專利名稱：一種檢測多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體、食品(農(nóng)副產(chǎn)品)和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。農(nóng)藥通過直接或間接途徑(大氣、水、土壤)對食品造成污染。人類處于食物鏈的最頂端，所受農(nóng)藥殘留生物富集的危害也最嚴(yán)重。現(xiàn)今農(nóng)藥殘留已成為中國膳食中的主要食品安全性問題。嚴(yán)重污染食品的農(nóng)藥主要是有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類的殺蟲劑、殺菌劑和除草劑。世界上農(nóng)藥常用品種約500 種，我國的農(nóng)藥品種只有200多種。有機(jī)磷農(nóng)藥已有70多年的歷史，并仍被廣泛使用。常用的有機(jī)磷農(nóng)藥有樂果、氧化樂果、甲胺磷、甲基對硫磷、對硫磷等。根據(jù)美國《食品質(zhì)量保護(hù)法》的規(guī)定，有機(jī)磷農(nóng)藥被美國環(huán)保局列為最先接受再登記和殘留限量再評價的一類農(nóng)藥。批準(zhǔn)登記的有40種，久效磷、速滅磷等有機(jī)磷農(nóng)藥已被嚴(yán)格禁止施用。由于有機(jī)磷農(nóng)藥對于防治農(nóng)業(yè)病蟲草害具有經(jīng)濟(jì)、高效、方便等特點(diǎn)，使其在農(nóng)藥中占有重要地位，并且在今后相當(dāng)長一段時間內(nèi)仍被廣泛使用。但有機(jī)磷農(nóng)藥的高殘留性， 已經(jīng)引起社會的高度重視，也制定了較為嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。1998年，我國上海市就已全面停止供應(yīng)和使用甲胺磷農(nóng)藥。據(jù)統(tǒng)計，1999 2001年，對廣西7個主要城市的蔬菜市場的 21個蔬菜品種進(jìn)行分析，有近50%的樣品有機(jī)磷檢測呈陽性反應(yīng)?？梢姡袡C(jī)磷農(nóng)藥仍被廣泛的使用，但是它與人們的身體健康有密切關(guān)系，需要引起高度的重視。殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥對人體內(nèi)的膽堿酯酶有抑制作用，能阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，造成組織中乙酰膽堿的積聚，其結(jié)果引起膽堿能受體活性紊亂，并使有膽堿能受體的器官功能發(fā)生障礙，主要出現(xiàn)兩類癥狀。凡由臟器平滑肌、腺體、汗腺等興奮而引起的癥狀，與毒覃中毒所引起的癥狀相似，則稱為毒覃樣癥狀；凡由交感神經(jīng)節(jié)和橫紋肌活動異常所引起的癥狀，與煙堿中毒所引起的癥狀相似，故稱煙堿樣癥狀。有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的途徑可通過皮膚進(jìn)入人體；在噴灑過程中產(chǎn)生的氣霧可由呼吸道吸入；誤服者可由消化道吸收。其潛伏期也因中毒途徑不同而有所差異，經(jīng)口服者約5 20分鐘早期出現(xiàn)惡心、嘔吐，以后進(jìn)入昏迷狀態(tài)；經(jīng)呼吸道者，潛伏期約30分鐘，吸入后產(chǎn)生呼吸道刺激癥狀，呼吸困難，視力模糊，而后出現(xiàn)全身癥狀；經(jīng)皮膚吸收者潛伏期最長約 2 6小時，吸收后有頭暈、煩躁、出汗、肌張力減低及共濟(jì)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡。20世紀(jì)80年代以來，我國蔬菜和水果農(nóng)藥殘留引起人畜中毒死亡事件頻繁發(fā)生。 據(jù)統(tǒng)計，1981年全國農(nóng)藥中毒人數(shù)28. 9萬，死亡1. 87萬，1985年全國農(nóng)藥中毒人數(shù)10. 7 萬，死亡1. 25萬；近10年來，我國平均每年中毒人數(shù)約10萬，死亡1萬多人。其中1992年至19%年全國沈個省市發(fā)生農(nóng)藥中毒事件M7349例，死亡24612人，我國每年因農(nóng)藥中毒的人數(shù)占世界同類事故中毒人數(shù)的50%。據(jù)農(nóng)業(yè)部2000年底對我國14個省會城市2110 個樣品的檢測結(jié)果，蔬菜中農(nóng)藥超標(biāo)高達(dá)31. 1%，其中北京、天津、上海、廣州、南寧、昆明等大城市蔬菜農(nóng)藥殘留超標(biāo)率超過50%。由此可見，農(nóng)藥殘留對人體健康危害極大，故研究農(nóng)藥殘留快速、高效的檢測方法，對保證食品安全和加強(qiáng)食品中農(nóng)藥殘留量的檢測和監(jiān)督管理具有重要意義。農(nóng)藥殘留分析技術(shù)始于20世紀(jì)，最初的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)僅限于化學(xué)法、比色法和生物測定法，檢測方法缺乏專一性，靈敏度也不高。20世紀(jì)60年代氣相色譜法(GC)應(yīng)用于農(nóng)藥和藥物殘留分析，大大提高了農(nóng)藥和藥物殘留量的檢測水平。20世紀(jì)80年代以來， 高效液相色譜法(HPLC)開始廣泛應(yīng)用于對熱不穩(wěn)定和離子型農(nóng)藥及其代謝物的分析。色譜法雖然定量準(zhǔn)確、靈敏度高，但所需設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作，且分析時間長不利于現(xiàn)場監(jiān)測。