專利名稱：一種腦栓通制劑hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以天然植物藥材原料制成的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際社會(huì)對(duì)藥品的要求是“安全、有效、可控”?，F(xiàn)行的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)中成藥的質(zhì)量控制是以傳統(tǒng)的性狀鑒別和顯微鑒別確定真?zhèn)危岳砘b別評(píng)價(jià)優(yōu)劣，少數(shù)藥味對(duì)其r2個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)和控制。從傳統(tǒng)中醫(yī)藥觀點(diǎn)來看，檢測(cè)任何一種活性成分均不能反映復(fù)方制劑所體現(xiàn)的整體療效，中醫(yī)辨證施治用的是藥味而非某個(gè)化學(xué)成分。指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，采用“共有峰”的方式來判斷相似程度從而達(dá)到控制目的?？衫弥讣y圖譜表達(dá)成品的質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)對(duì)工藝操作和原藥材的質(zhì)控；也可利用指紋追根溯源來尋找工藝操作中的問題和實(shí)現(xiàn)對(duì)原藥材GAP的質(zhì)量要求。腦栓通制劑是中藥復(fù)方制劑，由蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆五味藥材組成，具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)化痰的功效，用于風(fēng)痰淤血痹阻脈絡(luò)弓I起的缺血性中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)急性期和恢復(fù)期。由于在腦栓通制劑的生產(chǎn)過程中，赤芍、郁金2味藥材采用醇提工藝，蒲黃、天麻、漏蘆3味藥材采用水提醇沉工藝，故其成品中成分既有脂溶性成分又有水溶性成分，成分復(fù)雜，極性相差大。但目前腦栓通制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，缺乏全面有效的質(zhì)量控制方法，難以全面監(jiān)控成品的質(zhì)量、全面監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“鑒別”項(xiàng)采用薄層色譜法對(duì)處方中的蒲黃、天麻、赤芍、漏蘆4味藥材進(jìn)行鑒別，“含量測(cè)定”項(xiàng)采用高效液相色譜法測(cè)定臣藥赤芍中芍藥苷的含量，其不足之處在于該標(biāo)準(zhǔn)操作繁瑣，沒有對(duì)郁金進(jìn)行檢測(cè)；單一測(cè)定方法給出信息少，沒有對(duì)五味藥材中的化學(xué)成分進(jìn)行全面、系統(tǒng)的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，通過對(duì)腦栓通制劑HPLC指紋圖譜構(gòu)建方法的研究，提供一種有效可靠的腦栓通制劑的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述本發(fā)明公開的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括構(gòu)建腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一和腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二，通過HPLC指紋圖譜一和HPLC指紋圖譜二共同組成了完整的腦栓通制劑的指紋圖譜特征。所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一的構(gòu)建方法包括以下步驟(I)供試品溶液的制備精密稱取腦栓通制劑1. Og 10. 0g，用甲醇提取，濾過，取濾液適量，蒸干，用甲醇配成腦栓通制劑供試品溶液一，優(yōu)選用30%的甲醇溶液配制，；(2)采用高效液相色譜法分析供試品溶液和對(duì)照品溶液，得到HPLC指紋圖譜一，色譜條件為進(jìn)樣量5 30 ill ;色譜柱為ODS C18, 3 u m ;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 70分鐘，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液由2:0:98漸變?yōu)?0:10:70 ;柱溫20° C ;檢測(cè)波長0 53min為254nm，于53min后將波長切換為275nm。
所述步驟(I)更具體為取本品內(nèi)容物適量，混勻，取約2. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。(I)精密量取續(xù)濾液20ml，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至IOml量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，用0. 45 ii m微孔濾膜濾過，作為成品供試品溶液一。所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)出27個(gè)共有色譜峰，歸屬于蒲黃的共有色譜峰有5個(gè)峰，分別為I號(hào)峰、3號(hào)峰、12號(hào)峰、20號(hào)峰、22號(hào)峰；歸屬于赤芍的共有色譜峰有10個(gè)峰，分別為5號(hào)峰、7號(hào)峰、11號(hào)峰、15號(hào)峰、16號(hào)峰、21號(hào)峰、23號(hào)峰、24號(hào)峰、25號(hào)峰、27號(hào)峰；歸屬于天麻的共有色譜峰有I個(gè)峰為6號(hào)峰；歸屬于漏蘆的共有色譜峰有6個(gè)峰，分別為10號(hào)峰、13號(hào)峰、14號(hào)峰、18號(hào)峰、19號(hào)峰、26號(hào)峰6 ;歸屬于郁金的共有色譜峰有一個(gè)峰為9號(hào)峰，不歸屬于任何藥材的共煎成分色譜峰有4個(gè)峰，分別為2號(hào)峰、4號(hào)峰、8號(hào)峰、17號(hào)峰。