專利名稱：一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的時(shí)間分辨熒光免疫檢測試劑盒，同時(shí)還涉及該試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食管癌是指由食管發(fā)生的惡性腫瘤，其發(fā)生往往有一個(gè)漫長的過程，也就是說不可能象感冒發(fā)熱一樣突然冒出來。一般認(rèn)為，食管癌的發(fā)生要經(jīng)過上皮不典型增生、原位癌、浸潤癌、轉(zhuǎn)移癌等階段。不典型增生和原位癌可以完全治愈。食管鱗狀上皮不典型增生是食管癌的重要癌前病變，由不典型增生到癌變一般需要幾年甚至十幾年。食管浸潤癌又稱進(jìn)展期癌，約近半的患者可以治愈，但到了轉(zhuǎn)移癌治愈的可能性較小，一般只能控制病情，因此，食管癌重在早期診斷。在早期、更加準(zhǔn)確的確診食管癌依然是治療該疾病的關(guān)鍵。目前，診斷食管癌的常用檢測指標(biāo)有SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l等幾種。在實(shí)際診斷食管癌時(shí)，一般是用SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l四種指標(biāo)綜合確診食管癌，因?yàn)樗姆N綜合的分析在特異性和敏感度上明顯高于單一指標(biāo)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)療單位用于檢測該四項(xiàng)指標(biāo)通常采用單一試劑盒，即一個(gè)試劑盒針對(duì)一種腫瘤標(biāo)記物的檢測，此種方式存在的缺點(diǎn)是:1、檢測步驟繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；2、目前四種標(biāo)記物分別采用四種單指標(biāo)試劑盒進(jìn)行檢測，然后再進(jìn)行綜合判斷，由于不同生產(chǎn)廠家的試劑盒存在差異，且同一廠家的不同試劑盒由于檢測的標(biāo)記物不同可能會(huì)存在控制條件、參數(shù)的差異而導(dǎo)致檢測結(jié)果存在誤差，此種誤差在綜合分析四種標(biāo)記物的特異性和敏感性上會(huì)產(chǎn)生較大的影響，可能導(dǎo)致判斷結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。因此，開發(fā)一種能夠在相對(duì)同一的檢測條件下同時(shí)檢測該四種食管癌腫瘤標(biāo)記物的試劑盒，就能降低由于人為原因造成的檢測誤差，大大提高綜合分析檢測結(jié)果的特異性和敏感性，為下一步的研究或判斷做出準(zhǔn)確的結(jié)論提供更充分的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的時(shí)間分辨熒光免疫檢測試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供一種該試劑盒的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，把四種食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l綜合在同一微孔的同一反應(yīng)體系內(nèi)，采用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測，該試劑盒包括:分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21_l、Tb3+標(biāo)記的抗CA199、Sm3+標(biāo)記的抗SCC、Dy3+標(biāo)記的抗CEA第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。所述的第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l第一株單克隆抗體混合抗體用包被緩沖液稀釋，制得抗體包被液，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入ΙΟΟμ I的所述抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200μ I的封板液，于室溫封閉2小時(shí)或置于4°C環(huán)境中過夜，然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次，冷凍干燥，制得第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板。所述抗體包被液中，分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l的第一株單克隆抗體的濃度均為 0.006 0.014g/L。所述的用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21_l、Tb3+標(biāo)記的抗CA199、Sm3+標(biāo)記的抗SCC、Dy3+標(biāo)記的抗CEA第二株單克隆抗體混合抗體中，用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21-1抗體、Tb3+標(biāo)記的抗CA199抗體、Sm3+標(biāo)記的抗SCC抗體、Dy3+標(biāo)記的抗CEA抗體的質(zhì)量配比為:Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21-1抗體:Tb3+標(biāo)記的抗CA199抗體:Sm3+標(biāo)記的抗SCC抗體:Dy3+標(biāo)記的抗CEA抗體=(4 8): (4 7): (4.5 9.5): (10 13)。分析緩沖液的制備方法為:向每升濃度為0.05mol/L、pH值為8.0的Tris-Hcl緩沖液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐溫_40、5g聚乙二醇，混合均勻，即制得分析緩沖液。所述共用熒光增強(qiáng)劑的制備方法為:解離部分:將70 200 μ mol的PTA、2 7 μ mo I的氧化乾、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸調(diào)pH值至3.5，制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.1 0.4mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至1L，制得增強(qiáng)部分。所述洗滌液的制備方法為:在濃度為0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫-20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。所述質(zhì)控品為SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l 中的應(yīng)用。