專利名稱：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23的測(cè)定方法及測(cè)定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試樣中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23 (以下記為FGF-23)的測(cè)定方法及FGF-23的測(cè)定試劑。
背景技術(shù)：
FGF-23是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的一員，主要是由在骨組織中產(chǎn)生的251個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，其作用于腎臟，阻礙腎小管處的磷的再吸收。近年來(lái)指出，在低磷血癥性佝僂病、腫瘤性骨軟化病癥、腎功能衰竭等疾病中的FGF-23的相關(guān)性(參照非專利文獻(xiàn)I)。
FGF-23形成為N末端的24個(gè)氨基酸脫離后的227個(gè)氨基酸所構(gòu)成的多肽受到修飾并添加有糖鏈的結(jié)構(gòu)，以約32.5kDa的成熟的蛋白釋放到細(xì)胞外。另外，F(xiàn)GF-23在凝血酶的作用下距離N末端的第197位和第198位之間的鍵被剪切，第198-251位的片段作為C末端片段存在于血中。
在此之前已經(jīng)報(bào)道了獲得了針對(duì)FGF-23的抗體(參照專利文獻(xiàn)I及2、非專利文獻(xiàn)2)、和使用了該抗體的血清或血漿中的FGF-23的免疫測(cè)定方法(參照專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)，基于該測(cè)定方法的測(cè)定試劑盒也在市場(chǎng)上有售[Human Intact FGF-23ELISA Kit(Immutopics 公司)、Human FGF-23 (C-Term) ELISA Kit (Immutopics 公司)、FGF-23 測(cè)定試劑(Kainos公司)]。
但是，之前的免疫測(cè)定方法是利用平板法的測(cè)定方法，該方法存在測(cè)定靈敏度低、測(cè)定范圍窄等問(wèn)題。特別是在慢性腎臟病(CKD)患者及透析患者中存在數(shù)pg/mL 數(shù)萬(wàn)pg/mL濃度范圍的檢體,存在著在低濃度檢體中由于精度不良而無(wú)法獲得準(zhǔn)確的測(cè)定值、在高濃度檢體中超過(guò)測(cè)定范圍等課題。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:W02003/057733小冊(cè)子
專利文獻(xiàn)2:日本特表2004-504063號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1:腎i骨代謝(腎和骨代謝)，vol.15，N0.4，ρ.351 356 (2002)。
非專利文獻(xiàn)2:N ENGL J MED, vol.348，N0.17，p.1656 1663 (2003)。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于提供高靈敏度、測(cè)定范圍廣的試樣中的FGF-23的測(cè)定方法及測(cè)定試劑。
用于解決技術(shù)問(wèn)題的手段
本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過(guò)使用磁性粒子作為載體的免疫測(cè)定方法，能夠以高靈敏度進(jìn)行測(cè)定范圍廣的FGF-23的測(cè)定，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的[I] [10]。
[I] 一種試樣中的FGF-23的測(cè)定方法，其特征在于，包含以下工序:
(I)使試樣中的FGF-23在水性介質(zhì)中和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)，從而在磁性粒子上生成由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的工序；
(2)利用磁力聚集工序(I)后的反應(yīng)混合物中的磁性粒子,從而將通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其以外的成分分離的工序；以及
(3)對(duì)工序(2)中分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體進(jìn)行測(cè)定的工序。
[2]上述[I]所述的測(cè)定方法，其中，第2抗體為經(jīng)標(biāo)記化的抗體。
[3]上述[2]所述的測(cè)定方法，其中，經(jīng)標(biāo)記化的抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。
[4]上述[I] [3]中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，工序(3)的磁性粒子上的免疫復(fù)合體的測(cè)定通過(guò)化學(xué)發(fā)光的測(cè)定來(lái)進(jìn)行。
[5]上述[I] [4]中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，試樣為血清或血漿。
[6] 一種試樣中的FGF-23測(cè)定試劑，其特征在于，含有磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段。
[7]上述[6]所述的測(cè)定試劑，其中，第2抗體為經(jīng)標(biāo)記化的抗體。
[8]上述[7]所述的測(cè)定試劑,其中，經(jīng)標(biāo)記化的抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。
[9]上述[6] [8]中任一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑，其中，進(jìn)一步含有化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑。
[10]上述[6] [9]中任一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑，其中，試樣為血清或血漿。
發(fā)明效果
通過(guò)本發(fā)明，可以提供高靈敏度、測(cè)定范圍廣的試樣中的FGF-23的測(cè)定方法及測(cè)定試劑。


圖1為表示實(shí)施例1的FGF-23測(cè)定方法的最小測(cè)定濃度的曲線圖，是表示試樣中的FGF-23濃度與發(fā)光量之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示FGF-23濃度(pg/mL)，縱軸表示發(fā)光量(RLU)。I表示平均值±2SD的范圍。另外，虛線表示空白+2SD的發(fā)光量。
圖2為表示實(shí)施例2的FGF-23測(cè)定方法的測(cè)定范圍的曲線圖，是表示試樣中的FGF-23濃度與發(fā)光量之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示FGF-23濃度(pg/mL)，縱軸表示發(fā)光量(RLU)。
圖3為表示使用了透析患者來(lái)源的血清(患者血清D)的實(shí)施例3的測(cè)定方法的稀釋線性的曲線圖，是表示稀釋率與FGF-23濃度之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示該血清的稀釋率，縱軸表示所確定的FGF-23濃度(pg/mL)。
