專利名稱：一種快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種以細(xì)胞膜親和色譜結(jié)合高效液相指紋圖譜和質(zhì)譜為技術(shù)快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的エ藝，屬于生物活性肽的制備純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于抗生素濫用導(dǎo)致的殘留嚴(yán)重，自然界中微生物的抗藥性不斷增強(qiáng)。在人和動(dòng)物身上已發(fā)現(xiàn)了能抵抗現(xiàn)有抗生素(青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、甲氧芐氨嘧啶.磺胺甲基異噫唑、四環(huán)素類、氟奎諾酮、氯霉素、萬古霉素)的耐藥菌株。近二十年來，耐藥菌株的感染也逐年呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的健康。常規(guī)抗生素的抗性增加問題已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問題。因此，尋求廣譜、高效的新一代抗菌藥物已成為世界性的迫切需要。抗菌肽發(fā)現(xiàn)于二十世紀(jì)八十年代，和已有的常規(guī)抗生素作用于特異靶蛋白不同的是，抗菌肽以入侵微生物的細(xì)胞膜為靶目標(biāo)，引起細(xì)胞膜的裂解從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性。因而，抗菌肽有望成為替代抗生素的新一代抗菌藥物。但是，目前在抗菌肽的生產(chǎn)方面存在以下問題天然抗菌肽資源有限，且直接提取エ藝復(fù)雜，成本昂貴；化學(xué)合成法成本太高，產(chǎn)業(yè)化困難，同時(shí)難以保證合成肽類的生物活性；基因工程方法雖然使獲得大量、廉價(jià)抗菌肽成為可能，但在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)其獲得的抗菌肽抗菌、抗病毒能力弱，導(dǎo)致受體細(xì)胞“自殺”而難以用常用的細(xì)菌、病毒作表達(dá)體系且基因表達(dá)產(chǎn)量不高。 因此，如何提高抗菌肽的生產(chǎn)效率，降低成本，是應(yīng)用抗菌肽首要解決的問題。細(xì)胞膜色譜法(Cell Membrane Chromatography, CMC)是研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技木，將高效液相色譜、細(xì)胞生物學(xué)與受體藥理學(xué)相結(jié)合，利用藥物與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將藥物體內(nèi)的作用過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)模擬。由于抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜間存在著特異性的親和力，將細(xì)胞膜色譜法運(yùn)用在抗菌肽的制備純化領(lǐng)域，為抗菌肽的分離純化尋找提供ー種目的性強(qiáng)、高效、簡便、快捷的方法是可行的。但是，目前在國內(nèi)外運(yùn)用細(xì)胞膜色譜法分離純化抗菌肽未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本專利利用細(xì)胞膜親和色譜技術(shù)原理，建立大腸桿菌細(xì)胞膜固定相色譜萃取模型，同吋，結(jié)合高效液相指紋圖譜和質(zhì)譜技術(shù)快速篩選蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種以細(xì)胞膜親和色譜結(jié)合高效液相指紋圖譜和質(zhì)譜為技術(shù)快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的エ藝，包括如下步驟(1)將在固體培養(yǎng)基中活化好的大腸桿菌接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心取得菌體，清洗菌體7-10次以去除殘留的培養(yǎng)基。(2)將步驟(1)中得到的菌體，在-30°C冰箱中凍存4-幾，取出置于37°C水浴鍋中融解，反復(fù)凍融5-9次，低速離心取得菌體。(3)將步驟(2)中得到的菌體，用400-800W的超聲波功率進(jìn)行細(xì)胞裂解處理，超聲波每次輻射4-lOs，間隔4-lOs，總時(shí)間40-60min，低速離心取得沉淀，此沉淀為大腸桿菌細(xì)胞膜。