試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l中的應(yīng)用，包括以下步驟:(I)用分析緩沖液稀釋質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液；(2)將待測樣品與步驟(I)制備的四種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液分別加入抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分別與SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1結(jié)合的標(biāo)記有稀土離子螯合物的第二株單克隆抗體混合抗體，之后加入共用熒光增強(qiáng)劑，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫檢測，得到發(fā)光值；(3)根據(jù)測定的具有系列濃度梯度的包含SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l四種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)以測定的待測樣品中的SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l發(fā)光值和標(biāo)準(zhǔn)品中SCC、CA 199、CEA、Cyfra21 -1各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線的發(fā)光值做比較，得出待測樣品中SCC、CA 199、CEA、Cyfra21-1各自的含量。所述待測樣品為人體血清。
進(jìn)一步的，所述包被緩沖液的制備方法為:取濃度為0.05mol/L、pH值為8.6的碳酸鹽緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得包被緩沖液。所述封板液的制備方法為:向濃度為0.01mol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA,配制成BSA質(zhì)量百分比濃度為1%的BSA的PBS緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得封板液。本發(fā)明提供的試劑盒，采用時(shí)間分辨熒光免疫檢測方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l的目的。時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)是一種以稀土離子為標(biāo)記物，根據(jù)稀土離子螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測定特異性熒光的技術(shù)方法。TRFIA利用稀土離子的激發(fā)光和發(fā)射光的波長不同，同時(shí)發(fā)射光具有長的衰減時(shí)間，這樣可以有效的排除非特異性熒光的干擾，具有線性范圍寬、靈敏度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，另外，可以利用不同的稀土離子的不同的發(fā)射光波長和不同的衰減時(shí)間，實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)檢測多個(gè)標(biāo)志物，這樣和單個(gè)指標(biāo)分開檢測相比可以節(jié)約時(shí)間、人員、試劑等，這些特點(diǎn)正好適合本發(fā)明的同時(shí)在同一反應(yīng)體系內(nèi)檢測多指標(biāo)。本發(fā)明提供的食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l時(shí)間分辨熒光免疫檢測試劑盒，具有非常好的線性范圍，檢測SCC的線性范圍為lng/ml 50ng/ml，檢測限為
0.5ng/ml ;檢測CA199的線性范圍為20U/ml 300U/ml，檢測限為10U/ml ;檢測CEA的線性范圍為1.5ng/ml 190ng/ml,檢測限為lng/ml ;檢測Cyfra21_l的線性范圍為2ng/ml 290ng/ml，檢測限為lng/ml。各檢測指標(biāo)的正常參考值分別為:SCC為O 2.5ng/ml ；CA199為O 37U/ml ；CEA為O 5ng/ml ;Cyfra21_l為O 3.5ng/ml。本發(fā)明提供的食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1時(shí)間分辨熒光免疫檢測試劑盒可用于食管癌的臨床輔助診斷、療效觀察及預(yù)后判斷，對(duì)食管癌腫瘤的治療和預(yù)防具有重要意義。采用本發(fā)明提供的試劑盒可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物四項(xiàng)指標(biāo)SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l，檢測操作簡單，步驟少，所需時(shí)間短，方便快捷；檢測結(jié)果準(zhǔn)確，避免了現(xiàn)有的采用四種單項(xiàng)試劑盒分別檢測四項(xiàng)指標(biāo)SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1再進(jìn)行綜合判斷而引起的判斷誤差，大大提高了檢測結(jié)果的特異性和敏感性，為下一步的研究或判斷做出準(zhǔn)確的結(jié)論提供了可靠依據(jù)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒同一微孔內(nèi)同一反應(yīng)體系反應(yīng)原理不意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測試SCC相關(guān)回歸分析圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與深圳新產(chǎn)業(yè)公司的單指標(biāo)試劑盒測試CA199相關(guān)回歸分析圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測試CEA相關(guān)回歸分析圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒與北京科美東雅公司的單指標(biāo)試劑盒測試Cyfra21-1相關(guān)回歸分析圖。