專利名稱：利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測核酸序列的方法及產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測核酸序列的方法，特別是涉及一種利用非共軛熒光共聚物與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA通過靜電作用形成新型的分子探針來檢測目標(biāo)DNA的方法，屬于功能高分子技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
功能高分子在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是熒光高分子在分析、檢測生物大分子方面的研究已引起國內(nèi)外科學(xué)工作者的密切關(guān)注，此研究方向也是國際上前沿科學(xué)的研究熱點(diǎn)。一些小分子熒光染料如吖啶、菲啶類染料、菁類染料、熒光素和羅丹明類染料、噻嗪和噁嗪類染料等是目前應(yīng)用較廣的核酸熒光探針，這些簡單的熒光染料對核酸分子的序列不能特異識別，屬于非特異性的小分子探針。為了克服上述不足，科學(xué)工作者將熒光基團(tuán)通過共價鍵連結(jié)到單鏈寡聚核酸分子上，例如Saito、Hrdlicka等人分別設(shè)計了一種芘標(biāo)記到核酸上的線性熒光探針，發(fā)現(xiàn)這種熒光標(biāo)記的分子探針與堿基序列互補(bǔ)的核酸分子通過Watson-Crick堿基配對法則形成雜化復(fù)鏈,祀向雜化前后的突光性能發(fā)生重大變化，從而實(shí)現(xiàn)了熒光探針特異性識別核酸分子(J. Am. Chem. Soc.，2004, 126，4820 ；Chem.Commun. , 2010, 46, 4929)。Wang等人也設(shè)計了一種花標(biāo)記HNA及RNA線性探針，發(fā)現(xiàn)革巴向雜化后芘單體的熒光強(qiáng)度增加而激基復(fù)合物的熒光強(qiáng)度劇烈下降，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的檢測(ChemBioChem.，2009，10，1175)。然而相對于線性的分子探針，它是一種莖端有一對熒光基團(tuán)和淬滅集團(tuán)修飾的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的分子探針，也稱為分子信標(biāo)，具有一些關(guān)鍵的優(yōu)點(diǎn)提高錯配目標(biāo)的熱識別及降低假陽性信號的風(fēng)險。因而在生物研究領(lǐng)域受到更為廣泛的關(guān)注。Tan等人在分子信標(biāo)的設(shè)計及應(yīng)用方面做出了很多杰出的成果，包括生物傳感器的設(shè)計、核酸的檢測及生命系統(tǒng)的監(jiān)測等等(J. Am. Chem. Soc.，2008, 130, 8351. ；Angew.Chem. , 2001, 113, 416;Angew. Chem. Int. Ed. , 2001, 40, 402. ；Anal. Chem. , 2005, 77, 4713)。然而，研究結(jié)果表明標(biāo)記型熒光探針檢測核酸分子的缺點(diǎn)在于熒光基團(tuán)的引入會降低熒光探針與靶向分子雜化雙鏈的熱穩(wěn)定性，從而會降低熒光探針的檢測精度；標(biāo)記型熒光探針需要將熒光基團(tuán)通過共價鍵連結(jié)到寡聚核酸分子鏈上以實(shí)現(xiàn)特異性識別核酸分子，而其中的合成與操作較繁雜。近幾年，水溶性的熒光共軛聚電解質(zhì)作為非標(biāo)記性的熒光探針熒光在生物傳感應(yīng)用領(lǐng)域上得到越來越多的研究者的親睞。He等人報道了一種用共軛聚電解質(zhì)制備的非標(biāo)記型的多路復(fù)用的DNA探針來檢測DNA雜交時信號的轉(zhuǎn)輸(J. Am. Chem.Soc.，2009, 131，3432)。Bazan等人通過用一種水溶性的陽離子共軛聚電解質(zhì)設(shè)計均質(zhì)的熒光探針(Chem. Mater.，2004, 16，4467)。王樹等人也報道了一種充分利用分子信標(biāo)在錯配識別的優(yōu)勢及共軛聚電解質(zhì)較高的量子產(chǎn)率的性質(zhì)而制備的檢測DNA的分子探針，以及還報道了用包含有共軛聚電解質(zhì)的熒光膠束檢測DNA和酶等等(Langmuir.，2008, 24，12138 ；Langmuir.，2009，25，13737 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2009，48，5316)。這些熒光共軛聚電解質(zhì)可通過靜電作用與生物大分子結(jié)合，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET或電子轉(zhuǎn)移、分析物誘導(dǎo)熒光高分子聚集態(tài)結(jié)構(gòu)變化、分析物誘導(dǎo)熒光高分子構(gòu)象變化等可導(dǎo)致這種熒光高分子的光學(xué)性能改變，進(jìn)而對生物大分子進(jìn)行檢測。