(4)將步驟(3)中得到的細(xì)胞膜，放在離心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅膠，在4-10°C下反應(yīng)結(jié)合20-90min后，采用3_5 μ m的微孔濾膜反復(fù)過濾5_10次，去除液體，取得固體，此固體為細(xì)胞膜親和固定相。(5)以麻瘋樹仔粕蛋白為例，利用多種蛋白酶(堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶等)進(jìn)行酶解，控制料液比1 8 1 15混合，在50 60°C下調(diào)節(jié)pH2. 0 9. 0，水解得到的不同水解度(7% -15% )的水解物后，調(diào)回PH到6. 8-7. 6，90 100°C水浴滅酶lOmin，然后對得到的不同水解度的水解物(等溶度l-10mg/ml)進(jìn)行抗菌測試，取的抗菌能力測試最好的組分并在-20°C下保存。(6)將步驟(5)得到的樣品和步驟(3)得到的親和固定相，置于置于l_15ml容量的離心管中，置于l_15ml的離心管中，在10-37°C下孵育萃取20-120min，離心取的上清液。 沉淀用緩沖液清洗5-10次，合井清洗液和上清液，并命名為流出液。(7)將步驟(5)得到的樣品和步驟(6)得到的流出液，利用高效液相-質(zhì)譜技木， 檢測其指紋圖譜，分析差異峰，純化制備差異峰并進(jìn)行抗菌能力測試，同時(shí)，找出差異峰的肽系列，制備得到的差異峰為蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明可以以廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品和食品エ業(yè)下腳料為原料，采用蛋白酶水解，大量制備出抗菌肽組分，變廢為寶，減少環(huán)境污染，降低生產(chǎn)成本，具有很好的發(fā)展前景；2、傳統(tǒng)抗菌肽的純化方法中，通常涉及到超濾、陰陽離子交換、大孔樹脂吸附、脫鹽、凝膠層析和RP-HPLC等5-7歩，而本發(fā)明的分離純化主要分為兩個(gè)步驟親和萃?。?RP-HPLC/MS/MS分離鑒定，所得樣品均達(dá)到色譜純，該分離方法的建立為準(zhǔn)確尋找和快速純化抗菌肽這類含量較少的生物活性物質(zhì)，提供一種簡單、方便和快捷的途徑。


附圖1為快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的流程圖。 附圖2為掃描電鏡圖。A 活化硅膠；B 細(xì)胞膜親和固定相
附圖3為高效液相指紋圖譜。A 陰性對照；B :Fhl3-l ；C :Fhl3
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。實(shí)施例1親和細(xì)胞膜固定相的制備將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌培養(yǎng)物500ml，在4000r/min離心15min，取得菌體，菌體用25ml的Tris-EDTA緩沖液(pH7. 4)清洗10次，以除去培養(yǎng)基殘留物。將清洗干凈的菌體，用Tris-EDTA緩沖液復(fù)溶，并在-30°C冰箱中凍存4h，取出置于37°C水浴鍋中融解，反復(fù)凍融5次后，3000r/min離心15min。將凍融后的菌體，在600W的超聲波功率進(jìn)行細(xì)胞裂解處理，超聲波每次輻射4s，間隔如，總時(shí)間60min，低速離心取得沉淀，此沉淀為大腸桿菌細(xì)胞膜。將得到的細(xì)胞膜復(fù)溶制備的懸液IOml，放在離心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅膠0. 5g(3-7 μ m)，在4°C下振蕩反應(yīng)結(jié)合Ih后，再在超聲功率為90W下超聲15min之后，采用3μπι的微孔濾膜過濾，去除液體，取得固體，此固體為細(xì)胞膜親和固定相(如說明書附圖中的圖2Β)。
實(shí)施例2蛋白抗菌水解物的制備以麻瘋樹仔粕蛋白為例，取蛋白樣品10g，純度為92.沈％，加入IOOmL的去離子水，用不同的水解蛋白酶就行水解，蛋白酶的水解最優(yōu)條件如表1所示。蛋白溶液被不同的蛋白酶水解成不同的水解度(7^,9^,11^,13^,15% and 17% )后，將混濁液在45°C下調(diào)節(jié)PH到7. 5，并100°C水浴滅酶lOmin，然后4000r/min離心15min，取得上清液，凍干，復(fù)溶成lmg/ml樣品液，并分別做抗菌能力測試，找出抗菌能力最強(qiáng)的組分，并進(jìn)行冷到干燥。 將此樣品命名為冊13.表1蛋白酶的最優(yōu)作用條件