近10年來，國外蔬、果、茶等農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)田環(huán)境農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，主要體現(xiàn)在三個方面①檢測能力不斷提高，由于高新技術(shù)的應(yīng)用，檢測靈敏度越來越高，殘留物的超痕量分析水平已達(dá)到IO-Ilg ；②檢測速度不斷加快，智能化計算機(jī)和高性能電子器件與檢測器的使用，使檢測周期大大縮短；③選擇性不斷提高，高效分離手段、各種化學(xué)和生物選擇性傳感器的使用，使在復(fù)雜混合體中直接進(jìn)行污染物選擇性測定成為可能。農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)的發(fā)展正趨向于高技術(shù)化、智能化、速測化、動態(tài)化、便攜化。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質(zhì)譜(MQ等多種理化分析手段，存在樣品前處理復(fù)雜，儀器設(shè)備昂貴，且要求熟練的技術(shù)人員，完成一次分析費(fèi)時長等問題。特別是這些方法不能滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求，這些都迫使人們運(yùn)用新的原理和方法去開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、安全廉價的分析新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對現(xiàn)有技術(shù)中檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留產(chǎn)品靈敏度低的問題，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷的檢測多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法，包括以下步驟步驟1)將生物分子與抗有機(jī)磷特異性抗體連接，得到生物分子標(biāo)記的抗體；步驟2、以樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和背襯墊構(gòu)建酶聯(lián)免疫層析試紙條；步驟幻將步驟1)得到的生物分子標(biāo)記的抗體固定在試紙條的結(jié)合墊上，在層析膜上分別設(shè)有檢測帶和質(zhì)控帶，其中檢測帶上固定有與樣品中的有機(jī)磷競爭性結(jié)合特異性抗體的有機(jī)磷包被原，質(zhì)控帶上固定有質(zhì)控分子，然后進(jìn)行免疫層析，并進(jìn)行定性定量檢測。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫層析方法是將酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)與免疫層析方法相結(jié)合，利用競爭法原理結(jié)合酶催化底物顯色性質(zhì)，對樣品中的待測物進(jìn)行定性及定量檢測。本發(fā)明首先將生物分子連接到抗有機(jī)磷的特異性抗體表面，得到生物分子標(biāo)記的抗體。作為優(yōu)選，本發(fā)明中的生物分子為酶或生物素。其中所述酶優(yōu)選為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，發(fā)明人采用改良的過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的抗體。該方法的原理為HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成khiff堿，從而將HRP分子與抗體蛋白分子連接。在實(shí)驗(yàn)過程中為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2，4_ 二硝基氟苯(DNFB) 封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，發(fā)明人將生物素連接到抗體表面，進(jìn)而再與鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶反應(yīng)，從而提高了檢測的靈敏度和分辨率。生物素標(biāo)記反應(yīng)簡單、溫和且很少抑制抗體活性，將生物素與抗體共價結(jié)合是一種非常簡便、直接的標(biāo)記方法。本發(fā)明檢測方法適用于各種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。作為優(yōu)選，本發(fā)明中有機(jī)磷為選自甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、皮蠅磷或氯硫磷中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明中檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫層析試紙條由PVC背襯底墊粘附的上樣墊、 結(jié)合墊，中間粘附的層析膜，頂端粘附的吸水墊組成。其中結(jié)合墊上包被有抗有機(jī)磷抗體-生物分子標(biāo)記物，層析膜的檢測帶和質(zhì)控帶上分別包被有有機(jī)磷-BSA偶聯(lián)物和質(zhì)控分子。檢測帶和質(zhì)控帶的包被方法具體為稀釋有機(jī)磷-BSA偶聯(lián)物和質(zhì)控分子到設(shè)定的濃度，噴涂或涂覆在膜上，適宜溫度干燥后，再將膜放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉，干燥后封袋，放置低溫保存?zhèn)溆?。作為?yōu)選，本發(fā)明中免疫層析試紙條的層析膜為硝酸纖維素膜或硝酸纖維素膜與醋酸纖維素膜組成的混合膜。