專利名稱：：載脂蛋白e4elisa試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種定量檢測人血清、血液或腦脊液中載脂蛋白E4酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：載脂蛋白(ApoE)為由299個(gè)已知序列氨基酸構(gòu)成的單鏈蛋白，分子量為34.2kDa，是人血漿蛋白中主要脂蛋白如乳糜微滴、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等組成部分，由肝、腦及其它器官組織合成。ApoE參與甘油三脂--膽固醇在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)代謝，在脂蛋白代謝中起重要作用。ApoE還參與體內(nèi)脂代謝過程中幾種和酶蛋白活性的調(diào)節(jié)(MahleyRW，RallSCJr,2000,ApolipoproteinE:farmorethanalipidtransportprotein,AnnuRevGenomicsHumanGenet,1:507-537)。ApoE的基因編碼定位在第19染色體的長臂(19ql3.32)上含多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，基因的2059(T/C)及2197(C/T)位置處的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)型(single-nucleotidepolymorphisms,SNPs)確定了ApoE的三個(gè)常見異構(gòu)型ApoE2，ApoE3，ApoE4，確定途徑是基因的編碼子編碼成熟蛋白的112及158位點(diǎn)處的氨基酸。2059-T等位基因確定112位點(diǎn)處的半胱氨酸(Cysll2),2059-C等位基因確定同一位點(diǎn)的精氨酸(Argll2);2197-C等位基因確定158位點(diǎn)處的精氨酸(Argl58),2197-T等位基因確定該位點(diǎn)處的半胱氨酸(Cysl58)。人群中分布最廣的是ApoE3異構(gòu)型(Cysll2/Argl58);分布稀少的ApoE2異構(gòu)型(Cysll2/Cys158)使個(gè)體中的ApoE受體的親和性下降，易患高血脂癥。分布少的ApoE4異構(gòu)型(Argll2/Arg158)因增加個(gè)體體內(nèi)極低密度脂蛋白(VLDL)的肝臟合成，故提高了阿爾茨海默癥(Alzheimer，sdisease,AD)和其他神經(jīng)類疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性(PantelidisPetal,2003，Simplesequence-specific隱primer-PCRmethodtoidentifythethreemainapolipoproteinEhaplotypes,ClinChem,49:1945-1948)。人體組織液中存在由這三種異構(gòu)體組成的六種不同表型，即E2/E2，E3/E3、E4/E4三種純合子和E2/E3，E3/E4，E2/E4三種雜合子(RailSC，WeisgraberKH,MahleyRW，1982，HumanapolipoproteinE:thecompleteaminoacidsequence,JBiolChem，257:4171—4178)。血液和腦脊液中ApoE4基因型及基因劑量可直接作為AD，精神抑郁癥，帕金森氏病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患病危險(xiǎn)性的臨床輔助診斷指標(biāo)(DavignonJ,GreggR，SingC，1998，ApolipoproteinEpolymorphismandatherosclerosis,Arteriosclerosis,8:1-21)。測定人組織液中ApoE4基因型及基因劑量的方法有等位點(diǎn)聚焦電泳(KaneJW,GowlandE,1986，AmethodfortheidentificationofapolipoproteinEisoformsemployingchemicalprecipitationandflatbedisoelectricfocusinginagarose,AnnClinBiochem,23:509-513)，DNA測序(ParkerSetal，1993ApplicationofdenaturinggradientgelelectrophoresistodetecetDNAsequencedifferencesencodingapolipoproteinEisoforms,Genomics,16:245-247),RT-PCR(BemardPSetal,1999，ColormultiplexinghybridizationprobesusingtheapolipoproteinElocusasamodelsystemforgenotyping,AnalBiochem,273:221-228)等，這些科研測定方法要求的技術(shù)較強(qiáng)，難以在臨床診斷中推廣。