圖4為表示使用了透析患者來(lái)源的血清(患者血清E)的實(shí)施例3的測(cè)定方法的稀釋線性的曲線圖，是表示稀釋率與FGF-23濃度之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示該血清的稀釋率，縱軸表示所確定的FGF-23濃度(pg/mL)。
圖5為表示使用平板的比較例I的FGF-23測(cè)定方法的最小測(cè)定濃度的曲線圖，是表示試樣中的FGF-23濃度與吸光度之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示FGF-23濃度(pg/mL)，縱軸表示吸光度(Abs)。I表示平均值±2SD的范圍。另外，虛線表示空白+2SD的發(fā)光量。
圖6為表示使用平板的比較例2的FGF-23測(cè)定方法的測(cè)定范圍的曲線圖，是表示試樣中的FGF-23濃度與吸光度之間的關(guān)系的曲線圖。橫軸表示FGF-23濃度(pg/mL)，縱軸表不吸光度(Abs)。
具體實(shí)施方式
(測(cè)定方法)
本發(fā)明的試樣中的FGF-23的測(cè)定方法是使用磁性粒子作為載體的利用夾心法的試樣中的FGF-23的免疫測(cè)定方法，該測(cè)定方法包含以下工序。
(I)使試樣中的FGF-23在水性介質(zhì)中和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)，從而在磁性粒子上生成由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的工序；
(2)利用磁力聚集工序(I)后的反應(yīng)混合物中的磁性粒子,從而將通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其以外的成分分離的工序；以及
(3)對(duì)工序(2)中分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體進(jìn)行測(cè)定的工序。
< 工序(1)>
工序(I)中，試樣中的FGF-23在水性介質(zhì)中和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)，從而在磁性粒子上生成由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體。
這里，試樣中的FGF-23和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段的反應(yīng)只要是在磁性粒子上生成由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體，則任何反應(yīng)都可以，例如可以使試樣中的FGF-23和磁性粒子及與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段反應(yīng)，在磁性粒子上生成與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段和FGF-23的免疫復(fù)合體，然后使與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)；也可以使試樣中的FGF-23和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段同時(shí)反應(yīng)。當(dāng)在磁性粒子上生成與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段及FGF-23的免疫復(fù)合體后再使與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)時(shí)，在生成該免疫復(fù)合體后還可設(shè)置洗滌工序。
工序(I)中，與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段和磁性粒子還可在和試樣中的FGF-23發(fā)生反應(yīng)之前預(yù)先使它們結(jié)合。與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段對(duì)磁性粒子的結(jié)合可舉出利用物理吸附的結(jié)合、借助連接物的結(jié)合、利用抗體的Fe區(qū)域-結(jié)合于Fe區(qū)域的抗體、抗生物素蛋白類(lèi)(抗生物素蛋白、鏈霉親和素、親和素等)-生物素等2個(gè)親和性物質(zhì)間的相互作用的結(jié)合等。利用抗體的Fe區(qū)域與結(jié)合于Fe區(qū)域的抗體的相互作用時(shí)，例如可通過(guò)固定在磁性粒子上的與Fe區(qū)域結(jié)合的抗體和第I抗體或其片段的相互作用而使第I抗體或其片段結(jié)合在磁性粒子上。當(dāng)利用抗生物素蛋白類(lèi)與生物素的相互作用時(shí)，例如可以通過(guò)固定在磁性粒子上的抗生物素蛋白類(lèi)與生物素結(jié)合第I抗體或其片段中的生物素的相互作用而使第I抗體或其片段結(jié)合在磁性粒子上。
反應(yīng)溶液中的磁性粒子的濃度只要是能夠測(cè)定本發(fā)明的FGF-23的濃度則無(wú)特別限定，通常為0.1 10mg/mL。反應(yīng)溫度只要是能夠測(cè)定本發(fā)明的FGF-23的溫度則無(wú)特別限定，通常為O 50°C，優(yōu)選為4 45°C，特別優(yōu)選為20 40°C。反應(yīng)時(shí)間只要是能夠測(cè)定本發(fā)明的FGF-23的時(shí)間則無(wú)特別限定，通常為5分鐘 I小時(shí)，優(yōu)選為5 20分鐘。
當(dāng)使用預(yù)先結(jié)合有與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段的磁性粒子時(shí)，結(jié)合有與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段的磁性粒子只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定方法成為可能，貝1J可通過(guò)任何方法來(lái)制造。例如，在0.1 10mg/mL的磁性粒子的混懸液中添加0.1 10 μ g/mL的第I抗體或其片段溶液，在37°C下使其反應(yīng)5分鐘 I小時(shí)，由此可以制造結(jié)合有第I抗體或其片段的磁性粒子。
另外，工序(I)中，在生成由試樣中的FGF-23和與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段及磁性粒子構(gòu)成的免疫復(fù)合體后使與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段結(jié)合在該免疫復(fù)合體上時(shí)，可以在使該第2抗體結(jié)合之前設(shè)置結(jié)合有免疫復(fù)合體的磁性粒子的洗滌工序。磁性粒子的洗滌只要是能夠在磁性粒子上生成由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體，則可以是任何洗滌，例如可舉出從在磁性粒子上生成FGF-23和與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段的免疫復(fù)合體的反應(yīng)后的反應(yīng)混合物中除去磁性粒子以外的成分、在殘留有磁性粒子的反應(yīng)容器中添加洗滌液來(lái)對(duì)磁性粒子進(jìn)行洗滌的方法；在向反應(yīng)后的反應(yīng)混合物中添加洗滌液的同時(shí)將磁性粒子以外的成分除去來(lái)對(duì)磁性粒子進(jìn)行洗滌的方法等。磁性粒子以外的成分的除去例如可通過(guò)利用磁力將磁性粒子聚集并將殘留成分抽吸來(lái)進(jìn)行。作為洗滌液，只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的洗滌液則無(wú)特別限定，例如可舉出后述的水性介質(zhì)、在后述的水性介質(zhì)中添加有表面活性劑的水性介質(zhì)等。作為表面活性劑,例如可舉出吐溫(Tween) 20等非離子性表面活性劑等。