作為優(yōu)選，質(zhì)控帶上包被的質(zhì)控分子為與生物分子標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合的二抗。在本發(fā)明的實(shí)施例中，發(fā)明人將酶標(biāo)抗體固定在結(jié)合墊上，其定性檢測原理為檢測帶包被了有機(jī)磷-BSA偶聯(lián)物，質(zhì)控帶包被了抗酶標(biāo)抗體的二抗。結(jié)合墊上結(jié)合酶標(biāo)單抗。檢測過程中，取一定量樣品溶液加入樣品墊，樣本和被溶解的酶標(biāo)抗體一起在過濾片上移動。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留，藥物將和抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)擴(kuò)散至檢測帶時，抗體的活性位點(diǎn)將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測帶上藥物抗原結(jié)合；之后加入底物顯色液。當(dāng)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測帶將較質(zhì)控帶顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測帶顯色與質(zhì)控帶相近或偏深，判定為陰性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，發(fā)明人將生物素標(biāo)記的抗體固定在結(jié)合墊上，其定性檢測原理為檢測帶包含了有機(jī)磷-BSA偶聯(lián)物，質(zhì)控帶包含了抗生物素標(biāo)記的抗體的二抗。結(jié)合墊上結(jié)合生物素標(biāo)記的單抗。檢測過程中，取一定量樣品溶液加入樣品墊，樣本和被溶解的酶標(biāo)抗體一起在過濾片上移動。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留，藥物將和抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)擴(kuò)散至檢測帶時，抗體的活性位點(diǎn)將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測帶上藥物抗原結(jié)合；之后加入HRP標(biāo)記的親和素，與通過單抗而固定在膜上的生物素結(jié)合；加入洗滌液，洗掉沒有結(jié)合的過氧化物酶，最后加入底物顯色液，當(dāng)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測帶將較質(zhì)控帶顯色淡或甚至無顯色， 判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測帶顯色與質(zhì)控帶相近或偏深，判定為陰性。本發(fā)明還提供了一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析試劑盒。該試劑盒包括酶聯(lián)免疫層析試紙條，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。該試紙條包括樣品墊(1)、結(jié)合墊O)、層析膜 (3)、吸水墊(4)和背襯墊(7)，其中樣品墊(1)、結(jié)合墊O)、層析膜(3)和吸水墊(4)搭載于背襯墊(7)之上，樣品墊(1)連接于結(jié)合墊0)，結(jié)合墊(2)連接于層析膜(3)，層析膜 (3)上固定有質(zhì)控帶(5)和檢測帶(6)，層析膜(3)連接于吸水墊0)。作為優(yōu)選，本發(fā)明中酶聯(lián)免疫層析試劑盒還包括樣品稀釋液、底物顯色液、洗滌液或有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品中的一種或兩種以上。其中樣品稀釋液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液。底物顯色液優(yōu)選為由過氧化物和供氫體組成，其中過氧化物為H2O2，供氫體為沉淀型的OPD、TMB、DAB、 聯(lián)苯胺、5-氨基水楊酸或4-氯-1-萘酚。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下1)本發(fā)明檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法與現(xiàn)有方法相比檢測靈敏度高、分辨率好、特異性強(qiáng)；2)本發(fā)明提供的方法操作簡便，無需專用儀器設(shè)備，結(jié)果直觀，安全廉價，適合現(xiàn)場快速檢測。


圖1為酶聯(lián)免疫層析試紙條組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為層析膜，4為吸水墊，5為質(zhì)控帶，6為檢測帶，7為背襯墊。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種檢測多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法，包括以下步驟步驟1)將生物分子與抗有機(jī)磷特異性抗體連接，得到生物分子標(biāo)記的抗體；步驟2)以樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和背襯墊構(gòu)建酶聯(lián)免疫層析試紙條；步驟幻將步驟1)得到的生物分子標(biāo)記的抗體固定在試紙條的結(jié)合墊上，在層析膜上分別設(shè)有檢測帶和質(zhì)控帶，其中檢測帶上固定有與樣品中的有機(jī)磷競爭性結(jié)合特異性抗體的有機(jī)磷包被原，質(zhì)控帶上固定有質(zhì)控分子，然后進(jìn)行免疫層析，并進(jìn)行定性定量檢測。