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，包括:抗SCC的抗體 H00006317-M01、抗 CA 199 的抗體 ab3982、抗 CEA 的抗體 MAM02-008、抗 Cyfra21_l 的抗體M01300M四種單克隆抗體組成的混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的R106抗體(抗Cyfra21-1的抗體)、用Tb3+標(biāo)記的ab 116024抗體(抗CA 199的抗體)、用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體(抗SCC的抗體)、用Dy3+標(biāo)記的MAM02-881抗體(抗CEA的抗體)四種單克隆抗體組成的混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四種標(biāo)準(zhǔn)品混合組成的質(zhì)控品。該試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、底物等其它相關(guān)試劑。本實(shí)施例提供的試劑盒中，抗SCC抗體H00006317-M01、H00025816-A01購自Abnova公司；抗0八199的抗體ab3982、abl 16024購自Abcam公司；抗CEA的抗體MAM02-008、MAM02-881 購自 Meridian 公司；抗 Cyfra21_l 的抗體 M01300M 購自 Meridian 公司；抗Cyfra21-1的抗體R106是自制兔多抗。H00006317-M0U ab3982、MAM02-008、M01300M四種單克隆抗體組成的混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把混合抗體用包被緩沖液稀釋，制得混合抗體包被液，混合抗體包被液中，分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l的第一株單克隆抗體的濃度均為0.012g/L,即混合抗體包被液中，抗體H00006317-M01、ab3982、MAM02-008、M01300M的濃度均為
0.012g/L，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入ΙΟΟμ I的混合抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200μ I的封板液，于室溫封閉2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次，冷凍干燥，制得混合抗體包被的微孔板，密封于鋁箔袋中，4°C保存?zhèn)溆?。其中，包被緩沖液的制備方法為:取濃度為0.05mol/L、pH值為8.6的碳酸鹽緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得包被緩沖液。封板液的制備方法為:向濃度為0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA，配制成BSA質(zhì)量百分比濃度為1%的BSA的PBS緩沖液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得封板液。用Eu3+標(biāo)記的R106抗體、用Tb3+標(biāo)記的abl 16024抗體、用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體、用Dy3+標(biāo)記的MAM02-881抗體四種單克隆抗體組成的混合抗體的制備方法為:將Eu3+標(biāo)記的R106抗體、Tb3+標(biāo)記的abl 16024抗體、Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體、Dy3+標(biāo)記的MAM02-881抗體以質(zhì)量比:Eu3+標(biāo)記的R106抗體:用Tb3+標(biāo)記的abll6024抗體:用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體:用Dy3+標(biāo)記的MAM02-881抗體=5:5:8:11混合，制得混合抗體。其中用Eu3+標(biāo)記的R106抗體、用Tb3+標(biāo)記的abl 16024抗體、用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體、用Dy3+標(biāo)記的MAM02-881抗體的制備方法為:每種抗體的標(biāo)記流程步驟相同，只是分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的抗體分別對(duì)應(yīng)的稀土離子螯合物標(biāo)記物為N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Sm、N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Tb、N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Dy、N1-對(duì)異硫氰酸芐基_DTTA_Eu。下面以N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Sm標(biāo)記抗SCC抗體H00025816-A01為例，其具體制備方法和步驟為:
(I)標(biāo)記前應(yīng)用截留分子量為50kDa的離心柱對(duì)抗體H00025816-A01進(jìn)行標(biāo)記前純化處理，具體步驟如下:懸空加入Img H00025816-A01抗體于50kDa的離心柱中，9000rpm離心8分鐘，棄掉濾液；往離心柱中加入200 μ I標(biāo)記緩沖液，9000rpm離心8分鐘，棄掉濾液，該步驟重復(fù)四次，最后一次將離心管取出，棄掉濾液；往離心柱中加入50 μ I標(biāo)記緩沖液，讓其靜置I分鐘，然后將離心柱的濾膜反轉(zhuǎn)裝入離心管中，SOOOrpm離心6分鐘，收集濾液，即得到待標(biāo)記的抗體Η00025816-Α01 ;其中，標(biāo)記緩沖液為50mmol/L、pH值為9.0的碳酸鹽緩沖液；(2)稱取稀土離子螯合物標(biāo)記物N1-對(duì)異硫氰酸芐基-DTTA-Sm 0.2mg，W；v80yl超純水進(jìn)行溶解，制成螯合試劑；將螯合試劑加入到盛有待標(biāo)記抗體H00025816-A01的EP管中，混合均勻；置于搖床上4°C過夜，制得標(biāo)記好的抗體H00025816-A01，即用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01 抗體；用三倍柱體積的PBS緩沖液作為柱平衡液平衡Superdex 200 I X 30cm柱，用移液器吸取用Sm3+標(biāo)記的H00025816-A01抗體緩慢上樣，用洗脫液進(jìn)行洗脫，流速控制在Iml/min，蛋白檢測儀檢測到蛋白峰收集樣品，將收集的目的產(chǎn)物經(jīng)過0.22 μ m濾膜除菌；用比活度測定方法對(duì)標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記率的計(jì)算與分析。長期儲(chǔ)存標(biāo)記抗體可以將高純度的BSA加入到標(biāo)記抗體溶液中，BSA的終濃度為0.1%，可置于4°C或_20°C進(jìn)行保存。分析緩沖液的制備方法為:向每升濃度為0.05mol/L、pH值為8.0的Tris-Hcl緩沖液中加入9g NaCU0.5g NaN3UOg BSA、0.1ml吐溫_40、5g聚乙二醇，混合均勻，即制得分析緩沖液。共用熒光增強(qiáng)劑的制備方法為:解離部分:將200 μ mol的ΡΤΑ、2 μ mol的氧化釔、