此外，在工序(I)中還可使鹽類(lèi)共存。作為鹽類(lèi)，只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定方法成為可能的鹽類(lèi)則無(wú)特別限定，例如可舉出氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化銨、溴化鋰、溴化鈉、溴化鉀、溴化鈣、溴化鎂、溴化銨等，優(yōu)選氯化鈉。鹽類(lèi)在反應(yīng)中的濃度只要是使本發(fā)明的測(cè)定方法成為可能的濃度則無(wú)特別限定，例如為40 400mmol/L，優(yōu)選為70 250mmol/L。
另外，在工序(I)中，可以使金屬離子、糖類(lèi)、防腐劑、蛋白質(zhì)、表面活性劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等共存。作為金屬離子，例如可舉出鎂離子、錳離子、鋅離子等。作為糖類(lèi)，例如可舉出甘露醇、山梨糖醇等。作為防腐劑，例如可舉出疊氮化鈉、抗生素(鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、BioAce, ProClin300等。作為蛋白質(zhì)，例如可舉出牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)、酪蛋白、BlockAce (大日本制藥公司制)等。作為表面活性劑，例如可舉出陽(yáng)離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子性表面活性劑等。作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定化劑，例如可舉出過(guò)氧化物酶穩(wěn)定化緩沖液、堿性磷酸酶穩(wěn)定化緩沖液等。
< 工序(2)>
工序(2)中，通過(guò)磁力將工序(I)后的磁性粒子、即結(jié)合有由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的磁性粒子聚集，將通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其之外的成分分離。用于聚集磁性粒子的磁力只要是使得本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的磁力則無(wú)特別限定。通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其之外的成分的分離只要是使得本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的分離則無(wú)特別限定。
另外，還可包含在工序(2)之后或者在與工序(2)的同時(shí)將結(jié)合有由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的磁性粒子進(jìn)行洗滌的工序。磁性粒子的洗滌例如可通過(guò)前述的方法等來(lái)進(jìn)行。
< 工序(3)>
接著，在工序(3)中，通過(guò)測(cè)定通過(guò)工序(2)分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體，可以測(cè)定試樣中的FGF-23。作為免疫復(fù)合體的測(cè)定方法，例如可舉出以下的方法等。
(I)與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段未被標(biāo)記化的情況
使在與第2抗體或其片段結(jié)合的第3抗體或其片段上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化第3抗體或其片段與由第I抗體或其片段、FGF-23及第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體所結(jié)合的磁性粒子發(fā)生反應(yīng)，在磁性粒子上形成由第I抗體或其片段、FGF-23、第2抗體或其片段及第3抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體，通過(guò)測(cè)定該免疫復(fù)合體中的標(biāo)記，可以測(cè)定分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體。作為與第2抗體或其片段結(jié)合的第3抗體或其片段，例如可舉出與第2抗體的Fe區(qū)域結(jié)合的抗體或其片段等。標(biāo)記的測(cè)定只要是使分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體的測(cè)定成為可能的方法則無(wú)特別限定，例如可舉出化學(xué)發(fā)光的測(cè)定、熒光的測(cè)定、吸光度的測(cè)定等，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光的測(cè)定。
(2)與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段經(jīng)過(guò)標(biāo)記化的情況
通過(guò)對(duì)形成在磁性粒子上的由第I抗體或其片段、FGF-23及經(jīng)標(biāo)記化的與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體中的標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定，可以測(cè)定分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體。標(biāo)記的測(cè)定只要是使分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體的測(cè)定成為可能的方法則無(wú)特別限定，例如可舉出化學(xué)發(fā)光的測(cè)定、熒光的測(cè)定、吸光度的測(cè)定等，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光的測(cè)定。
(A)化學(xué)發(fā)光的測(cè)定
化學(xué)發(fā)光的測(cè)定可通過(guò)`以下的方法等來(lái)進(jìn)行。
(A-1)標(biāo)記為酶的情況
當(dāng)標(biāo)記為酶時(shí)，例如可通過(guò)使與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的底物作用于標(biāo)記化抗體或片段、利用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)等對(duì)所產(chǎn)生的光(h V)的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定來(lái)進(jìn)行。作為酶，只要是能夠與該酶的底物反應(yīng)而產(chǎn)生光的酶則無(wú)特別限定，例如可舉出堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、熒光素酶等。