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1 改良過碘酸鈉法制備酶標(biāo)抗體后定量有機(jī)磷農(nóng)藥(1)改良過碘酸鈉法制備酶標(biāo)抗體取HRP 5mg溶于0. 2mol/L, pH5. 6醋酸鹽緩沖液Iml中，加入1 % DNFB無水乙醇溶液0. 1ml，室溫下輕微攪拌Ih ；加入新鮮配置的0. lmol/L NaIO4 0. 5ml，置4°C放置30min, 加入2. 5%乙二醇1ml，室溫下輕微攪拌lh，終止反應(yīng)；加入待標(biāo)記的抗體5 10mg，用 1. 0mol/L,pH9. 5 CBS，調(diào)節(jié)pH值至9. 0 ；混勻，置4°C過夜；加入硼氫化鈉溶液0. 1ml，混勻， 4°C放置 3h ；對 0. 01mol/L，ρΗ7· 4 PBS，4°C透析過夜，換液 3 次；3000r/min 離心 30min，去除沉淀物；收集上清液即為酶標(biāo)記抗體。(2)試紙條組裝酶標(biāo)記抗體用稀釋液進(jìn)行稀釋，其中稀釋液含10% 20%蔗糖、 5%海藻糖、0.5% 牛血清白蛋白(BSA)、0. 5% 吐溫-20，然后用BIO-DOT噴金劃線儀將酶標(biāo)記抗體噴涂在玻璃纖維膜上，得到結(jié)合墊，37°C干燥4h后密封，4°C下保存。用BIO-DOT噴金劃線儀在硝酸纖維素膜上劃兩條條平行帶，條帶間隔5mm，條帶寬都約為1mm。其中第一條為質(zhì)控帶，第二條為定量帶。質(zhì)控帶上噴涂羊抗鼠免疫球蛋白 (IgG)，濃度為0. 5 lmg/ml ；第二條帶噴涂有機(jī)磷包被原，濃度為0. 2 lmg/ml。得層析膜，37 °C干燥4h后密封，4 °C下保存。在PVC板上，依次粘貼上層析膜(長30cm,寬2. 5cm)、結(jié)合墊(長30cm,寬8mm)、 樣品墊(長30cm，寬17mm)和吸水墊(長30cm，寬17mm)。用切條機(jī)將粘貼好的塑料板縱向切成3. 8mm寬的試紙條，放入扣卡中組裝成免疫層析試劑盒，干燥后密封，4°C避光保存。(3)檢測過程原理檢測過程中，取一定量樣品溶液加入樣品墊，樣本和被溶解的酶標(biāo)抗體一起在過濾片上移動。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留，藥物將和抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)擴(kuò)散至檢測帶時，抗體的活性位點(diǎn)將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測帶上藥物抗原結(jié)合; 之后加入底物使用液。當(dāng)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測帶將較質(zhì)控帶顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測帶顯色與質(zhì)控帶相近或偏深，判定為陰性。(4)樣本檢測用樣本稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，其中樣本稀釋液為0. 1 0. 2M的硼酸鹽緩沖液，并且含 3%的丙酮，0.5% 甲醇，配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品如下JOyg/mLUyg/mL、 0. 1 μ g/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、lng/mL、0ng/mLo檢測時將陰性樣本稀釋液或標(biāo)準(zhǔn)品70 μ L垂直滴到樣品墊上，層析，1分鐘后，將 2 5 μ L底物顯色液滴到層析膜上，2min后待定量帶和質(zhì)控帶均已明顯顯示，將5 10 μ L 洗滌液滴到層析膜上，Imin后觀察背景區(qū)、質(zhì)控帶和定量帶信號強(qiáng)度(每個樣本分別用3個試紙條測定3次，取平均值)，定量帶扣除背景區(qū)信號后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中質(zhì)控帶用于對定量帶信號受環(huán)境影響，而作相應(yīng)的校正。(5)定性結(jié)果的判讀具體為如果檢測帶與質(zhì)控帶處都有條帶，說明待測樣品中不含有目標(biāo)物；如果只有質(zhì)控帶顯色，說明待測樣品中含有目標(biāo)物，檢測帶顏色越淺目標(biāo)物含量越高；如果檢測帶與質(zhì)控帶處不顯色，說明檢測無效。
實(shí)施例2 以生物素-親和素結(jié)合酶聯(lián)免疫法標(biāo)記抗體后定量檢測有機(jī)磷農(nóng)藥(1)制備生物素標(biāo)記的抗體。用50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6) 4°C透析抗體，出去疊氮化鈉(NaN3)，并將待生物素化的抗有機(jī)磷單抗用該碳酸鹽緩沖液稀釋到lmg/ml。將生物素酯(BNHS)溶于二甲基甲酰胺(DMF)，濃度為20mg/mL。按100 μ g BNHS每Img抗體的比例加入BNHS，混勻，室溫下反應(yīng)4小時。4°C下用磷酸鹽緩沖液透析三天除去游離物，得到生物素化的單抗，4°C下保存?zhèn)溆?，長期保存需在-20°C保存。(2)試紙條的組裝根據(jù)實(shí)施例1的方法組裝試紙條。(3)檢測過程原理檢測過程中，取一定量樣品溶液加入樣品墊，樣本和被溶解的酶標(biāo)抗體一起在過濾片上移動。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物的殘留，藥物將和抗體先行反應(yīng)，因此當(dāng)擴(kuò)散至檢測帶時，抗體的活性位點(diǎn)將因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測帶上藥物抗原結(jié)合； 之后加入HRP標(biāo)記的親和素，與通過單抗而固定在膜上的生物素結(jié)合；加入洗滌液，洗掉沒有結(jié)合的過氧化物酶，最后加入底物使用液，當(dāng)樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測帶將較質(zhì)控帶顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測帶顯色與質(zhì)控帶相近或偏深，判定為陰性。(4)定量及定性檢測根據(jù)實(shí)施例1所述方法進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
