專利名稱：檢測呼吸道合胞病毒的免疫檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體和相應(yīng)的免疫檢測試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體，可引起嚴(yán)重的呼吸道疾病，感染后與其他呼吸道感染有相似的臨床表現(xiàn)和X線胸片特征，不易鑒另|J。十年來呼吸道合胞病毒肺炎及毛細(xì)支氣管炎占我國嬰幼兒病毒性肺炎第一位，其癥狀與副流感病毒肺炎、輕癥流感病毒肺炎及輕癥腺病毒肺炎臨床上幾乎無法區(qū)別。重癥流感病毒肺炎及重癥腺病毒肺炎則高熱持續(xù)，中毒癥狀及呼吸道癥狀重疊，臨床表現(xiàn)卻遠(yuǎn)較合胞病毒肺炎嚴(yán)重。合胞病毒肺炎其臨床癥狀與一般支氣管肺炎有相似之處，但與輕癥腺病毒肺炎亦較難區(qū)別，確診需結(jié)合病毒檢查結(jié)果綜合考慮，所以研究敏感快速的針對RSV病毒的檢測方法，可以使檢驗室出具及時準(zhǔn)確的病原檢測報告，使臨床醫(yī)師及時明確病因，采取特異性針對性的治療方案，避免濫用抗生素，而且可以便于早期及時診斷后立即加強(qiáng)患者管理，有效預(yù)防醫(yī)院交叉感染，減少病毒傳播。目前，臨床上RSV的檢測方法很多，常見的有直接免疫熒光法、間接免疫熒光法、橋聯(lián)酶標(biāo)免疫法、普通酶聯(lián)免疫法、病毒分離法、PCR法及核酸雜交法等。主要使用的是熒光定量PCR法，該方法主要優(yōu)點是靈敏度高，特異性好。但是缺點是操作復(fù)雜，需特定的儀器設(shè)備和操作間，且操作易污染，造成結(jié)果不如免疫方法直接檢抗原可靠。而免疫診斷方法通過特異性直接檢抗原，結(jié)果更可靠、特異性好，操作簡便，無需特殊的儀器設(shè)備，普通實驗室都可操作，易于基層單位推廣和應(yīng)用。它的主要缺點是不如熒光定量PCR高。因此研發(fā)高質(zhì)量的單抗并制備相應(yīng)的成試劑盒，使其擁有熒光定量PCR試劑同樣的靈敏度和特異性，并且兼有上述免疫診斷試劑的優(yōu)點，完全能滿足臨床對該病毒診斷的需求具有非常重要的實用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測呼吸道合胞病毒(RSV)的檢測試劑，包括抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體1，由保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細(xì)胞株制備；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2，由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細(xì)胞株制備。進(jìn)一步地，上述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I為包被抗體；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2為生物素標(biāo)記抗體。進(jìn)一步地，上述檢測試劑還包括親和素-HRP。本發(fā)明的另一個目的是提供包括上述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I和抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2的檢測試劑盒。
進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括親和素-HRP。具體地，所述試劑盒的原理是用保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細(xì)胞株制備的抗RSV單克隆抗體包被的微孔板和用生物素標(biāo)記由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細(xì)胞株制備抗RSV單克隆抗體，形成雙抗體夾心法檢測RSV病毒的NP抗原，利用親和素酶放大反應(yīng)，從而高靈敏度和特異性地檢測咽拭子抽提液中的RSV病毒。本發(fā)明的又一個目的是提供一種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括將待測樣品與上述的檢測試劑接觸，從而檢測樣品中的呼吸道合胞病毒。進(jìn)一步地，還提供了使用本發(fā)明的檢測試劑盒來檢測樣品中的呼吸道合胞病毒的方法。本發(fā)明所述的檢測試劑和方法具有較高的靈敏度和特異性，便于臨床推廣使用，能完全滿足臨床對RSV病毒診斷的需要。生物材料的保藏分泌抗RSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞命名為KRSV2和KRSV5，于2012年10月25日提交到 CCTCC 保藏，保藏號為=CCTCC C2012154 和 CCTCC C2012155。
具體實施例方式以下實施例有助于進(jìn)一步了解本發(fā)明的優(yōu)點和特點，不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。所使用的實驗材料和試劑如無特別說明`，均為普通市售。實施例1RSV單克隆抗體的研制和配對篩選1.免疫和篩選用抗原的制備為研制RSV單克隆抗體，從該病毒蛋白組學(xué)分析，本發(fā)明選擇該病毒相對保守且含量相對較高的NP(核衣殼)蛋白作為診斷的目標(biāo)蛋白。1.1用大腸桿菌表達(dá)RSV的NP蛋白并純化將RSV的NP蛋白基因通過PET30a質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)，產(chǎn)物用HIS柱層析親和純化，用作免疫用抗原。具體方法和過程參見文獻(xiàn)(地區(qū)人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表達(dá)，病毒學(xué)報，CHINESEJOURNAL OF VIROLOGY 2007.06.vol. 23459-465)。1. 2RSV的培養(yǎng)和分離純化將RSV的LONG株(國際標(biāo)準(zhǔn)株)接種H印_2細(xì)胞，將100TCID/0. 2mLRSV接種于已成片的!fep-2細(xì)胞試管中33°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，待細(xì)胞病變后，收集培養(yǎng)物并濃縮超速離心純化，用作篩選用抗原。具體方法和過程參見文獻(xiàn)(呼吸道合胞病毒檢測方法比較，臨床兒科雜志，2003年第21卷第I期)。2.雜交瘤細(xì)胞株的建立2.1 免疫2.1.1免疫原用上述1.1部分制備的RSV免疫BALB/C小鼠，雌性，6_8周齡(湖北省實驗動物中心)。2.1. 2方法按100微克/每只的免疫劑量，初免用完全弗氏佐劑，2周后用不完全佐劑100微克/每只加強(qiáng)一次。加強(qiáng)兩次后，靜脈抗原直接加強(qiáng)。三天后取脾細(xì)胞融合。2. 2細(xì)胞融合2. 2.1融合用小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0 (P2_X_Ag8 · 6 · 5 · 3)，為Ig非分泌型(武漢生物制品研究所)。
