專利名稱：一種sTERM-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種STERM-I酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、該試劑盒的制備方法以及采用該試劑盒檢測(cè)sTERM-1的方法。
背景技術(shù)：
TREM是最近發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于髓樣細(xì)胞的免疫球蛋白超家族活化受體，目前已確認(rèn)的至少有5個(gè)成員，其中TREM-I選擇性的表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和級(jí)聯(lián)放大中起重要作用。盡管TREM-I天然配體目前還沒有明確，但是有研究發(fā)現(xiàn)使用TREM-I競(jìng)爭(zhēng)性單克隆抗體激活TREM-I能夠引起PMN脫顆粒，導(dǎo)致促炎性因子和蛋白水解酶釋放，呼吸爆發(fā)和細(xì)胞吞噬，而且這種效應(yīng)能與Toll-Iike受體(TLR)的配體如LPS等產(chǎn)生協(xié)同作用，而運(yùn)用可溶性TREM-I融合蛋白阻斷TREM-I能夠保護(hù)小鼠免受LPS或細(xì)菌膿毒血癥時(shí)引起的致命性損傷。研究認(rèn)為TREM-I是急性炎癥反應(yīng)過程中起到關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)TREM-I是治療炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)。TREM-I可溶性形式sTREM-Ι是TREM-I的mRNA剪接突變體編碼的一種缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的分泌亞型，研究發(fā)現(xiàn)肺部感染過程時(shí)sTREM-Ι可以釋放入體液且與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可用于評(píng)價(jià)療效和評(píng)估預(yù)后。對(duì)接受機(jī)械通氣患者而言，細(xì)菌性肺炎的診斷和治療還很困難。支氣管肺泡灌洗，所獲標(biāo)本的微生物定量培養(yǎng)，被認(rèn)為是機(jī)械通氣相關(guān)性肺炎(VAP)診斷的最特異性的工具，然而細(xì)菌培養(yǎng)會(huì)延遲診斷24 48 h,這樣將導(dǎo)致不必要的抗菌素的使用，以及對(duì)于不存在感染性疾病的患者經(jīng)驗(yàn)性廣普抗菌素的應(yīng)用都是有弊無利的。Gibot等對(duì)148例疑為肺炎的機(jī)械通氣患者進(jìn)行了前瞻性研究，由兩名不知道患者sTREM-Ι水平的ICU專家獨(dú)立決定肺炎的診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)38例社區(qū)獲得性肺炎患者及46例VAP患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中sTREM_l水平顯著升高，但64例非肺炎患者sTREM-Ι水平不升高，sTREM-Ι升高診斷肺炎的敏感性為98%，特異性為90%，多變量分析顯示，sTREM-Ι升高比臨床肺部感染評(píng)分及細(xì)胞因子水平能更好地預(yù)測(cè)肺炎，而且sTREM-Ι水平與慢性阻塞性肺氣腫病史、BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)目、感染細(xì)菌的類型、以及其他臨床和生物學(xué)上的變量相關(guān)性不大，是一個(gè)高度特異性、高度敏感的獨(dú)立的預(yù)測(cè)指標(biāo)，因而研究者認(rèn)為對(duì)于接受機(jī)械通氣治療的患者，BALF中的sTREM-Ι的快速檢測(cè)，將為臨床上細(xì)菌、真菌感染性肺炎與非肺炎的診斷和鑒別診斷提供快捷、有力的證據(jù)。Determann等動(dòng)態(tài)檢測(cè)VAP患者非直接支氣管肺泡灌洗液中sTREM-Ι水平也證實(shí)sTREM-Ι是VAP的潛在標(biāo)志物。最近Horonenko等對(duì)VAP患者呼出氣冷凝液中sTREM_l水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)呼出氣冷凝液中sTREM_l水平能很好的診斷或鑒別VAP。以上研究結(jié)果說明TREM-I是一種新的急性肺部感染標(biāo)志物，可用于急性肺部感染等炎癥性疾病的早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后估計(jì)?，F(xiàn)有技術(shù)中已公開的sTREM-lELISA試劑盒，大都也都不適合臨床診斷研究，只適合一定范圍的科研實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前都需要進(jìn)行樣本TREM-I含量預(yù)測(cè)，且檢測(cè)范圍也不高。因此，開發(fā)出一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在的sTERM-1，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，降低了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的差異性，適合臨床檢測(cè)的應(yīng)用，對(duì)多種疾病尤其是急性肺炎的預(yù)防和診療有極大的指導(dǎo)意義。