使用堿性磷酸酶作為酶時(shí)，作為與堿性磷酸酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的堿性磷酸酶的底物，例如可舉出3- (2’ -螺金剛烷)-4-甲氧基-4- (3’ -磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧雜環(huán)丁燒._.納鹽(AMPPD )、2_氣-5_ { 4-甲氧基螺[1,2- _■氧雜環(huán)丁燒_3，2' - (5'-氣)二環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸酯.二鈉鹽(CDP-Star )、3-{4-甲氧基螺[1，2_ 二氧雜環(huán)丁烷-3，2’- (5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸烷]_4_基}苯基磷酸酯.二鈉鹽(CSPD )、[10-甲基-9 (10H) - B丫唳叉基(acridinylidene)]苯氧基甲基憐酸.二鈉鹽(Lumigen APS-5)、9- (4-氯苯基硫代磷酰氧基亞甲基)-10-甲基吖啶酮？ 二鈉鹽等。
使用過(guò)氧化物酶作為酶時(shí)，作為與過(guò)氧化物酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的過(guò)氧化物酶的底物，例如可舉出過(guò)氧化氫與發(fā)光化合物的組合等。作為發(fā)光化合物，例如可舉出魯米諾化合物、光澤精化合物等。
使用β -D-半乳糖苷酶作為酶時(shí)，作為與β -D-半乳糖苷酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的β -D-半乳糖苷酶的底物，例如可舉出Galacton-Plus[Applied Biosystems公司制]等。
使用熒光素酶作為酶時(shí)，作為與熒光素酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的熒光素酶的底物，例如可舉出熒光素、腔腸素等。
(A-2)標(biāo)記為發(fā)光物質(zhì)的情況
當(dāng)標(biāo)記為發(fā)光物質(zhì)時(shí)，例如可通過(guò)利用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)等測(cè)定所產(chǎn)生的來(lái)自于免疫復(fù)合體中的發(fā)光物質(zhì)的光的強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。作為發(fā)光物質(zhì)，只要是使本發(fā)明的測(cè)定成為可能的發(fā)光物質(zhì)則無(wú)特別限定，例如可舉出吖啶鎗及其衍生物、釕絡(luò)合物化合物、洛芬堿等。
(B)熒光的測(cè)定
熒光的測(cè)定可通過(guò)以下的方法等來(lái)進(jìn)行。
(B-1)標(biāo)記為酶的情況
當(dāng)標(biāo)記為酶時(shí)，例如可通過(guò)使與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的底物作用于標(biāo)記化抗體或片段、利用熒光強(qiáng)度計(jì)測(cè)定所產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。作為酶，只要是能夠與該酶的底物發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的酶則無(wú)特別限定，例如可舉出過(guò)氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶等。
使用過(guò)氧化物酶作為酶時(shí)，作為與過(guò)氧化物酶發(fā)生反應(yīng)而生成熒光的過(guò)氧化物酶的底物，例如可舉出過(guò)氧化氫與熒光化合物的組合等。作為熒光化合物，例如可舉出4-羥基苯基醋酸、3- (4-羥基苯基)丙酸、香豆素等。
使用β -D-半乳糖苷酶作為酶時(shí)，作為與β -D-半乳糖苷酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的β -D-半乳糖苷酶的底物，例如可舉出4-甲基傘形酮- β -D-吡喃半乳糖苷或其類(lèi)似化合物等。
使用β-葡萄糖醛酸酶作為酶時(shí)，作為與β-葡萄糖醛酸酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的β -葡萄糖醒酸酶的底物，例如可舉出TokyoGreen -β GluU (積水Medical公司制)等。
(B-2)標(biāo)記為熒光物質(zhì)的情況
當(dāng)標(biāo)記為熒光物質(zhì)時(shí)，例如可通過(guò)利用熒光強(qiáng)度計(jì)等測(cè)定所產(chǎn)生的來(lái)自于免疫復(fù)合體中的熒光物質(zhì)的熒光的強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。作為熒光物質(zhì)，只要是使本發(fā)明的測(cè)定成為可能的熒光物質(zhì)則無(wú)特別限定，例如可舉出FITC (異硫氰酸熒光素)、RITC (羅丹明B異硫氰酸酯)、quantum dot (Science, 281，2016-2018，1998)、藻紅蛋白等藻膽蛋白、GFP (綠色突光蛋白，Green fluorescent Protein)、RFP (紅色突光蛋白，Red fluorescent Protein)、YFP(黃色突光蛋白，Yellow fluorescent Protein)、BFP (藍(lán)色突光蛋白 Blue fluorescentProtein)等。
(C)吸光度的測(cè)定
吸光度的測(cè)定可通過(guò)以下的方法等來(lái)進(jìn)行。
(C-1)標(biāo)記為酶的情況
當(dāng)標(biāo)記為酶時(shí)，例如可通過(guò)使與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生色素的底物作用于標(biāo)記化抗體或片段、利用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀等測(cè)定所產(chǎn)生的色素的吸光度來(lái)進(jìn)行。作為酶，只要是能夠與該酶的底物發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生色素的酶則無(wú)特別限定，例如可舉出過(guò)氧化物酶等。
當(dāng)使用過(guò)氧化物酶作為酶時(shí)，作為與過(guò)氧化物酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生色素的過(guò)氧化物酶的底物，例如可舉出過(guò)氧化氫與氧化顯色型色原體的組合等。作為氧化顯色型色原體，例如可舉出無(wú)色型色原體、氧化偶聯(lián)發(fā)色型色原體等。
無(wú)色型色原體是在過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物酶等過(guò)氧化活性物質(zhì)的存在下單獨(dú)地轉(zhuǎn)變成色素的物質(zhì)。具體地可舉出四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺、10-N-羧甲基氨基甲?；?3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)UO-N-甲基氨基甲?；鵢3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)_4，4’ -雙(二甲基氨基)二苯基胺鈉鹽(DA-64)、4，4’ -雙(二甲基氨基)二苯基胺、雙〔3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)等。