ELISA方法經(jīng)20多年來技術(shù)的不斷完善，如抗原、抗體的生產(chǎn)、分離純化；酶標(biāo)記抗體的制備、純化，酶底物顯色(或熒光、化學(xué)發(fā)光)系統(tǒng)的改進(jìn)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，在體外臨床診斷中使用方便、快速(UchidaYetal,2000，SandwichELISAformeasurementofApoE4levelsinserumandtheestimationoftheallelicstatusofApoE4isoforms,JClinLabAnal,l4:260-264)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用方便、快速的定量檢測人血清、血漿或腦脊液中的載脂蛋白E4濃度的ELISA試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的載脂蛋白E4(ApolipoproteinE4，ApoE4)ELISA試劑盒，其組成包括抗人ApoE4單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗體、ApoE4標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、樣品稀釋液、TMB底物顯色液、濃縮洗滌液和終止反應(yīng)液；其中酶標(biāo)記抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人ApoE多克隆抗體；TMB底物顯色液2.08mmol/L3，3'，5，5'—四甲基聯(lián)苯胺，12mmol/L過氧化氫，10mmol/L(3—環(huán)糊精，O.lmol/LpH5.0的醋酸緩沖液；樣品稀釋液10mmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1%BSA，0.05%Tween-20和lmg/L慶大霉素；濃縮洗滌液O.lmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1%胎牛血清，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；終止反應(yīng)液1.0mol/LH2SO4。載脂蛋白E4ELISA試劑盒的制備方法其中所述抗人ApoE4單克隆抗體及酶標(biāo)記抗體的制備方法是(1)抗人ApoE4單克隆抗體的制備用重組純化的人載脂蛋白E4免疫小鼠，制備特異性的抗人ApoE4單克隆抗體；(2)抗體的純化將步驟(1)中制得的抗血清，過葡萄球菌蛋白A—SeparoseCL-4B柱，濃縮、透析，得純化的抗體；(3)酶標(biāo)記抗體的制備用辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidose,HRP)標(biāo)記抗人ApoE多克隆抗體；(4)酶標(biāo)板包被用步驟(2)中所得的純化抗體包被96孔(12X8)酶標(biāo)板，并封閉、拋光。載脂蛋白E4ELISA試劑盒的使用方法，包括如下操作步驟(1)加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品到相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，使樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的載脂蛋白E4與固相載體上的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的雜蛋白和其他物質(zhì)；(2)使已結(jié)合的載脂蛋白E4與HRP標(biāo)記的抗人ApoE多克隆抗體相結(jié)合，洗去多余的酶標(biāo)抗體；(3)加入TMB酶底物顯色液，室溫孵育反應(yīng)，終止酶反應(yīng)后檢測顯色反應(yīng)的強(qiáng)度。