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權(quán)利要求
1.一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1)將生物分子與抗有機(jī)磷特異性抗體連接，得到生物分子標(biāo)記的抗體；步驟2)以樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和背襯墊構(gòu)建酶聯(lián)免疫層析試紙條；步驟幻將步驟1)得到的生物分子標(biāo)記的抗體固定在試紙條的結(jié)合墊上，在層析膜上分別設(shè)有檢測帶和質(zhì)控帶，其中檢測帶上固定有與樣品中的有機(jī)磷競爭性結(jié)合特異性抗體的有機(jī)磷包被原，質(zhì)控帶上固定有質(zhì)控分子，然后進(jìn)行免疫層析，并進(jìn)行定性定量檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述生物分子為酶或生物素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶、 堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β-半乳糖苷酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述有機(jī)磷為選自甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、皮蠅磷或氯硫磷中的一種或兩種以上的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述層析膜為硝酸纖維素膜或硝酸纖維素膜與醋酸纖維素膜組成的混合膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述質(zhì)控分子為與步驟1)得到的生物分子標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合的二抗。
7.—種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析試劑盒，包括酶聯(lián)免疫層析試紙條，其特征在于，所述酶聯(lián)免疫層析試紙條包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、層析膜(3)、吸水墊(4)和背襯墊(7)，其中樣品墊(1)、結(jié)合墊O)、層析膜(3)和吸水墊(4)搭載于背襯墊(7)之上， 樣品墊(1)連接于結(jié)合墊0)，結(jié)合墊(2)連接于層析膜(3)，層析膜(3)上固定有質(zhì)控帶 (5)和檢測帶(6)，層析膜(3)連接于吸水墊(4)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶聯(lián)免疫層析試劑盒，其特征在于，還包括樣品稀釋液、底物顯色液、洗滌液或有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品中的一種或兩種以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫層析試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為磷酸鹽緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫層析試劑盒，其特征在于，所述底物顯色液由過氧化物和供氫體組成，其中過氧化物為H2O2，供氫體為沉淀型的0PD、TMB、DAB、聯(lián)苯胺、5-氨基水楊酸或4-氯-1-萘酚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測植物性農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中藥物殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒，特別涉及檢測植物性農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法及試劑盒。本發(fā)明檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫層析方法是利用酶的高敏感特性，采用免疫層析進(jìn)行檢測；與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測有機(jī)磷農(nóng)藥相比，具有操作簡便，無需專用儀器設(shè)備，結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)；而與膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)合讀數(shù)儀可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/558GK102539753SQ20111045380
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王金愛 申請人:深圳康美生物科技股份有限公司