol/L 底物和 0. 01-0. 1% 防腐劑；其中，所述底物為L-Y-谷氨酰基-ρ-硝基苯胺或L-Y-谷氨?；?3-羧基-4-硝基苯胺；所述防腐劑為疊氮鈉、硫柳汞、慶大霉素或I^oClin系列防腐劑中的任何一種。
2.權(quán)利要求1所述的精漿Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒在測定精漿 Y -L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于包括如下步驟1)樣品制備新鮮精液液化后通過3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液即是；2)在全自動生化儀上輸入基本參數(shù)如下 檢測項目Y -GT ；樣品試劑比1 100 ； 檢測方法速率法； 定標方法因子法； 主波長405-410nm ； 反應方向上升； 反應時間36- 秒； 檢測時間90-120秒；3)定標操作采用因子法定標，直接輸入理論因子F值即可；4)樣本檢測將制備好的精漿樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動生化儀的相應位置上，全自動生化儀根據(jù)理論因子計算出樣本中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的活性；酶活性單位U定義在上述反應條件下，每分鐘釋放Iymol ρ-硝基苯胺所需的酶量為一個酶活性單位；精漿中Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性(U/L) = ΔΑ/minXF； 其中，ΔΑ/min即每分鐘吸光度的變化率，F(xiàn)值為已知。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種精漿γ-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶活性定量檢測試劑盒，包括R1試劑和R2試劑；R1試劑包括以下含量的組份100-200mmol/L pH8.0-8.3三羥甲基氨基甲烷緩沖液、90-110mmol/L雙甘氨肽和0.01-0.1％防腐劑；R2試劑包括以下含量的組份100-200mmol/L pH8.0-8.3三羥甲基氨基甲烷緩沖液、0.5-3.0mmol/L底物和0.01-0.1％防腐劑。本發(fā)明還公開了該試劑盒在測定精漿γ-L-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶活性中的應用。本發(fā)明僅采用2種液體試劑，可直接使用，不需于-20℃凍存，試劑的種類和用量都顯著減少，樣本也不需要再稀釋200倍以上；所選底物特異性好，與酶的親和力強，反應速度快；與全自動生化儀配套使用，簡化了步驟，節(jié)省了試劑，降低了人為誤差，自動化、規(guī)?；臋z測，使檢測結(jié)果更加準確和可靠，且大大提高了檢測效率。
文檔編號G01N21/31GK102384893SQ201110233469
公開日2012年3月21日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者陸金春, 陳曉慧, 高建 申請人:南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責任公司