雖然共軛聚電解質(zhì)有廣泛地應(yīng)用為生物傳感器的材料，但非共軛熒光聚電解質(zhì)作為生物傳感器材料尚未見報道。本專利發(fā)明了一種新的非標(biāo)記的熒光聚電解質(zhì)，將其通過靜電作用與DNA形成一種新型的非標(biāo)記的熒光探針，這種熒光聚合物克服了小分子熒光探針的非特異性識別及標(biāo)記性熒光探針的制備繁雜等缺點(diǎn)，為生物大分子的檢測開辟了一種新的測試方法。申請人:申請的專利名稱為一種利用丙烯酸芘甲酯制備水溶性共聚物的方法，申請?zhí)?01110430560. 7的專利申請，公開了未質(zhì)子化之前的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的合成方法，本申請在此全文引用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種合成方法簡單，且含有突光量子產(chǎn)率較高的花突光基團(tuán)的非共軛聚電解質(zhì)，通過靜電作用結(jié)合直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA形成新型的分子探針來 檢測目標(biāo)DNA的方法。本發(fā)明特點(diǎn)在于利用非共軛聚電解質(zhì)與DNA結(jié)合，形成新型的分子探針，該非共軛聚電解質(zhì)合成路線簡單易行，所合成的聚合物的側(cè)鏈上引入了熒光量子產(chǎn)率較高的且對周圍環(huán)境有很強(qiáng)的敏感性的芘熒光基團(tuán)和親水性的胺基基團(tuán)，使該聚電解質(zhì)能很好地應(yīng)用于生物等方面的檢測。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物經(jīng)鹵代烷質(zhì)子化制成帶正電荷的含芘熒光基團(tuán)的聚電解質(zhì)，并將這種聚電解質(zhì)與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA作用形成新型熒光探針來檢測目標(biāo)DNA。一種用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測核酸序列的方法，按照下述步驟進(jìn)行( I)共聚物質(zhì)子化的反應(yīng)將聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物和適量的碘甲烷按物質(zhì)的量為1:3溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃中,在常溫下反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后,將溶劑四氫呋喃過濾掉，然后再用索氏提取器提取產(chǎn)物，其中提取劑為四氫呋喃，提取時間為12小時，最后再將最終的熒光聚電解質(zhì)在真空干燥箱中以70°C溫度干燥12小時，合成路線如圖I所示。(2)新型熒光分子探針的配制用緩沖溶液PBS (10Mm，pH=7.4)將(I)中制得聚電解質(zhì)稀釋制成原溶液，同樣，分別用緩沖溶液PBS( IOMm, pH=7. 4)將直鏈結(jié)構(gòu)的單鏈DNAl或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA2溶解，最后，再取適當(dāng)?shù)木垭娊赓|(zhì)溶液與DNAl或者DNA2溶液混合，通過靜電作用行成新型的直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光分子探針。(3) DNA雜交樣品的配制用緩沖溶液PBS (10Mm，pH=7. 4)稀釋不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt。其中DNA3與DNAl完全互補(bǔ)配對，與DNAa，DNAc7DNAt完全不互補(bǔ)；DNA1與DNA2部分互補(bǔ)配對，與DNAa, DNAc, DNAt完全不互補(bǔ)。分別取一定量溶解好的DNA3，DNAa, DNAc, DNAt加入(2)中配好的熒光探針樣品溶液中，最后將配好的所有溶液經(jīng)過5min的90°C的熱處理，再在40°C下保溫半小時。所述的步驟(I)所合成的聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯聚電解質(zhì)結(jié)構(gòu)為
權(quán)利要求
