檢測t-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有：包被有T-2毒素偶聯(lián)抗原的酶標板，T-2毒素標準品溶液，濃縮酶結合物，酶結合物工作液，底物顯色液，終止液。本發(fā)明還公開了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣本中T-2毒素的方法，它包括：首先進行樣本前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測飼料（原料、配合料和濃縮料）樣本中T-2毒素的殘留量，其操作簡便、成本低、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
【專利說明】檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫試劑盒，其適用于飼料(原料、配合料、濃縮料)中T-2毒素測定。
技術背景
[0002]T-2毒素(T-2 toxin)是鐮刀菌所產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素中毒性最強的一種，能導致動物產(chǎn)生中毒反應的次級代謝物質，它廣泛分布于自然界，常在被污染的田間作物和庫存谷物中發(fā)現(xiàn)。無論飼料中T-2毒素的含量是高水平還是低水平均會導致動物采食量下降、增重緩慢、免疫系統(tǒng)損傷等。研究表明，T-2毒素對人和動物表現(xiàn)出基因毒性、免疫毒性、血液毒性等多種毒性，并可致多種細胞凋亡。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在日內瓦召開的聯(lián)席會議上，把T-2毒素同黃曲霉毒素一樣作為自然存在的最危險的食品污染源。
[0003]T-2毒素的測定方法主要有薄層色譜法(TCL)、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、放射性免疫檢測法、酶聯(lián)免疫法等，TLC法是最早最常用的檢測方法之一，具有操作簡單、費用低廉、分離效果好、分離速度快等優(yōu)點，是一種常見的檢測方法，但是還存在樣品提純繁瑣、定量不夠精確、成本較高等缺點，而且同時TLC法涉及到一個可視化顏色定量的問題，還是不如氣相色譜和液相色譜方便、準確。氣相色譜和液相色譜分析方法需要對T-2毒素進行衍生化處理；液相色譜-質譜聯(lián)用靈敏度較高，不需要進行衍生化處理，因而液相色譜-質譜聯(lián)用是檢測T-2毒素比較理想的方法。目前報道比較多的方法為單極質譜選擇離子技術(SIM)。然而，對于復雜基質樣品(如谷物)，采用多級串聯(lián)質譜技術可以更為有效地去除基質的干擾，保證痕量物質分析的準確性。TCL法、色譜法等有的太復雜，有的缺乏靈敏度，有的價格昂貴，不適于常規(guī)毒素分析。免疫學檢測因其靈敏、快速、簡單，而被用于T-2毒素的測定。應用于T-2毒素測定的免疫學方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法及免疫熒光法等。由于放射性同位素儲存、使用不便，近年來非放射性標記應用較多。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、成本低等優(yōu)點已被我國于1992年定為檢測標準，ELISA法作為一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大量樣品的快速篩選。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于T-2毒素含量測定的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單，適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。
[0005]本發(fā)明試劑盒，它包括:
[0006]( I)包被有T-2毒素偶聯(lián)抗原的酶標板；
[0007](2) T-2毒素標準品溶液；
[0008](3)濃縮酶結合物；
[0009](4)酶結合物稀釋液；[0010](5)底物顯色液；
[0011](6)終止液。
[0012]所述T-2毒素偶聯(lián)抗原為T-2毒素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清白蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。
[0013]所述T-2毒素半抗原的結構如下:
[0014]
【權利要求】
1.一種檢測T-2毒素的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于包括有: (1)包被有T-2毒素偶聯(lián)抗原的酶標板； (2)T-2毒素標準品溶液； (3)濃縮酶結合物； (4)酶結合物稀釋液； (5)底物顯色液； (6)終止液。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述T-2毒素偶聯(lián)抗原是由T-2毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述T-2毒素半抗原結構如下:
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述T-2毒素半抗原的制備方法主要包括如下步驟: 24mg T-2毒素、30mg鄰苯二甲酸酐和0.1ml吡啶在2ml DMSO中的混合液，在80°C下攪拌反應15小時，蒸除溶劑，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單T-2毒素酯。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的濃縮酶結合物為酶標記的T-2毒素單克隆抗體。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮酶結合物的標記酶為辣根過氧化物酶；酶結合物是采用過碘酸鈉法將標記酶與抗體偶聯(lián)得到。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的終止液為f2mol/L的硫酸或鹽酸溶液，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，底物液A液為過氧化脲溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所用包被緩沖液為ρΗ9.(T9.6,0.2mol/L碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為PH7.2~?.4,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。
8.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶結合物稀釋液為PH7.1~?.4，含0.05%~0.1%牛血清白蛋白，0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量百分比。
9.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述T-2毒素標準品溶液濃度分別為O μ g/L、I μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/L、27 μ g/L、81 μ g/L。
10.一種檢測樣品中T-2毒素含量的方法，主要步驟包括:1)將待測樣品進行前處理；2)用權利要求1-9任一項所述的酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測；3)分析檢測 結果。
【文檔編號】G01N33/577GK103575885SQ201210250807
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月19日 優(yōu)先權日:2012年7月19日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 羅曉琴, 馮靜, 郝士元, 齊向武, 聶雯瑩, 馬臘臘 申請人:北京勤邦生物技術有限公司