氧化偶聯(lián)發(fā)色型色原體是在過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物酶等過(guò)氧化活性物質(zhì)的存在下2個(gè)化合物發(fā)生氧化偶聯(lián)而產(chǎn)生色素的物質(zhì)。作為2個(gè)化合物的組合，可舉出偶聯(lián)劑與苯胺類(lèi)(Trinder試劑)的組合、偶聯(lián)劑與苯酚類(lèi)的組合等。作為偶聯(lián)劑，例如可舉出4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。作為苯胺類(lèi)，可舉出N- (3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(T00S)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺(HDAOS )、N，N- 二甲基-3-甲基苯胺、N，N-雙(3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N- (3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)_3_甲氧基苯胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N’ -乙酰基乙二胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-4-氟_3，5- 二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。作為苯酚類(lèi)，可舉出苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羥基-2,4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
根據(jù)磁性粒子上生成的免疫復(fù)合體測(cè)定中的測(cè)定值來(lái)確定試樣中的FGF-23濃度例如可通過(guò)以下的方法來(lái)進(jìn)行。
使用已知濃度的FGF-23進(jìn)行上述工序(I) 工序(3)，制作表示FGF-23的濃度與測(cè)定值(標(biāo)記來(lái)源的信息量)的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，接著使用待測(cè)定的試樣進(jìn)行測(cè)定，將所得測(cè)定值對(duì)照預(yù)先制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定待測(cè)定試樣中的FGF-23濃度。
(試樣)
作為本發(fā)明中的試樣，只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的試樣則無(wú)特別限定，例如可舉出全血、血漿、血清、髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，優(yōu)選血漿、血清等。
(水性介質(zhì))
作為本發(fā)明中使用的水性介質(zhì)，只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的水性介質(zhì)則無(wú)特別限定，例如可舉出去離子水、蒸餾水、緩沖液等，優(yōu)選緩沖液。作為緩沖液的制備中使用的緩沖劑，只要是具有緩沖能力則無(wú)特別限定，可舉出PH為I 11的例如乳酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、琥珀酸緩沖劑、鄰苯二甲酸緩沖劑、磷酸緩沖劑、三乙醇胺緩沖劑、二乙醇胺緩沖劑、賴氨酸緩沖劑、巴比妥酸緩沖劑、咪唑緩沖劑、蘋(píng)果酸緩沖齊U、草酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、碳酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、Good’s緩沖劑等。
作為Good’ s緩沖劑，例如可舉出2-嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖劑、雙(2_羥基乙基)亞氨基三(羥基甲基)甲烷(Bis-Tris)緩沖劑、三(羥基甲基)氨基甲烷(Tris)緩沖劑、N- (2-乙酰胺)亞氨基二醋酸(ADA)緩沖劑、哌嗪-N，N’ -雙(2-乙磺酸)(PIPES)緩沖劑、2-[N- (2-乙酰胺)氨基]乙磺酸(ACES)緩沖劑、3-嗎啉代-2-羥基丙磺酸(MOPSO)緩沖劑、2- [N, N-雙(2-羥基乙基)氨基]乙磺酸(BES )緩沖劑、3-嗎啉代丙磺酸(MOPS )緩沖劑、2- {N-[三(羥基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)緩沖劑、N- (2-羥基乙基)-N’ - (2-磺乙基)哌嗪(HEPES)緩沖劑、3-[N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]_2_羥基丙磺酸(DIPSO)緩沖齊[J、2_羥基-3- {[N-三(羥基甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPSO)緩沖劑、哌嗪-N，N’-雙(2-羥基丙烷-3-磺酸)(POPSO)緩沖劑、N- (2-羥基乙基)-N’ - (2-羥基-3-磺丙基)哌嗪(HEPPSO)緩沖劑、N- (2-羥基乙基)-N，- (3-磺丙基)哌嗪(EPPS)緩沖劑、[N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸](Tricine)緩沖劑、[N，N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸](Bicine)緩沖劑、3-[N-三(羥基甲基)甲基]氨基丙磺酸(TAPS)緩沖劑、2- (N-環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)緩沖劑、3- (N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸(CAPSO)緩沖劑、3- (N-環(huán)己基氨基)丙磺酸(CAPS)緩沖劑等。
(磁性粒子)
作為本發(fā)明中的磁性粒子，只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的磁性粒子則無(wú)特別限定，例如可舉出用鐵氧體被覆的膠乳、用鐵氧體被覆的聚合物粒子等。另外，為了使抗體的結(jié)合變得容易，還可使用具有與生物素結(jié)合的性質(zhì)的抗生物素蛋白、在表面固定有親和素或鏈霉親和素的磁性粒子。磁性粒子的粒徑并無(wú)特別限定，例如為Iym 6μπι，優(yōu)選為Ιμπι 3μπι。作為本發(fā)明中的磁性粒子，可以使用市售的磁性粒子。作為市售的磁性粒子，例如可舉出Dynabeads M_280Streptavidin (Dynal公司制)、DynabeadsM-280Tosylactivated (Dynal 公司制)、Dynabeads MyOne Streptavidin Tl (Dynal 公司制)、Dynabeads MyOne TosyIactivatedCDynal 公司制)、Estapor(Merck 公司制)、Sera_MagMagnetic Streptavidin Particles (Thermo Scientific 公司制)、MAGNOTEX-SA (JSR 公司制)等。