1.一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測核酸序列的方法，所述的方法步驟包括 (1)共聚物的質(zhì)子化 將聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃中，在常溫下反應(yīng)24小時；反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑四氫呋喃過濾掉，然后再用索氏提取器提取產(chǎn)物，其中提取劑為四氫呋喃，提取時間為12小時，最后再將熒光聚電解質(zhì)P (DMAEMA+-C0-Py)在真空干燥箱中以70°C溫度干燥12小時； (2)新型熒光分子探針的配制 用緩沖溶液PBS 10Mm, pH=7. 4，將(I)中制得聚電解質(zhì)稀釋制成原溶液，同樣，分別用緩沖溶液PBS 10Mm, pH=7. 4，將直鏈結(jié)構(gòu)的單鏈DNAl或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA2溶解，最后，再取適當(dāng)?shù)木垭娊赓|(zhì)溶液與DNAl或者DNA2溶液混合，通過靜電作用行成新型的直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光分子探針； (3)DNA雜交樣品的配制 用緩沖溶液PBS 10Mm, pH=7. 4，稀釋不同序列的DNA3，DNAa, DNAc, DNAt ;其中DNA3與DNAl完全互補(bǔ)配對，與DNAa，DNAc，DNAt完全不互補(bǔ)；DNA1與DNA2部分互補(bǔ)配對，與DNAa，DNAc, DNAt完全不互補(bǔ)；分別取一定量溶解好的DNA3，DNAa, DNAc, DNAt加入(2)中配好的熒光探針樣品溶液中，最后將配好的所有溶液經(jīng)過5分鐘的90°C的熱處理，再在40°C下保溫半小時。
2.按照權(quán)利要求I所述的的方法，其特征在于所述的步驟(I)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物含有熒光量子產(chǎn)率較高的芘熒光基團(tuán)，使合成的聚電解質(zhì)具有熒光性。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的步驟(I)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物含有水溶性的胺基基團(tuán)。
4.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的步驟(I)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物與鹵代烷R-Br或R-I等，溶于有機(jī)溶劑四氫呋喃，將共聚物質(zhì)子化，增強(qiáng)了共聚物的水溶性，其中熒光共聚物與鹵代烷的物質(zhì)量之比1:廣1:10。
5.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的步驟(4)所用的緩沖溶液為PBSIOMm, pH=7. 4，所用的DNA可以為直鏈結(jié)構(gòu)或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)如DNAl 5 , -GCA CAT ACATTCTACTTG-3' ;DNA2 :5’-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3' ；DNA3 5/ -CGTGTA TGT AAGATG AAC-3' ；DNAa 5/ -AAA AAA AAA AAAAAAAAA-3' ；DNAc 5/ -CCC CCC CCC CCC CCCCCC-3' ；DNAt 5/ -ττττττ nr TTT TTT TTT-3'，其中 DNA2 是發(fā)卡結(jié)構(gòu)的，DNA1、DNA3、DNAa,DNAc和DNAt是直鏈結(jié)構(gòu)，并且DNA2與DNAl部分互補(bǔ)，與DNAa，DNAc，DNAt完全不互補(bǔ)，DNAl與DNA3完全互補(bǔ)，與DNAa，DNAc, DNAt完全不互補(bǔ)。
6.按照權(quán)利要求I的方法合成的最終產(chǎn)物，其特征在于合成的最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物檢測核酸序列的方法，屬于功能高分子領(lǐng)域。該方法的過程包括將聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯熒光共聚物經(jīng)鹵代烷質(zhì)子化制成帶有正電荷的聚電解質(zhì)，并將這種聚電解質(zhì)與直鏈或者發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA作用形成新型熒光探針來檢測目標(biāo)DNA的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于是一種制備簡單、操作簡易、行之有效的新型熒光探針，將為穩(wěn)定、高效、特異性識別核酸分子開辟一種新途徑并在揭示疾病與基因變異等方面具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
文檔編號G01N21/64GK102936620SQ201210245799
公開日2013年2月20日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者王國杰, 楊領(lǐng)葉, 趙敏, 董杰, 張瑞辰 申請人:北京科技大學(xué)