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括 (I)酶標(biāo)板和檢測(cè)抗體,所述酶標(biāo)板上包被固定有能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)；(2)反應(yīng)劑和檢測(cè)劑，用于通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)待測(cè)樣品中sTERM-Ι存在以否的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述捕獲抗體為單克隆sTERM-Ι抗體。更優(yōu)地，所述捕獲抗體為鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體。優(yōu)選地，所述檢測(cè)抗體為多克隆sTERM-Ι抗體。更優(yōu)地，所述檢測(cè)抗體為兔抗人sTERM-Ι多克隆抗體。優(yōu)選地，所述反應(yīng)劑包括分開包裝的陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、20倍濃縮洗滌液，樣品緩沖液；所述檢測(cè)劑包括顯色底物液A、底物液B及終止液。 優(yōu)選地，所述檢測(cè)抗體通過HRP-偶聯(lián)緩沖液標(biāo)記有辣根過氧化物酶，所述HRP-偶聯(lián)緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
Tris6.05g，
Nacl8.4g，
鹿糖20g ,
BSA10g,
CaCl2IOOmg,
EDTAO. 374g,
苯酹O. lg,
硫柳汞O. Olg。優(yōu)選地，所述捕獲抗體通過包被緩沖液固定于所述酶標(biāo)板的檢測(cè)孔中，所述包被緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
NaCl 43. 25g,
Na2HP04 7.65g,
NaH2P04 I. 3g ；
在進(jìn)行包被處理后，每孔加入100-200 μ L牛血清白蛋白溶液洗滌2-4次，所述牛血清白蛋白溶液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
NaHPO4. 12 H2O 3. 72g,
KH2PO40.43g,
NaCl6. 8g ；
再向每孔中加入200-300μ L的封閉液進(jìn)行封閉處理，所述封閉液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液BSAIOg,
鹿糖20g,
硫柳汞O. Olg。另外，本發(fā)明還提供了一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟
(O在酶標(biāo)板上每孔加入100ul5ug/ml/s的捕獲抗體,4°C包被反應(yīng)過夜,所述捕獲抗體能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體；
(2)去掉包被緩沖液，每孔加入100-200 μ L牛血清白蛋白溶液洗滌2-4次，所述牛血清白蛋白溶液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
NaHPO4. 12 H2O 3. 72g,
KH2PO40.43g,
NaCl6. 8g ；
再向每孔中加入200-300 μ L的封閉液進(jìn)行封閉反應(yīng)1-3小時(shí)，所述封閉液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
BSAIOg,
鹿糖20g,
硫柳汞O. Olg。優(yōu)選地，所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，還包括通過HRP-偶聯(lián)緩沖液在檢測(cè)抗體上標(biāo)記有辣根過氧化物酶，檢測(cè)抗體上標(biāo)記辣根過氧化物酶，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，所述HRP-偶聯(lián)緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
Tris6.05g，
Nacl8.4g，
鹿糖20g ,
BSA10g,
CaCl2IOOmg,
EDTA0.374g,
苯酹0. lg,
硫柳汞0. Olg。再則，本發(fā)明還提供一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1)在包被固定有能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體的酶標(biāo)板上加入待檢測(cè)樣品或sTREM-Ι標(biāo)準(zhǔn)抗原50-100ul/孔，37°C反應(yīng)0. 5-1. 5小時(shí)；
(2)去除步驟I中反應(yīng)液體，用洗滌緩沖液洗滌2-4次；加入200ng/mlHRP標(biāo)記的sTREM-Ι檢測(cè)抗體50-200ul/孔，37°C反應(yīng)20-40分鐘，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)；