(抗體)
本發(fā)明中與FGF-23結(jié)合的抗體(第I抗體及第2抗體)只要是使本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定成為可能的抗體則無(wú)特別限定，可以使用多克隆抗體、單克隆抗體中的任一種，優(yōu)選單克隆抗體。另外，本發(fā)明中不僅可使用全長(zhǎng)的抗體，還可使用抗體片段。作為抗體片段，例如可舉出通過(guò)對(duì)抗體進(jìn)行木瓜蛋白酶處理而獲得的Fab、通過(guò)對(duì)抗體進(jìn)行胃蛋白酶處理而獲得的F (ab’)2、通過(guò)對(duì)抗體進(jìn)行胃蛋白酶處理-還原處理而獲得的Fab’等除去了 Fe部分的抗體片段等。當(dāng)使用其表面固定有抗生物素蛋白、親和素或鏈霉親和素的磁性粒子作為磁性粒子時(shí)，可以使用生物素結(jié)合于第I抗體而成的生物素結(jié)合第I抗體。
本發(fā)明中使用的與FGF-23結(jié)合的第I抗體和第2抗體中，各個(gè)抗體所結(jié)合的FGF-23的部位可以相同也可不同，優(yōu)選不同。
本發(fā)明中使用的抗體可使用FGF-23本身或相當(dāng)于FGF-23中的表位的肽作為抗原、利用通常的抗體制作方法來(lái)獲得，還可以市售品的形式獲得。作為與FGF-23結(jié)合的抗體，例如可舉出以 FERM BP-7838.FERM BP_7839、FERM BP-7840,FERM BP-8268 分別保藏的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體等。
另外，在本發(fā)明的FGF-23的測(cè)定方法及測(cè)定試劑中，還可使用與FGF-23結(jié)合的適體等抗體以外的物質(zhì)來(lái)代替與FGF-23結(jié)合的抗體。
(測(cè)定試劑)
本發(fā)明的試樣中的FGF-23測(cè)定試劑可以用于本發(fā)明的試樣中的FGF-23的測(cè)定方法。本發(fā)明的測(cè)定試劑含有磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段。與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段還可使用結(jié)合于磁性粒子者。
與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段結(jié)合于磁性粒子上時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定試劑含有結(jié)合有與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段的磁性粒子以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段。
與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段未結(jié)合于磁性粒子時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定試劑含有固定有2個(gè)親和性物質(zhì)中一者的磁性粒子、結(jié)合有2個(gè)親和性物質(zhì)中另一者的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段。作為2個(gè)親和性物質(zhì)的組合，例如可舉出抗生物素蛋白、鏈霉親和素、親和素等抗生物素蛋白類(lèi)與生物素的組合等。作為本發(fā)明的測(cè)定試劑的一個(gè)方式，例如可舉出含有固定有抗生物素蛋白類(lèi)的磁性粒子、生物素結(jié)合于與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段而成的生物素結(jié)合第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段的測(cè)定試劑。
第2抗體或其片段被標(biāo)記化時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定試劑進(jìn)一步含有能夠?qū)τ傻贗抗體或其片段、FGF-23及標(biāo)記化第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體中的標(biāo)記化第2抗體或其片段進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)記測(cè)定試劑。標(biāo)記測(cè)定試劑只要是能夠?qū)λa(chǎn)生的該免疫復(fù)合體中的標(biāo)記化第2抗體或其片段進(jìn)行測(cè)定的試劑則無(wú)特別限定，例如可舉出化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑、熒光測(cè)定試劑等，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑。
與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段未經(jīng)標(biāo)記化時(shí)，本發(fā)明的測(cè)定試劑進(jìn)一步含有在與該第2抗體或其片段結(jié)合的第3抗體或其片段上結(jié)合有標(biāo)記的標(biāo)記化第3抗體或其片段、以及能夠?qū)τ傻贗抗體或其片段、FGF-23、第2抗體或其片段及標(biāo)記化第3抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體中的標(biāo)記化第3抗體或其片段進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)記測(cè)定試劑。作為與第2抗體或其片段結(jié)合的第3抗體或其片段，例如可舉出與第2抗體的Fe區(qū)域結(jié)合的抗體或其片段等。另外，能夠?qū)υ撁庖邚?fù)合體中的標(biāo)記化第3抗體或其片段進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)記測(cè)定試劑只要是能夠測(cè)定所產(chǎn)生的該免疫復(fù)合體中的標(biāo)記化第3抗體或其片段的試劑則無(wú)特別限定，例如可舉出化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑、熒光測(cè)定試劑、吸光度測(cè)定試劑等，優(yōu)選化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑。
化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑特別地是標(biāo)記為酶時(shí)所使用的試劑，可舉出含有與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的酶的底物的試劑等。對(duì)于酶和與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生光的酶的底物的組合，可舉出前述的組合等。
