專利名稱：一種脂蛋白(a)檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人脂蛋白(a)的檢測試劑盒。
背景技術：
脂蛋白(a)是一種富含膽固醇的脂蛋白，核心部分為中性脂質(zhì)和apoB-100分子，其外圍包繞著親水性的apo (a), 二者以二硫鍵共價連接；其中apo (a)是脂蛋白(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一種稱為Kringle的特征性結構構成，Kringle由80 114個氨基酸殘基組成，依靠三個內(nèi)部二硫鍵穩(wěn)定。脂蛋白(a)主要在肝臟合成后分泌入血，血漿脂蛋白(a)濃度主要取決于脂蛋白
(a)的合成速率，而與分解速率基本無關。研究表明血栓閉塞性脈管炎病人，發(fā)現(xiàn)其血漿中脂蛋白(a)濃度均升高。認為脂蛋白(a)增強了 ICAM-I的mRNA的表達以及ICAM-I在細胞表面的表達，從而促進白細胞(特別是單核細胞)對血管內(nèi)皮的粘附性及向血管內(nèi)皮的轉移，在動脈粥樣硬化的早期和炎性心血管疾病兩方面均起重要作用。此外，研究認為，高水平血清脂蛋白(a)濃度作為腦血管疾病的危險因素，不僅與其致動脈硬化和抗纖溶作用有關，而且可能與其降低紅細胞膜脂流動性和變形性有關。脂蛋白(a)能夠影響腎小球的血流動力學，加速腎臟疾病的進展。許多腎臟疾病腎小球內(nèi)脂蛋白(a)的沉積，且沉積的程度與腎小球硬化的程度相關。至于脂蛋白(a)是如何沉積的卻未明確。作為一個具有脂質(zhì)毒性的脂蛋白，脂蛋白(a)在腎小球硬化中應用具有一定的致病作用。在糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)脂蛋白(a)血清水平明顯高于一般人群，脂蛋白(a)水平的升高是糖尿病并發(fā)微血管病變、冠心病的一個重要因素，其作用方式與脂蛋白(a)致動脈粥樣硬化相似。也有報道，2型糖尿病患者血清脂蛋白(a)的升高可能通過激活血小板活化途徑參與糖尿病血管病變的發(fā)生及發(fā)展。另外，在肝病患者如原發(fā)膽汁性肝硬化患者中未發(fā)現(xiàn)有脂蛋白(a)濃度的改變。在子宮內(nèi)膜異位的女性患者中發(fā)現(xiàn)有脂蛋白(a)水平升高，研究表明性激素對脂蛋白(a)血清濃度有影響。目前已知的測定脂蛋白(a)的方法有放射免疫測定法、熒光免疫測定法、時間分辨熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法。這些方法具有操作繁瑣、耗時長、過度浪費資源的缺點，不適于常規(guī)檢驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂蛋白(a)的檢測試劑盒。該試劑盒可直接應用于全自動生化分析儀上，結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為、試劑Rl :緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；
試劑R2 :緩沖液、結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下
(a)按下列比例配制好試劑
試劑Rl
Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
疊氮鈉1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200-220mmol/L
結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v)
吐溫-20l-5mmol/L
疊氮鈉0. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應；
(c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值；
(d)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中脂蛋白(a)的濃度。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明局限于此。實施例I :
本發(fā)明的試劑盒舉例是雙試劑，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,、 疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。
實施例2 :試劑盒使用方法。I.試劑準備，試劑為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑Rl
Tris 緩沖液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩沖液 200mmol/L
結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自動生化儀參數(shù)設置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為600nm;副波長為700 nm ；
(c)反應時間8分鐘，其中，溫育時間5分鐘，反應時間40秒，檢測時間5分鐘。3.檢測步驟(全部在全自動生化分析儀中完成)
(a)取255ii L試劑I和3 ii L血清樣本混勻；
(b)將混勻后的溶液在37°C溫育5分鐘；
(c)添加85iiL試劑2，反應40秒后，在600nm條件下讀取吸光度Al，再反應5分鐘后，讀取吸光度A2。4.通過讀取的連詞吸光度值的計算出脂蛋白(a)的濃度。本發(fā)明具有的優(yōu)點
該試劑盒結果準確性強、試劑穩(wěn)定性好、使用方便、便于大規(guī)模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫(yī)院和檢測中心普遍使用。權利要求
1.一種脂蛋白(a)檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2，其中 a、試劑Rl 包括200-220mmol/L Tris 緩沖液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、試劑R2:200-220mmol/L Tris緩沖液、結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子、l_5mmol/L 吐溫 _20、0. 5-3 mmol/L 疊氣納、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸納、l-5mmol/L 牛血清白蛋白。
2.權利要求I的試劑盒，其特征在于試劑R2中的脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子的制備方法為10. 5mg/ml的脂蛋白(a)單克隆抗體與10%的乳膠顆粒(直徑50_100nm),加入到200-220mmol/L Tris緩沖液中，震蕩反應4小時，離心去上清，再用200-220mmol/LTris緩沖液稀釋至0. 5%，并加入0. 1-0. 3 mmol/L疊氮鈉。
3.上述試劑盒的制備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配制好試劑試劑Rl Tris 緩沖液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 疊氮鈉1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; 試劑R2 Tris 緩沖液 200-220mmol/L 結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子 3. 5-5% (v/v) 吐溫-20l-5mmol/L 疊氮鈉0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應； (c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值； (d)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中脂蛋白(a)的濃度。
4.權利要求3的方法，其特征在于，被測樣品與試劑比例應控制在I:105到I :125之間。
5.權利要求3的方法，其特征在于，反應溫度為37(±1) °C。
6.權利要求3的方法，其特征在于，反應時間為8-12分鐘。
7.權利要求3的方法，其特征在于，用半/全自動生化分析儀檢測的主波長為600nm，副波長為700 nm。
全文摘要
一種脂蛋白(a)的檢測試劑盒。試劑盒盒體內(nèi)包括試劑R1緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；試劑R2緩沖液、結合有脂蛋白(a)單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列反應，再將反應物置于半/全自動生化分析儀下，檢測主波長600nm處吸光度變化的速度，從而測算出脂蛋白(a)的濃度大小。本試劑盒具有準確、穩(wěn)定、方便的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102749459SQ201210262100
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權日2012年7月27日
發(fā)明者張雷 申請人:北京恩濟和生物科技有限公司