(3)去掉sTREM-Ι檢測(cè)抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌3-5次；每孔加入IOOul顯色底物室溫反應(yīng)10分鐘，然后每孔加入IM HCL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀數(shù)分析。優(yōu)選地，所述捕獲抗體為單克隆sTERM-Ι抗體；更優(yōu)地，所述捕獲抗體為鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體。優(yōu)選地，所述檢測(cè)抗體為多克隆sTERM-Ι抗體；更優(yōu)地，所述檢測(cè)抗體為兔抗人sTERM-1多克隆抗體。相比于現(xiàn)有技術(shù)，sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，利用本發(fā)明建立的雙位點(diǎn)一步法ELISA由于操作步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，降低了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的差異性。本發(fā)明試劑盒中所采用的捕獲抗體為具有高親和力的鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體，使本發(fā)明所建立的雙位點(diǎn)一步法ELISA敏感性和特異性更強(qiáng)。相比雙抗體夾心法ELISA更適合臨床檢測(cè)的應(yīng)用。通過采用本發(fā)明的方法和試劑盒檢測(cè)收集的280例臨床樣本中證實(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案具有檢測(cè)時(shí)間短、效率高，檢測(cè)范圍大(最低濃度和最高濃度之間差200倍，其它公司產(chǎn)品不到100倍)，最低檢測(cè)限接近O. 2ng/ml (其它公司均在O. 3ng/ml以上)的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備 按如下步驟進(jìn)行
(1)包被在酶標(biāo)板上每孔加入100ul5ug/ml/s的捕獲抗體,4°C包被反應(yīng)過夜,所述捕獲抗體能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體；
(2)封閉去掉包被緩沖液，每孔加入100-200μ L牛血清白蛋白溶液洗滌3次，所述牛血清白蛋白溶液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
NaHPO4. 12 H2O 3. 72g,
KH2PO40.43g,
NaCl6. 8g ；
再向每孔中加入200-300 μ L的封閉液進(jìn)行封閉反應(yīng)2小時(shí)，所述封閉液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
BSAIOg,
鹿糖20g,
硫柳汞O. Olg。(3)保存將封閉好的微孔板甩去孔內(nèi)液體、拍干，于25’ C(室溫)環(huán)境下放置過夜，然后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4°C環(huán)境中。另外，還需要通過HRP-偶聯(lián)緩沖液在檢測(cè)抗體上標(biāo)記有辣根過氧化物酶，檢測(cè)抗體上標(biāo)記辣根過氧化物酶,所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，所述HRP-偶聯(lián)緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液
Tris6.05g，
Nacl8.4g，
鹿糖20g ,
BSA10g,
CaCl2IOOmg,
EDTAO. 374g,
苯酹O. lg,
硫柳汞O. Olg。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，按照上述方案制備的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒具有良好的檢測(cè)效果，當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整包被處理的時(shí)間、洗滌時(shí)間和封閉時(shí)間，已經(jīng)所用各溶液的濃度，在能夠保證解決本發(fā)明技術(shù)問題的前提下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明權(quán)利要求所涵蓋的范圍。實(shí)施例2 :樣品檢測(cè)
(1)在包被固定有能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體的酶標(biāo)板上加入待檢測(cè)樣品或sTREM-Ι標(biāo)準(zhǔn)抗原IOOul/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)；
(2)去除步驟I中反應(yīng)液體，用洗滌緩沖液洗滌3次；加入200ng/mlHRP標(biāo)記的sTREM-Ι檢測(cè)抗體50-200ul/孔，37 °C反應(yīng)30分鐘，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與 sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)；
(3)去掉sTREM-Ι檢測(cè)抗體溶液；用洗滌緩沖液洗滌5次；每孔加入IOOul顯色底物室溫反應(yīng)10分鐘，然后每孔加入IM HCL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀數(shù)分析。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，按照上述方法檢測(cè)樣品中的sTERM-Ι具有良好的效果，當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整包被反應(yīng)的時(shí)間、洗滌時(shí)間和中止時(shí)間，已經(jīng)所用各溶液的濃度，在能夠保證解決本發(fā)明技術(shù)問題的前提下，也應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明權(quán)利要求所涵蓋的范圍。需要說明的是，在本發(fā)明實(shí)施例中，所用樣品收集自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、廣州市胸科醫(yī)院和、中山一院，共計(jì)280例臨床樣本,均為臨床上確診為急性肺炎感染的樣品；另外健康對(duì)照組30例，來自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心，沒有臨床癥狀，經(jīng)體檢無異常。全部標(biāo)本均米用肘中靜脈米血,37°C靜置2h,分尚血清后-20°C保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。另外，對(duì)于本發(fā)明實(shí)施例中所采用的重要試劑和樣品，其來源或者配置方法如下