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明建立了雙抗夾心ELISA方法間接測定樣品中的載脂蛋白E4含量，檢測靈敏度小于8.0ng/ml，劑量一反應(yīng)曲線的線性相關(guān)系數(shù)>0.980，具有靈敏、快捷、簡便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，利用本發(fā)明的試劑盒，結(jié)合測定同一樣本中載脂蛋白E的濃度，可以確定ApoE4基因型及基因劑量，為體外診斷確定ApoE4基因型及基因劑量提供了有效的手段。具體實(shí)施方法以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明的載脂蛋白E4ELISA試劑盒，其組成包括抗人ApoE4單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗體、ApoE4標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、樣品稀釋液、TMB底物顯色液、濃縮洗滌液和終止反應(yīng)液；其中酶標(biāo)記抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人ApoE多克隆抗體；TMB底物顯色液2.08mmol/L3，3'，5，5'—四甲基聯(lián)苯胺，12mmol/L過氧化氫，10mmol/L卩一環(huán)糊精，0.1mol/LpH5.0的醋酸緩沖液；樣品稀釋液10mmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1%BSA，0.05°/。Tween-20和lmg/L慶大霉素；濃縮洗滌液O.lmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1%胎牛血清，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；終止反應(yīng)液1.0mol/LH2SO4。上述的酶標(biāo)板為96孔(12條8孔或8條12孔)。載脂蛋白E4ELISA試劑盒的制備方法1.抗人ApoE4單克隆抗體的制備1.1雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)克隆和生產(chǎn)l丄l材料(1)HAT選擇培養(yǎng)液；(2)2%(W/V)甲基纖維素，用培養(yǎng)液配制；(3)A液含53.3%(V/V)FCS，2.66%(V/V)HATti備液，8X106胸腺細(xì)胞，133pg/ml用培養(yǎng)液配制的脂多糖(LPS);(4)含15%，5%，2.5%FCS(或新生牛血清)的DMEM培養(yǎng)液；(5)C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶，注射器，18號針頭，35mm和100mm直徑的培養(yǎng)平皿，24孔培養(yǎng)板，混合器等。l丄2步驟(1)將融合后的雜交瘤細(xì)胞懸浮在15mlA液中；(2)用無針頭注射器加入25ml2Q/。甲基纖維素溶液；(3)用指頭輕彈使之混合后，在混合器上混合幾秒鐘；(4)用裝有18號針頭的注射器吸lml該懸液，放入直徑35mm的培養(yǎng)平皿中，且使之均勻展開；(5)在100mm直徑的培養(yǎng)平皿內(nèi)放入2個(gè)上述小平皿和1個(gè)開口并盛有l(wèi)ml水的小平皿，然后在37"C5%(302條件下培養(yǎng)(培養(yǎng)皿中各成分的終濃度為甲基纖維素，1.25%;FCS，20%;HAT，1%;LPS，50ng/ml;胸腺細(xì)胞，3X106/ml;脾細(xì)胞，2.5X106/ml;瘤細(xì)胞，2.5X106/ml);(6)9天后開始用倒置顯微鏡檢查克隆，每2-3天觀察1次；(7)當(dāng)克隆達(dá)到0.5mm直徑以上時(shí)，用毛細(xì)滴管將其轉(zhuǎn)移到lmlHAT培養(yǎng)液的小培養(yǎng)皿內(nèi)；(8)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到5X10、10"ml時(shí)，檢査有無抗體存在，若存在則繼續(xù)下一步驟，若不存在則重復(fù)步驟(1)-(7);(9)確證得到分泌單抗的細(xì)胞克隆后，將細(xì)胞克隆移種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長良好后，再移種于組織培養(yǎng)管，最后移種于組織培養(yǎng)瓶中生長；培養(yǎng)液中血清量由15%降為5%，細(xì)胞濃度以5乂104-105為好；(10)將約20ml細(xì)胞懸液接種于800ml容量的組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，用含2.5。