權(quán)利要求
1.ー種快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的方法，包括如下步驟(1)親和細(xì)胞膜固定相的制備(2)蛋白抗菌水解物的制備(3)親和萃取聯(lián)用高效液相及質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確快速發(fā)現(xiàn)及鑒定抗菌肽
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和細(xì)胞膜固定相的制備，其特征在于(1)將在固體培養(yǎng)基中活化好的大腸桿菌接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心取得菌體，清洗菌體7-10次以去除殘留的培養(yǎng)基。(2)將步驟(1)中得到的菌體，在-30°C左右的冰箱中凍存4-幾，取出置于10-37°C水浴鍋中融解，反復(fù)凍融5-9次，低速離心取得菌體。(3)將步驟O)中得到的菌體，用400-800W的超聲波功率進(jìn)行細(xì)胞裂解處理，超聲波每次輻射4-lOs，間隔4-lOs，總時(shí)間40-60min，低速離心取得沉淀，此沉淀為大腸桿菌細(xì)胞膜。(4)將步驟(3)中得到的細(xì)胞膜，放在離心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅膠， 在4-10°C下反應(yīng)結(jié)合20-90min后，采用3_5 μ m的微孔濾膜反復(fù)過濾5_10次，去除液體，取得固體，此固體為細(xì)胞膜親和固定相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白抗菌水解物的制備，其特征在于(1)以麻瘋樹仔粕蛋白為例，利用多種蛋白酶進(jìn)行酶解，控制料液比1 8 1 15混合，在50 60°C下調(diào)節(jié)pH2. 0 9. 0，水解得到的不同水解度(7% -15% )的水解物后，調(diào)回pH到6. 8-7. 6，90 100°C水浴滅酶lOmin，然后對得到的不同水解度的水解物(等溶度 l-10mg/ml)進(jìn)行抗菌測試，取的抗菌能力測試最好的組分并在_20°C下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和萃取聯(lián)用高效液相及質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確快速發(fā)現(xiàn)及鑒定抗菌肽，其特征在干(1)將權(quán)利要求2中得到的細(xì)胞膜親和固定相和權(quán)利要求3中得到的最好的抗菌水解物組分，置于l_15ml的離心管中，在10-37°C下孵育萃取20-120min，離心取的上清液。沉淀用緩沖液清洗5-10次，合井清洗液和上清液，并命名為流出液。(2)將權(quán)利要求3中得到的最好的抗菌水解物組分和步驟⑴得到的流出液，利用高效液相-質(zhì)譜技木，檢測其指紋圖譜，分析差異峰，純化制備差異峰并進(jìn)行抗菌能力測試，同時(shí)，找出差異峰的肽系列，制備得到的差異峰為蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽。
全文摘要
一種快速準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備蛋白質(zhì)水解物源抗菌肽的方法，屬于生物活性肽的制備純化領(lǐng)域。本發(fā)明以麻瘋樹仔粕蛋白為例，經(jīng)多種蛋白酶水解，制備出含抗菌肽的組分，再利用細(xì)胞膜親和色譜結(jié)合高效液相指紋圖譜和質(zhì)譜為技術(shù)快速發(fā)現(xiàn)、鑒定及制備純化抗菌肽。本發(fā)明的分離純化分為兩個(gè)步驟(親和萃取和RP-HPLC/MS/MS分離鑒定)，大大縮短了傳統(tǒng)抗菌肽的純化步驟(通常涉及到超濾、陰陽離子交換、大孔樹脂吸附、脫鹽、凝膠層析和RP-HPLC等5-7步)，并且所得樣品均達(dá)到色譜純?？梢?，本發(fā)明的方法的建立為大量制備、準(zhǔn)確尋找和快速純化抗菌肽這類含量較少的生物活性物質(zhì)，提供一種操作簡單、方便和快捷的途徑。
文檔編號G01N27/62GK102533912SQ20111040686
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者張暉, 王立, 肖建輝, 郭曉娜, 錢海峰, 齊希光 申請人:江南大學(xué)