2. 2. 2融合方法取加強(qiáng)免疫后第三天的小鼠，摘眼球放血，拉頸處死，置75%酒精浸泡5分鐘，無菌操作取出脾臟，并用眼科剪刀將其剪成數(shù)段，放入盛有不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的IOmL圓底塑料管中，用外包塑料王的研磨棒擠壓出脾細(xì)胞，靜置數(shù)分鐘，取出細(xì)胞懸液，并用不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基混合，離心洗滌兩次，棄上清，計數(shù)，配制成細(xì)胞懸液。將SP2/0細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1: 5比例混合，于4°C、1400rpm離心10分鐘，吸凈上清，加入50% PEG (Sigma P7181)處理，在5分鐘內(nèi)慢慢加入IOmL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在IOOOrpm條件下離心10分鐘，棄上清，加入含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制的HAT (Sigma H0262)中，然后接種到96孔接種預(yù)先點有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)板上，于融合后第10-14天挑選有雜交瘤細(xì)胞生長的孔，吸取培養(yǎng)上清液進(jìn)行篩選，并換以HT培養(yǎng)基。2. 3篩選和克隆化2. 3.1篩選采用間接ELISA法，用超離心純化的RSV抗原包被聚苯乙烯板，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育，洗板加入羊抗鼠酶結(jié)合物，洗板顯色。2. 3. 2克隆和再克隆在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。取陽性孔細(xì)胞計數(shù)，用含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞含量為5個細(xì)胞/mL，接種于一塊96孔板中，每孔O. 2mL，第10-14天采用間接檢測，挑選強(qiáng)陽性孔細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存和再克隆，以連續(xù)兩次克隆陽性率100%為止。通過以上方法，共篩選出5株能穩(wěn)定分泌抗RSV核蛋白(NP)的單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為 KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5。3.單克隆抗體的配對和選擇3.1將實施例1所獲 得的5株單抗細(xì)胞株制備腹水，分別用Protein-A蛋白親和膠純化，取一部分分別都標(biāo)記上HRP。3. 2簡易過碘酸鈉法標(biāo)記HRP 本法是以NaIO 4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合，99%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。(I)稱取5mgHRP溶解于ImL蒸餾水中。(2)于上液中加入O. 2mL新配的O.1M NaIO 4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。(4)加20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化程RP的pH升高到9. O
9.5，然后立即加入IOmg IgG (抗體，或SPA5mg)在ImL O. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。(5)加O.1mL新配的4mg/mL NaBH 4液，混勻，再置4°C 2小時。(6)將上述液裝入透析袋中，對O. 15M pH7. 4PBS透析，4°C過夜。3. 3將RSV培養(yǎng)物用PBS按1: 100比例的稀釋做陽性標(biāo)準(zhǔn)品，以PBS作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。3. 4 單抗 ELISA 配對實驗將 KRSV1、KRSV2、KRSV3、KRSV4、KRSV5 制備的單克隆抗體，分別以5微克/毫升包被聚苯乙烯板，將以上抗體HRP標(biāo)記物3微克/毫升，方法為雙抗體夾心法，抗體之間兩兩配對，以陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品做樣品，測其OD值，見結(jié)果如下表I 表I
權(quán)利要求
1.一種檢測呼吸道合胞病毒的雙抗體檢測試劑，包括 抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體1，由保藏編號為CCTCC C2012154的雜交瘤細(xì)胞株制備; 抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2，由保藏編號為CCTCC C2012155的雜交瘤細(xì)胞株制備。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體I為包被抗體；抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體2為生物素標(biāo)記抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，還進(jìn)一步包括親和素-HRP。
4.包括權(quán)利要求1-3中任一項所述試劑的檢測試劑盒。
5.抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體1，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCCC2012154的雜交瘤細(xì)胞株制備。
6.抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體2，所述單克隆抗體由保藏編號為CCTCCC2012155的雜交瘤細(xì)胞株制備。
7.—種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括將待測樣品與權(quán)利要求1所述的免疫檢測試劑接觸，從而檢測樣品中的呼吸道合胞病毒。
8.—種檢測呼吸道合胞病毒的方法，包括使用權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測呼吸道合胞病毒的步驟。
9.如要求7所述的方法，其中所述樣品為咽拭子抽提液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測呼吸道合胞病毒的雙抗體檢測試劑及相應(yīng)的試劑盒，其中所述試劑包括作為包被抗體的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體、作為生物素標(biāo)記抗體的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體以及親和素-HRP。本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述試劑或試劑盒進(jìn)行檢測呼吸道合胞病毒的方法，該方法具有較高的靈敏度和特異性，且易于臨床推廣使用。
文檔編號G01N33/577GK103048459SQ20121051611
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者嚴(yán)兵 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所