捕獲抗體為鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體，購(gòu)買自invitrogen公司，生產(chǎn)批號(hào)201112035-7，檢測(cè)抗體為兔抗人sTERM-Ι多克隆抗體，生產(chǎn)批號(hào)MQ20113025。當(dāng)然在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，再能夠解決本發(fā)明技術(shù)問題的前提下，采用其他種類的單克隆sTERM-1抗體和多克隆sTERM-Ι抗體應(yīng)當(dāng)理解為屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。洗滌緩沖液為每升中含有如下成分的溶液
KH2P04O. 2g
Na2HP04. 12H202. 9g
Nacl8. Og
KCLO. 2g
Tween-200. 5ml
用去離子無菌水溶解，pH值7. 4，2-8°C保存，在試劑盒中裝為20X洗滌緩沖液的濃縮液，使用時(shí)直接稀釋皆可。另外，檢測(cè)劑包括顯色底物液A、底物液B及終止液，其中 顯色底物液A為每升中含有如下成分的溶液
Na2HP04 (12H20) 36.82g 檸檬酸10. 21g
過氧化脲O. 6g用去離子無菌水溶解，pH值7. 4，2-8°C保存。顯色底物液B為每升中含有如下成分的溶液
EDTAO.146g
朽1檬酸I. 05g
TMBO. 25g
DMSO5ml 在使用過程中，顯色底物液A與顯色底物液B按體積1:1混合成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。通過采用本發(fā)明的方法和試劑盒檢測(cè)收集的280例臨床陽性樣本，和50例陰性樣品的檢測(cè)試驗(yàn)可以得出，上述實(shí)施中所公開的方法和試劑盒最低檢測(cè)限為O. 2ng/ml，靈敏度極高；而且陽性標(biāo)本檢測(cè)的中共檢出269，陽性標(biāo)本檢測(cè)準(zhǔn)去率高達(dá)96%，而50例陰性樣品中均未檢測(cè)出含有sTERM-1，因此本發(fā)明的試劑盒具有非常好的準(zhǔn)確性；另外，本法采用雙位點(diǎn)一步法ELISA進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，操作步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，并能降低了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的差異性。應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種sTERM-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括(I)酶標(biāo)板和檢測(cè)抗體，所述酶標(biāo)板上包被固定有能與sTERM-1發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-1或者與sTERM-1同捕獲抗體發(fā)生抗原_抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原_抗體反應(yīng)；(2)反應(yīng)劑和檢測(cè)劑，用于通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)待測(cè)樣品中sTERM-1存在以否的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體為鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體為兔抗人sTERM-Ι多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)劑包括分開包裝的陽性對(duì)照液、陰性對(duì)照液、20倍濃縮洗滌液，樣品緩沖液；所述檢測(cè)劑包括顯色底物液A、底物液B及終止液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)抗體通過HRP-偶聯(lián)緩沖液標(biāo)記有辣根過氧化物酶，所述HRP-偶聯(lián)緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液 Tris6.05g， Nacl8.4g， 鹿糖20g , BSA10g, CaCl2IOOmg, EDTAO.374g, 苯酹0. lg, 硫柳汞O. Olg。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述捕獲抗體通過包被緩沖液固定于所述酶標(biāo)板的檢測(cè)孔中，所述包被緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液 NaCl 43. 25g, Na2HP04 7.65g, NaH2P04 I. 3g ； 在進(jìn)行包被處理后，每孔加入100-200 μ L牛血清白蛋白溶液洗滌2-4次，所述牛血清白蛋白溶液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液NaHPO4. 12 H2O 3. 72g, KH2PO40.43g, NaCl6. 8g ； 再向每孔中加入200-300μ L的封閉液進(jìn)行封閉處理，所述封閉液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液 BSAIOg, 鹿糖20g, 硫柳汞O. Olg。