熒光測(cè)定試劑特別地是標(biāo)記為酶時(shí)所使用的試劑，可舉出含有與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的酶的底物的試劑等。對(duì)于酶和與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生熒光的酶的底物的組合，可舉出前述的組合等。
吸光度測(cè)定試劑特別地是標(biāo)記為酶時(shí)所使用的試劑，可舉出含有與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生色素的酶的底物的試劑等。對(duì)于酶和與該酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生色素的酶的底物的組合，可舉出前述的組合等。
作為本發(fā)明的測(cè)定試劑中使用的磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段，例如可分別舉出前述的磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段等。另外，本發(fā)明的測(cè)定試劑中還可根據(jù)需要分別含有前述的水性介質(zhì)、標(biāo)記酶的底物、金屬離子、糖類(lèi)、防腐劑、蛋白質(zhì)、表面活性劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑等。
以下，通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但這些并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
(I)材料及測(cè)定方法
<測(cè)定用試樣>
將由健康人獲得的血清(FGF-23濃度為10pg/mL的血清；由Aries公司購(gòu)入)用含有0.2%BSA(Bovogen Biologicals公司制)的磷酸緩沖化生理鹽水(含有0.15mol/L氯化鈉的lOmmol/L磷酸緩沖液，pH為7.2)進(jìn)行稀釋，使得FGF-23濃度達(dá)到9pg/mL、8pg/mL、7pg/mL、6pg/mL、5pg/mL、4pg/mL、3pg/mL、2pg/mL、lpg/mL,將如此稀釋后的溶液及含有 0.2%BSA的磷酸緩沖化生理鹽水(FGF-23濃度為Opg/mL)用于測(cè)定用試樣。
<磁性粒子混懸液>
作為磁性粒子，使用結(jié)合有鏈霉親和素的市售的磁性粒子(Dynabeads MyOneStreptavidin Tl ；Dynal公司制),制備由以下組成構(gòu)成的磁性粒子混懸液。
MES CpH 為 6.5)50mmol/L鏈霉親和素結(jié)合磁性粒子0.75mg/mL BSA0.1%氯化鈉0.1mol/L
<生物素結(jié)合抗FGF-23抗體和生物素結(jié)合抗FGF-23抗體溶液>
作為第I抗體，使用以FERM BP-7838保藏的雜交瘤所產(chǎn)生的抗FGF-23單克隆抗體2C3B,將該抗體與NHS-生物素混合，在37°C下反應(yīng)I小時(shí)，將反應(yīng)后的混合物供至S印hadexG-25柱(GE Health Science Japan公司制)，將未反應(yīng)的NHS-生物素除去，從而制備了生物素結(jié)合抗FGF-23單克隆抗體。使用所得的生物素結(jié)合抗FGF-23單克隆抗體，制備由以下組成構(gòu)成的生物素結(jié)合抗FGF-23抗體溶液。
MES (pH:J、j 6.5)50mmol/L抗FGF-23單克隆抗體2C3B5pg/mL BSA0.1%氯化鈉0.1mol/L
<堿性磷酸酶標(biāo)記抗FGF-23抗體片段和堿性磷酸酶標(biāo)記抗FGF-23抗體片段溶液>
作為第2抗體片段，利用胃蛋白酶將以FERM BP-7839保藏的雜交瘤所產(chǎn)生的抗FGF-23單克隆抗體3C1E消化后，利用使用了 G3000SW柱(Tosoh公司制；口徑:21.5mm ;長(zhǎng)度:60cm)的HPLC系統(tǒng)(日立制作所公司制)分離出F (ab’)2。利用2-巰基乙胺鹽酸鹽(Nacalai Tesque公司制)將所得的F (ab，)2還原后,利用使用了 G3000SW柱(Tosoh公司制；口徑:21.5mm ;長(zhǎng)度:60cm)的HPLC系統(tǒng)(日立制作所公司制)分離出Fab’。按照以下順序，利用馬來(lái)酰亞胺法使所得的Fab’與堿性磷酸酶結(jié)合。
使用馬來(lái)酰亞胺化試劑Sulfo-HMCS (同仁化學(xué)研究所公司制)將堿性磷酸酶馬來(lái)酰亞胺化，將反應(yīng)混合物供至Sephadex G-25柱(GE Health Science Japan公司制)將未反應(yīng)的Sulfo-HMCS除去，從而獲得馬來(lái)酰亞胺化堿性磷酸酶。
將所制得的馬來(lái)酰亞胺化堿性磷酸酶與Fab’混合，制作了堿性磷酸酶標(biāo)記Fab’抗體。使用所得的堿性磷酸酶標(biāo)記Fab’抗體，制備由以下組成構(gòu)成的堿性磷酸酶標(biāo)記抗FGF-23抗體片段溶液。
MES (pH Xi 6,5)50mmol/L堿性磷酸酶標(biāo)記抗FGF-23抗體片段5pg/mL BSA0.1%氯化鈉0.1mol/L
(2)試樣中的FGF-23的測(cè)定
在上述(I)制得的測(cè)定用試樣10 μ L中添加各30 μ L的(I)所制得的磁性粒子混懸液、生物素結(jié)合抗FGF-23抗體溶液及堿性磷酸酶標(biāo)記抗FGF-23抗體片段溶液并進(jìn)行攪拌，在37°C下使其反應(yīng)20分鐘。利用磁力將磁性粒子聚集，將磁性粒子以外的反應(yīng)溶液除去，同時(shí)利用洗滌液[含有0.1%吐溫20的50mmol/L MOPS緩沖液(pH為7.35)]將磁性粒子洗滌5次。之后，添加以9- (4-氯苯基硫代磷酰氧基亞甲基)-10-甲基吖啶酮.二鈉鹽為主成分的發(fā)光底物液100 μ L并進(jìn)行攪拌，測(cè)定所產(chǎn)生的發(fā)光量(RLU)。將測(cè)定結(jié)果示于圖1。
作為規(guī)定作為測(cè)定體系能夠測(cè)定的最小濃度的方法，有使用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差在統(tǒng)計(jì)學(xué)上進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。具體地說(shuō)，當(dāng)成為對(duì)(I)所制得的試樣測(cè)定5次時(shí)的平均值-2倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(-2SD)比對(duì)0pg/mL試樣測(cè)定5次時(shí)的平均值+ 2倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(+ 2SD)更高的RLU時(shí)，則規(guī)定為能夠檢測(cè)該試樣的濃度。
測(cè)定FGF-23濃度為0pg/mL的試樣時(shí)的發(fā)光量的平均+ 2SD為173RLU (圖1的虛線)。而測(cè)定FGF-23濃度為lpg/mL的試樣時(shí)的發(fā)光量的平均-2SD為186RLU，是比測(cè)定0pg/mL試樣時(shí)的發(fā)光量的平均+ 2SD更高的值，因此確認(rèn)為能夠測(cè)定lpg/mL的FGF-23。由此，該測(cè)定方法中，可以將能夠檢測(cè)FGF-23的最小濃度規(guī)定為lpg/mL。另外，如圖1所示，在FGF-23為lpg/mL以上的濃度時(shí)，可見(jiàn)濃度依賴性的發(fā)光量增加。
實(shí)施例2
(I)材料及測(cè)定方法
<測(cè)定用試樣>