/。FCS或新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至50ml;在37°C10%CO2的干培養(yǎng)箱中加蓋培養(yǎng)；1-2天后，加入150ml樣品液再繼續(xù)培養(yǎng)2天或更長時(shí)間，達(dá)穩(wěn)定期后至少1天。離心收集上清培養(yǎng)液。1.2雜交瘤細(xì)胞動物體內(nèi)繁殖法生產(chǎn)單抗1.2.1材料(1)液體石蠟(或降植烷)；(2)BALB/C純系小鼠(已在15-20天前經(jīng)腹腔注射入0.5ml/鼠液體石蠟(或降植垸))；(3)PBS;(4)雜交瘤細(xì)胞(1-5X107/ml);(5)注射器，離心機(jī)等。1.2.2步驟(1)組織培養(yǎng)液中培養(yǎng)健康生長的雜交瘤細(xì)胞，至適當(dāng)繁殖后計(jì)數(shù)，400Xg離心，吸出上清；(2)收集細(xì)胞在適量PBS溶液(或無血清的培養(yǎng)液)中懸浮，計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到l-5X107/ml;(3)將細(xì)胞懸液吸到5ml注射器中，左手固定好小鼠，用右手將細(xì)胞注入其腹腔；每只小鼠注入0.5ml(含細(xì)胞1-5乂107個(gè))；(4)每天觀察注入細(xì)胞后的小鼠，通常7-10天，當(dāng)小鼠腹部明顯腫脹，象正常懷孕的母鼠時(shí)，及時(shí)采集腹水和血清；(5)左手固定小鼠，用乙醇消毒腹部皮膚后在小鼠下面放一收集試管，用消毒滅菌過的21g針頭刺入腹腔，讓腹水滴入管內(nèi)；當(dāng)液滴停止時(shí)，可輕輕移動針頭，或輕揉鼠的腹部，讓腹水繼續(xù)滴出，滴完(約收集2-5ml腹水)；(6)將小鼠采血，分離血清；(7)腹水以1500Xg離心10min，收集上清液貯存在-20。C下。2.抗體純化2.1材料(1)葡萄球菌蛋白A-SepharoseCL-4B;(2)0.4mol/LPBS，pH6.0，pH8.0;(3)0.2mol/LPB,PH3.5,pH4.5;(4)7mol/L脲；(5)注射器等。2.2步驟(1)將lg葡萄球菌蛋白A-SepharoseCL-4B浸泡懸浮在pH8.0的PBS中，脫氣后裝柱；(2)將樣品(約4ml腹水或200ml無血清培養(yǎng)液對pH8.0的PBS透析平衡);(3)將透析平衡后的樣品液加入色譜柱中，流速為0.5-1.0ml/min;(4)用pH6.0的PBS洗脫IgGl;用pH4.5的PB洗脫IgG2a;用pH3.5的PB洗脫IgG2b。流速均為lml/min;(5)用收集管分別收集各組洗脫液，并用A28o^監(jiān)測洗脫液；將各類IgG蛋白分別合并，保存；(6)將葡萄球菌蛋白A-SepharoseCL-4B柱再生，平衡待用。3.抗體效價(jià)的測定(1)用1.0嗎/ml濃度純化的重組人ApoE4包被酶標(biāo)板，3。/。BSA溶液封閉；(2)將購得的已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)抗人ApoE4單抗(Biodesign公司)倍比稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列加入標(biāo)準(zhǔn)孔中，每孔100ul;(3)自制純化的抗體適度倍比稀釋后加入樣品孔，每孔100ul;(4)37。C下孵育30min后洗板三次，最后拍干；(5)樣品和標(biāo)準(zhǔn)孔中各自加入100plHRP—羊抗兔IgGl(l:1000,晶美生物工程公司)，37。C孵育30min，再洗板三次，拍干；(6)每孔加入TMB酶底物/顯色液100^1。室溫孵育15min;(7)每孔加入100iillmol/LH2S04終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀的450nm波長下測出各孔的吸光度值；(8)以標(biāo)準(zhǔn)品系列的各平均吸光度值對其相應(yīng)效價(jià)計(jì)算出劑量一反應(yīng)曲線，將樣品的平均吸光度值代入劑量一反應(yīng)曲線計(jì)算出自制純化的抗體效價(jià)。4.酶標(biāo)記抗體的制備4.1材料(1)辣根過氧化物酶(HRP，RZ>3.2，活性〉200U/ml);(2)>^-琥珀酰咪唑基-3-(2-吡啶二硫基)丙垸酸(SPDP);(3)抗人ApoE抗體；(4)二硫蘇糖醇(DTT);(5)PBS(0.1mol/L磷酸，0.1mol/LNaCl,0.001mol/LEDTA,0.02。