7.—種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在酶標(biāo)板上每孔加入100ul5ug/ml/s的捕獲抗體,4°C包被反應(yīng)過夜,所述捕獲抗體能與sTERM-1發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體； (2)去掉包被緩沖液，每孔加入100-200μ L牛血清白蛋白溶液洗滌2-4次，所述牛血清白蛋白溶液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液NaHPO4. 12 H2O 3. 72g, KH2PO40.43g, NaCl6. 8g ； 再向每孔中加入200-300 μ L的封閉液進(jìn)行封閉反應(yīng)1-3小時(shí)，所述封閉液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液 BSAIOg, 鹿糖20g, 硫柳汞O. Olg。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于還包括通過HRP-偶聯(lián)緩沖液在檢測(cè)抗體上標(biāo)記有辣根過氧化物酶，檢測(cè)抗體上標(biāo)記辣根過氧化物酶，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-Ι或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，所述HRP-偶聯(lián)緩沖液為每升中含有如下物質(zhì)的溶液 Tris6.05g， Nacl8.4g， 鹿糖20g , BSA10g, CaCl2IOOmg, EDTAO. 374g, 苯酹O. lg, 硫柳汞O. Olg。
9.一種sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)在包被固定有能與sTERM-Ι發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體的酶標(biāo)板上加入待檢測(cè)樣品或sTREM-Ι標(biāo)準(zhǔn)抗原50-100ul/孔，37°C反應(yīng)0. 5-1. 5小時(shí)； (2)去除步驟I中反應(yīng)液體，用洗滌緩沖液洗滌2-4次；加入200ng/mlHRP標(biāo)記的sTREM-Ι檢測(cè)抗體50-200ul/孔，37°C反應(yīng)20-40分鐘，所述檢測(cè)抗體能與sTERM_l或者與sTERM-Ι同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)； (3)去掉sTREM-Ι檢測(cè)抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌3-5次；每孔加入IOOul顯色底物室溫反應(yīng)10分鐘，然后每孔加入IM HCL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀數(shù)分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的sTERM-Ι酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述捕獲抗體為鼠抗人sTERM-Ι單克隆抗體；所述捕獲抗體為兔抗人sTERM-Ι多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種sTERM-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括(1)酶標(biāo)板和檢測(cè)抗體，所述酶標(biāo)板上包被固定有能與sTERM-1發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的捕獲抗體，所述檢測(cè)抗體能與sTERM-1或者與sTERM-1同捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)后的結(jié)合體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)；(2)反應(yīng)劑和檢測(cè)劑，用于通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)待測(cè)樣品中sTERM-1存在以否的物質(zhì)。本發(fā)明的方案步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，降低了重復(fù)實(shí)驗(yàn)的差異性，適合臨床檢測(cè)的應(yīng)用，對(duì)多種疾病尤其是急性肺炎的預(yù)防和診療有極大的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102636645SQ201210121658
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者劉明, 徐軍發(fā) 申請(qǐng)人:廣州吉賽生物科技有限公司