0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸調(diào)pH值至3.5,制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.4mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至I升,制得增強(qiáng)部分。洗滌液的制備方法為:在濃度為0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫-20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為
0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。質(zhì)控品為SCC、CA 199、CEA、Cyfra21_l 標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。SCC、CEA 購自 Abnova 公司，CA 199 購自 Acris 公司，Cyfra21_l 購自 Meridian 公司。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的應(yīng)用，即采用本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒，同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l時(shí)間分辨熒光免疫檢測方法，其反應(yīng)原理如圖1所示，采用雙抗體夾心法，包括以下步驟:(I)用分析緩沖液稀釋SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l四種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，即質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l四種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液；(2)分別取100μ I待測樣品人體血清和步驟(I)制備的四種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，加入Η00006317-Μ01、ab3982、MAM02-008、M01300M四種單克隆抗體組成的混合抗體包被的微孔板的不同孔中，37°C溫育I小時(shí)，三次洗滌(洗滌時(shí)所用洗滌液的配制方法為:每升PBS緩沖液中加入9g氯化鈉、0.5ml吐溫-20，搖勻，即可)，之后加入100 μ I混合標(biāo)記抗體工作液(用分析緩沖液以體積比1:2500稀釋混合標(biāo)記抗體儲(chǔ)存液，制得混合標(biāo)記抗體工作液，每100 μ I該混合標(biāo)記抗體工作液中含有用Eu3+標(biāo)記的R106抗體50ng、用Tb3+標(biāo)記的 abl 16024 抗體 50ng、用 Sm3+ 標(biāo)記的 H00025816-A01 抗體 80ng、用 Dy3+ 標(biāo)記的 MAM02-881抗體llOng，其余為分析緩沖液)，震蕩均勻，37°C溫育I小時(shí)，用洗滌液洗5次，在吸水紙上控干，加入200 μ I共用熒光增強(qiáng)劑的解離部分，震蕩5分鐘，加入20 μ I共用熒光增強(qiáng)劑的增強(qiáng)部分，震蕩8分鐘，在時(shí)間分辨熒光儀上測量熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為315nm ;647nm、612nm、544nm、575nm 分別為 Sm3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+ 的最強(qiáng)的發(fā)射光峰；500 微秒、200 微秒、50微秒、20微秒分別為Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+的延遲時(shí)間；分別測量各自的發(fā)光值。把不同濃度的SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l四種蛋白混合標(biāo)準(zhǔn)品中各指標(biāo)分別和各自的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到不同指標(biāo)的各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣品人體血清的濃度按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。得到試劑盒的精密度=SCC分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為4% 6.9%、5.6% 8.4% ;CA199分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為3.9% 6%、4.8% 7.8% ;CEA分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為4.2% 7.1%、5.3% 8.1% ;Cyfra21_l分析內(nèi)和分析間的變異系數(shù)分別為3.7% 5.9%、5.7% 8.9%。實(shí)施例3用本發(fā)明的試劑盒檢測40份血清樣本得到的SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l四個(gè)指標(biāo)的數(shù)值和用同樣的40份血清樣本分別用Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測試SCC、深圳新產(chǎn)業(yè)公司的單指標(biāo)試劑盒測試CA199、Abbott公司的單指標(biāo)試劑盒測試CEA、北京科美東雅公司的單指標(biāo)試劑盒測試Cyfra21-1所得到的數(shù)據(jù)分別做回歸相關(guān)性分析，分別對(duì)應(yīng)附圖2、