所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一的構(gòu)建方法還包括以下步驟(I)對(duì)照品溶液的制備精密稱取香蒲新苷、異鼠李素-3-0-新橙皮苷、芍藥苷、天麻素、3 -蛻皮留酮適量，加甲醇使溶解，制成混合對(duì)照品溶液，其中香蒲新苷、異鼠李素-3-0-新橙皮苷、芍藥苷、天麻素、P -蛻皮甾酮的濃度分別為0. 01 3mg/ml ；(2)采用高效液相色譜法分析供對(duì)照品溶液，得到對(duì)照品指紋圖譜，色譜條件為進(jìn)樣量5 30 ill ;色譜柱為ODS C18, 3 u m ;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 70分鐘，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液由2:0:98漸變?yōu)?0:10:70 ;柱溫20° C ;檢測(cè)波長0 53min為254nm，于53min后將波長切換為275nm ；(3)利用DAD檢測(cè)器和RRLC/MS/MS技術(shù)手段對(duì)HPLC指紋圖譜一和對(duì)照品指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行色譜峰歸屬及峰純度檢測(cè)，通過UV吸收曲線的比較確定6號(hào)峰為天麻素、7號(hào)峰為沒食子酸、11號(hào)峰為氧化芍藥苷、13號(hào)峰為筋骨草素C、15號(hào)峰為芍藥苷、18號(hào)峰為@ -蛻皮留酮、20號(hào)峰為香蒲新苷、21號(hào)峰為沒食子?；炙庈栈驔]食子?；炙巸?nèi)酯苷或二者的異構(gòu)體、22號(hào)峰為異鼠李素-3-0-新橙皮苷、25號(hào)峰為苯甲酰氧芍藥苷。所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二的構(gòu)建方法包括以下步驟(I)供試品溶液的制備精密稱取腦栓通制劑1. Og 10. 0g，用甲醇提取，濾過，取濾液適量，蒸干，適當(dāng)凈化，用甲醇配成腦栓通制劑供試品溶液二，優(yōu)選用30%的甲醇溶液配制；(2)采用高效液相色譜法分析上述供試品溶液，得到腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二，色譜條件為進(jìn)樣量5 30iU ;色譜柱為ODS C18，3 ii m ;流動(dòng)相為乙腈-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 5分鐘，流動(dòng)相乙腈-磷酸水溶液由30:70漸變?yōu)?5:45，5 20分鐘流動(dòng)相乙腈-磷酸水溶液為55:45 ;柱溫25° C ;檢測(cè)波長390nm。所述步驟(I)更具體為取腦栓通制劑，混勻，取約2. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20ml，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0%三氯甲烷25ml振搖提取，分取水層，再用三氯甲烷25ml振搖提取，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，殘?jiān)考尤爰状?ml，使完全溶解，離心，取上清液，用
0.45 um微孔濾膜濾過，作為成品供試品溶液二。
所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)出5個(gè)共有色譜峰，歸屬于郁金的共有色譜峰為5號(hào)峰。利用DAD檢測(cè)器和RRLC/MS/MS技術(shù)手段對(duì)色譜峰進(jìn)行峰歸屬2號(hào)峰為去甲氧基姜黃素。本發(fā)明還公開了利用上述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜在腦栓通制劑及其浸膏半成品檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于(I)本發(fā)明建立了腦栓通制劑的指紋圖譜技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，通過指紋圖譜中共有峰的有無及特征，有效地全面監(jiān)控半成品和成品的質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，保證其質(zhì)量的穩(wěn)定、均一、可控。(2)本發(fā)明采用不同流動(dòng)相系統(tǒng)和不同檢測(cè)波長，分別建立腦栓通制劑指紋圖譜一和指紋圖譜二，共同檢出復(fù)方中的全部五味藥材成分。建立的指紋圖譜可以全面監(jiān)控原料藥材、半成品和成品的質(zhì)量，通過色譜指紋特征相似程度的比較，評(píng)價(jià)優(yōu)劣、考察穩(wěn)定性和一致性，彌補(bǔ)了現(xiàn)行質(zhì)量控制方法的不足。(3)本發(fā)明提高了腦 栓通制劑成品、半成品的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，有效的避免了產(chǎn)品偽造，保證該品種的正常生產(chǎn)、流通秩序；在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以開展指紋圖譜信息與藥效活性信息的相關(guān)性研究，從而深入地闡明產(chǎn)品的內(nèi)在化學(xué)成分與該制劑療效的相關(guān)性。(4)本發(fā)明的方法還具有良好的可行性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。