將通過(guò)W02003/057733所記載的方法制得的FGF-23用含有0.2%BSA (BovogenBiologicals公司制)的磷酸緩沖化生理鹽水(含有0.15mol/L氯化鈉的10mmol/L磷酸緩沖液，pH 為 7.2)進(jìn)行稀釋，以使得 FGF-23 濃度達(dá)到 10000pg/mL、3000pg/mL、1000pg/mL、300pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、5pg/mL,將如此稀釋后的溶液及含有 0.2%BSA 的磷酸緩沖化生理鹽水(FGF-23濃度為Opg/mL)用于測(cè)定用試樣。(2)試樣中的FGF-23的測(cè)定除了使用上述(I)的測(cè)定用試樣之外，通過(guò)與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行了測(cè)定。將其結(jié)果示于圖2。由圖2所示可知，在5 10000pg/mL的濃度范圍內(nèi)，發(fā)光量以FGF-23濃度依賴性地且直線地增加。因此可知，通過(guò)本發(fā)明的測(cè)定方法，可以在5 10000pg/mL的范圍內(nèi)測(cè)定FGF-23濃度。實(shí)施例3人工透析是指利用外部手段進(jìn)行血液的陳舊廢物除去、電解質(zhì)維持、水分量維持，但為了防止在體外循環(huán)的血液的凝固，要使用抗凝劑(肝素)。因此，在透析患者檢體中，在血清分離后多見(jiàn)血纖維蛋白析出。當(dāng)析出至血清中的血纖維蛋白存在時(shí)，有可能對(duì)FGF-23的測(cè)定體系產(chǎn)生影響而無(wú)法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。作為判定是否獲得了準(zhǔn)確的測(cè)定值的方法，經(jīng)常實(shí)施同時(shí)重現(xiàn)性試驗(yàn)、添加回收試驗(yàn)、稀釋線性試驗(yàn)。因此，使用透析患者來(lái)源的血清(由Discovery Life Sciences公司購(gòu)入)對(duì)實(shí)施例1的測(cè)定方法實(shí)施以下的同時(shí)重現(xiàn)性試驗(yàn)、添加回收試驗(yàn)、稀釋線性試驗(yàn)。(I)同時(shí)重現(xiàn)性試驗(yàn)同時(shí)重現(xiàn)性試驗(yàn)是指使用同一試樣(血清、血漿等)多次、連續(xù)地進(jìn)行測(cè)定并對(duì)測(cè)定值的不均進(jìn)行評(píng)價(jià)、從而判斷測(cè)定方法的準(zhǔn)確性的方法。使用透析患者來(lái)源的3種血清，利用實(shí)施例1所記載的方法，對(duì)各個(gè)血清中的FGF-23測(cè)定10次。將由測(cè)定獲得的FGF-23濃度和平均、變異系數(shù)(CV%)示于第I表。相對(duì)于各血清的變異系數(shù)為1.2 3.1%，是良好的。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的方法，可以重現(xiàn)性良好地測(cè)定透析患者來(lái)源的血清中的FGF-23。第I 表
權(quán)利要求
1.一種試樣中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的測(cè)定方法，以下將該成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子記為FGF-23，該測(cè)定方法的特征在于，包含以下的工序: (O使試樣中的FGF-23在水性介質(zhì)中和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)，從而在磁性粒子上產(chǎn)生由與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、FGF-23以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的工序； (2)利用磁力聚集工序(I)后的反應(yīng)混合物中的磁性粒子，從而將通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其以外的成分分離的工序；以及 (3)對(duì)工序(2)中分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體進(jìn)行測(cè)定的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其中，第2抗體為經(jīng)標(biāo)記化的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定方法，其中，經(jīng)標(biāo)記化的抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，工序(3)的磁性粒子上的免疫復(fù)合體的測(cè)定通過(guò)化學(xué)發(fā)光的測(cè)定來(lái)進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其中，試樣為血清或血漿。
6.一種試樣中的FGF-23測(cè)定試劑，其特征在于，其含有磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第I抗體或其片段、以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其中，第2抗體為經(jīng)標(biāo)記化的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定試劑，其中，經(jīng)標(biāo)記化的抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑，其中，進(jìn)一步含有化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6 9中任一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑，其中，試樣為血清或血漿。
全文摘要
本發(fā)明提供試樣中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23(FGF-23)的測(cè)定方法。該測(cè)定方法的特征在于，包含以下工序(1)使試樣中的FGF-23在水性介質(zhì)中和磁性粒子、與FGF-23結(jié)合的第1抗體或其片段以及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段反應(yīng)，從而在磁性粒子上產(chǎn)生由與FGF-23結(jié)合的第1抗體或其片段、FGF-23及與FGF-23結(jié)合的第2抗體或其片段構(gòu)成的免疫復(fù)合體的工序；(2)利用磁力聚集工序(1)后的反應(yīng)混合物中的磁性粒子，從而將通過(guò)磁力聚集的磁性粒子與除其之外的成分分離的工序；以及(3)對(duì)工序(2)中分離出的磁性粒子上的免疫復(fù)合體進(jìn)行測(cè)定的工序。通過(guò)本發(fā)明，可以提供高靈敏度、測(cè)定范圍廣的試樣中的FGF-23的測(cè)定方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103180733SQ201180051819
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者鵜澤耕治, 鈴木惠美子, 池田和幸, 守田和樹(shù) 申請(qǐng)人:協(xié)和梅迪克斯株式會(huì)社