/o硫柳汞，pH7.5);(6)無水乙醇；(7)SephadexG-25F凝膠柱；SephacrylS-200HR凝膠柱等。(1)溶解10mgHRP在l.Oml硼酸鹽緩沖液(O.05mol/L硼酸，0.3mol/LNaCl,0.5。/。正丁醇，pH9.0)中，攪拌下逐滴加入含150pgSPDP的無水乙醇溶(2)室溫下攪拌反應(yīng)30min后，將(1)配制的HRP溶液加入已用PBS預(yù)先平衡的SephadexG-25F柱中，然后用PBS洗脫，收集10-20ml洗脫液，4'C下避光IC存；(3)溶解25mg抗人ApoE抗體于2.5ml硼酸鹽緩沖液中，攪拌下逐滴加入30pl含185pgSPDP的無水乙醇溶液；(4)室溫下攪拌反應(yīng)30min后，抗體溶液加到用醋酸鹽緩沖液(O.lmol/L醋酸，O.lmol/LNaCl，0.001mol/LEDTA,0.02。/。硫柳汞，pH4.5)平衡好的SephadexG-25F柱中，用平衡液洗脫，收集10-12ml溶液；(5)用AmiconPM10膜將抗體衍生化溶液超濾濃縮至2.5ml，攪拌下加入0.5ml含22mgDTT的醋酸鹽緩沖液；(6)室溫下攪拌反應(yīng)30min后，將溶液加入用充氮驅(qū)氧的PBS平衡的SephadexG-25F柱中，然后用該P(yáng)BS洗脫，收集17-20ml洗脫液；(7)將上述處理過的酶溶液和抗體溶液室溫下混合反應(yīng)20小時(shí)，再用AmiconPMlO膜超濾濃縮至5ml，加入PBS(0.025mol/L磷酸，0.15mol/LNaCl，pH7.4)平衡的SephacrylS-200HR柱中，用PBS以0.5ml/min速度洗脫；(8)以2min收集lml洗脫液的速度收集洗脫液，并監(jiān)測A280nm和A403nm，決定哪些管的洗脫液是酶標(biāo)記抗體溶液；(9)合并收集的酶標(biāo)記抗體溶液，冷凍干燥后-20。C下貯存。5.酶標(biāo)板包被(1)用包被液(0.05mol/L碳酸緩沖液，pH9.6)適當(dāng)稀釋抗體溶液成10pg/ml,混勻；待包被的活化處理過的酶標(biāo)板微孔內(nèi)每孔加入100pl10ng/ml的抗體溶液；(2)酶標(biāo)板膜封后4"C下反應(yīng)過夜；(3)倒掉包被的抗體溶液，洗板，每孔加入250nl3。/。BSA封閉液，4°C下封閉過夜；(4)倒空封閉液，用洗滌液洗板4次；(5)每孔加入300jal拋光液，反應(yīng)2小時(shí)后，倒去拋光液，在紙巾上拍干；(6)將酶標(biāo)板真空干燥后，密封入帶干燥劑的金屬箔袋內(nèi)，在4"C下貯存；6.載脂蛋白E4定量檢測的ELISA系統(tǒng)建立及使用(1)酶標(biāo)板條安裝己包被的酶標(biāo)板條平衡至室溫后，開啟包裝袋，取出所需用數(shù)目的酶標(biāo)板條，牢固地安裝在酶標(biāo)板框架上。不需用的酶標(biāo)板置于包裝袋中，驅(qū)氣密封好，放在2-8"C下貯存。(2)樣品孵育①移取ioopi標(biāo)準(zhǔn)液系列和稀釋后的樣品加入到相應(yīng)的包被抗體的酶標(biāo)板孔中；空白孔中只加入100nl樣品稀釋液；②用酶標(biāo)板蓋蓋好孔，在37C下孵育45分鐘。(3)洗板吸走或倒空孔中液體，用自動洗板儀洗板，洗板4次后拍干。(4)酶標(biāo)記抗體孵育①倒酶標(biāo)記抗體溶液于容器中，用移液器每孔加入lOOpl交聯(lián)劑溶液；②蓋好酶標(biāo)板，在37'C下孵育反應(yīng)用45分鐘；如步驟(3)洗板4次。(5)底物反應(yīng)顯色每孔加入100plTMB酶底物/顯色液，輕輕晃搖30秒鐘，室溫靜置反應(yīng)15分鐘。(6)終止反應(yīng)檢測每孔加入lOOpl終止液，20分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀的450nm波長下測出每孔的吸光度值。(7)結(jié)果計(jì)算計(jì)算重復(fù)孔的平均吸光度值；以標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的平均吸光度值的對數(shù)值對相應(yīng)濃度的對數(shù)值進(jìn)行線性回歸，構(gòu)建劑量一反應(yīng)曲線；由樣品重復(fù)孔的平均吸光度值從劑量一反應(yīng)曲線計(jì)算出樣品液的ApoE4含量。實(shí)施例2實(shí)際血清樣本檢測試劑盒的分析內(nèi)精密度(CV%)和確定ApoE4基因型及基因劑量用前述載脂蛋白E4ELISA試劑盒的使用方法測定隨機(jī)抽取三份體檢的血液樣本制成血清樣品中的ApoE4濃度并計(jì)算方法的分析內(nèi)精密度(表1)和92例體檢健康者的血清樣品確定ApoE4基因型(表2)。