3、4、5，從附圖可以看出，本發(fā)明試劑盒測試得到的各指標(biāo)數(shù)據(jù)和分別用單指標(biāo)試劑盒測試得到的數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，把四種食管癌腫瘤標(biāo)志物see、CA199、CEA、Cyfra21-l綜合在同一微孔的同一反應(yīng)體系內(nèi)，采用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測，其特征在于:該試劑盒包括:分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21-1、Tb3+標(biāo)記的抗CA199、Sm3+標(biāo)記的抗SCC、Dy3+標(biāo)記的抗CEA第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述的第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的制備方法為:把分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體用包被緩沖液稀釋，制得抗體包被液，然后向微孔板的每個(gè)孔中分別加入100 μ I的所述抗體包被液，于37°C包被2小時(shí)，然后用生理鹽水沖洗微孔板三次，然后再向微孔板的每個(gè)孔中分別加入200 μ I的封板液，于室溫封閉2小時(shí)或置于4°C環(huán)境中過夜，然后用生理鹽水沖洗微孔板兩次，冷凍干燥，制得第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述抗體包被液中，分別抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1的第一株單克隆抗體的濃度均為0.006 0.014g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述的用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21_l、Tb3+標(biāo)記的抗CA199、Sm3+標(biāo)記的抗SCC、Dy3+標(biāo)記的抗CEA第二株單克隆抗體混合抗體中，用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21-1抗體、Tb3+標(biāo)記的抗CA199抗體、Sm3+標(biāo)記的抗SCC抗體、Dy3+標(biāo)記的抗CEA抗體的質(zhì)量配比為:Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21_l抗體:Tb3+標(biāo)記的抗CA199抗體:Sm3+標(biāo)記的抗SCC抗體:Dy3+標(biāo)記的抗CEA抗體=(4 8):(4 7): (4.5 9.5): (10 13)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述共用熒光增強(qiáng)劑的制備 方法為:解離部分:將70 200 μ mo I的PTA、2 7 μ mol的氧化釔、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸調(diào)pH值至3.5,制得解離部分；增強(qiáng)部分:將0.1 0.4mmol的鄰菲羅啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至1L,制得增強(qiáng)部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述洗滌液的制備方法為:在濃度為0.0lmol/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入吐溫_20，混勻，制得吐溫-20質(zhì)量百分比濃度為0.05%的PBS溶液，然后用質(zhì)量百分比濃度為0.2%的NaN3溶液防腐處理，制得洗滌液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒，其特征在于:所述質(zhì)控品為SCC、CA 199、CEA、Cyfra21_l標(biāo)準(zhǔn)品的混合物。
8.—種權(quán)利要求1-7任一所述的時(shí)間分辨熒光法綜合檢測食管癌試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (O用分析緩沖液稀釋質(zhì)控品，制成具有系列濃度梯度包含有SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1四種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液；(2)將待測樣品與步驟(I)制備的四種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液分別加入抗SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能分別與SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1結(jié)合的標(biāo)記有稀土離子螯合物的第二株單克隆抗體混合抗體，之后加入共用熒光增強(qiáng)劑，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫檢測，得到發(fā)光值； (3)根據(jù)測定的具有系列濃度梯度的包含SCC、CA199、CEA、Cyfra21-l四種標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液的發(fā)光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)以測定的待測樣品中的SCC、CA199、CEA、Cyfra21_l發(fā)光值和標(biāo)準(zhǔn)品中SCC、CA 199、CEA、Cyfra21 -1各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線的發(fā)光值做比較，得出待測樣品中SCC、CA 199、CEA、Cyfra21-1各自的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CA199、CEA、Cyfra21-1中的應(yīng)用，其特征在于:所述待測樣品為人體血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1的時(shí)間分辨熒光免疫檢測試劑盒，同時(shí)還涉及該試劑盒在綜合檢測食管癌腫瘤標(biāo)志物SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1中的應(yīng)用。該試劑盒包括分別抗SCC、CEA、CA199、Cyfra21-1第一株單克隆抗體混合抗體包被的微孔板；用Eu3+標(biāo)記的抗Cyfra21-1、Tb3+標(biāo)記的抗CA199、Sm3+標(biāo)記的抗SCC、Dy3+標(biāo)記的抗CEA第二株單克隆抗體混合抗體；分析緩沖液；共用熒光增強(qiáng)劑；洗滌液；質(zhì)控品。本發(fā)明試劑盒可用于食管癌的臨床輔助診斷、療效觀察及預(yù)后判斷，對(duì)食管癌腫瘤的治療和預(yù)防具有重要意義，同時(shí)檢測四個(gè)腫瘤標(biāo)志物，簡化了檢測步驟，提高了檢測數(shù)據(jù)綜合分析的特異性和靈敏性。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103105496SQ20121051271
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王嘎, 程自卿 申請(qǐng)人:河南生生醫(yī)療器械有限公司