表l.試劑盒ELISA方法的分析內(nèi)精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果提示血液中ApoE4濃度在老年體內(nèi)脂代謝障礙患者身上也有升高的趨勢，其中E4/E4基因型占NAFL組的0.8。/。、占MS+NAFL組的3.8%，而正常對照組和NFL組均為0%;E2/E4、E3/E4型占NAFL組的1.1%、占MS十NAFL組的13.3%、占NFL組的2.8"/0，而正常對照組為0%。權(quán)利要求1、載脂蛋白E4ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒的組成包括抗人ApoE4單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗體、ApoE4標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、樣品稀釋液、TMB底物顯色液、濃縮洗滌液和終止反應(yīng)液；其中酶標(biāo)記抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人ApoE多克隆抗體；TMB底物顯色液2.08mmol/L3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，12mmol/L過氧化氫，10mmol/Lβ-環(huán)糊精，0.1mol/LpH5.0的醋酸緩沖液；樣品稀釋液10mmol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L慶大霉素；濃縮洗滌液0.1mol/LpH7.4-7.6的磷酸鹽緩沖液中含有1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L慶大霉素；終止反應(yīng)液1.0mol/LH2SO4。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的載脂蛋白E4ELISA試劑盒，其特征在于所說的酶標(biāo)板為96孔。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的載脂蛋白E4ELISA試劑盒的制備方法，其中的抗人ApoE4單克隆抗體及酶標(biāo)記抗體的制備方法是(1)抗人ApoE4單克隆抗體的制備用重組純化的人載脂蛋白E4免疫小鼠，制備特異性的抗人ApoE4單克隆抗體；(2)抗體的純化將步驟(1)中制得的抗血清，過葡萄球菌蛋白A—SeparoseCL-4B柱，濃縮、透析，得純化的抗體；(3)酶標(biāo)記抗體的制備用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人ApoE多克隆抗體；(4)酶標(biāo)板包被用步驟(2)中所得的純化抗體包被96孔酶標(biāo)板，并封閉、拋光。全文摘要本發(fā)明公開了載脂蛋白E4ELISA試劑盒及其制備方法，應(yīng)用純化的人載脂蛋白E4制備抗人ApoE4抗體，親和純化后包被酶標(biāo)板。試劑盒組成包括抗人ApoE4單克隆抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記抗體、ApoE4標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉、樣品稀釋液、TMB底物顯色液、濃縮洗滌液和終止反應(yīng)液。固定在酶標(biāo)板微孔表面上的抗體捕獲標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液中的ApoE4，酶標(biāo)記抗體識別ApoE4并與之結(jié)合，形成抗體-ApoE4-抗體-酶的復(fù)合物，酶與底物反應(yīng)顯色后測出吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中ApoE4濃度。該試劑盒檢測人血清、血漿或腦脊液中載脂蛋白E4濃度，具有靈敏、快捷、簡便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為體外診斷確定ApoE4基因型及基因劑量提供了有效的手段。文檔編號G01N33/68GK101178408SQ200710157169公開日2008年5月14日申請日期2007年12月5日優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日發(fā)明者吳善東申請人:杭州浙大生科生物技術(shù)有限公司