圖1是本發(fā)明的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一；圖2是本發(fā)明的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二 ；圖3是混合對(duì)照品與腦栓通制劑劑HPLC指紋圖譜一對(duì)應(yīng)的色譜圖，圖中峰號(hào)6、15、18、20、22依次指示為天麻素，芍藥苷，￠-蛻皮留酮，香蒲新苷，異鼠李素-3-0-新橙皮苷;圖4是腦栓通制劑、蒲黃藥材、缺蒲黃陰性對(duì)照色譜圖，圖中從左到右的箭頭所指為腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一中歸屬于蒲黃的色譜峰的峰號(hào)；圖5是腦栓通制劑、赤芍藥材、缺赤芍陰性對(duì)照色譜圖，圖中從左到右的箭頭所指為腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一中歸屬于赤芍的色譜峰的峰號(hào)；圖6是腦栓通制劑、天麻藥材、缺天麻陰性對(duì)照色譜圖，圖中箭頭所指為腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一中歸屬于天麻的色譜峰的峰號(hào)；圖7是腦栓通制劑、漏蘆藥材、缺漏蘆陰性對(duì)照色譜圖，圖中從左到右的箭頭所指為腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一中歸屬于漏蘆的色譜峰的峰號(hào)；圖8是腦栓通制劑、郁金藥材、缺郁金陰性對(duì)照色譜圖，圖中箭頭所指為腦栓通制劑指紋HPLC圖譜一中歸屬于郁金的色譜峰的峰號(hào)；圖9是腦栓通制劑、郁金藥材、缺郁金陰性對(duì)照色譜圖，圖中箭頭所指為腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二中歸屬于郁金的色譜峰的峰號(hào)。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
1、儀器與試藥1.1儀器美國戴安公司Dionex Ultimate 3000DGLC高效液相色譜儀(DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機(jī)、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC3000-RS柱溫箱、PDA-3000 檢測(cè)器);色譜柱 Ultimate AQ-C18 (4. 6 X 150mm, 3 u m) 1. 2試藥10批成品及對(duì)應(yīng)的半成品，均由廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)中液相色譜所用試劑乙腈、四氫呋喃均為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。1. 3 對(duì)照品
權(quán)利要求
1.一種腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括構(gòu)建腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一和腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二，通過HPLC指紋圖譜一和HPLC指紋圖譜二共同組成了完整的腦栓通制劑的指紋圖譜特征。
2.如權(quán)利要求1所述的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一的構(gòu)建方法包括以下步驟 (1)供試品溶液的制備精密稱取腦栓通制劑1.Og 10. 0g，用甲醇提取，濾過，取濾液適量，蒸干，用甲醇配成腦栓通制劑供試品溶液一； (2)采用高效液相色譜法分析供試品溶液，得到HPLC指紋圖譜一，色譜條件為進(jìn)樣量5 30iU ;色譜柱為ODS C18，3 iim;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 70分鐘，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液由2:0:98漸變?yōu)?0:10:70 ;柱溫20° C ;檢測(cè)波長0 53min為254nm，于53min后將波長切換為275nm。
3.如權(quán)利要求2所述的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)出27個(gè)共有色譜峰，歸屬于蒲黃的共有色譜峰有5個(gè)峰，分別為I號(hào)峰、3號(hào)峰、12號(hào)峰、20號(hào)峰、22號(hào)峰；歸屬于赤芍的共有色譜峰有10個(gè)峰，分別為5號(hào)峰、7號(hào)峰、11號(hào)峰、15號(hào)峰、16號(hào)峰、21號(hào)峰、23號(hào)峰、24號(hào)峰、25號(hào)峰、27號(hào)峰；歸屬于天麻的共有色譜峰有I個(gè)峰為6號(hào)峰；歸屬于漏蘆的共有色譜峰有6個(gè)峰，分別為10號(hào)峰、13號(hào)峰、14號(hào)峰、18號(hào)峰、19號(hào)峰、26號(hào)峰6 ;歸屬于郁金的共有色譜峰有I個(gè)峰為9號(hào)峰，不歸屬于任何藥材的共煎成分色譜峰有4個(gè)峰，分別為2號(hào)峰、4號(hào)峰、8號(hào)峰、17號(hào)峰。
4.如權(quán)利要求2所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一的構(gòu)建方法還包括以下步驟 (1)對(duì)照品溶液的制備精密稱取香蒲新苷、異鼠李素-3-0-新橙皮苷、芍藥苷、天麻素、3 -蛻皮留酮適量，加甲醇使溶解，制成混合對(duì)照品溶液，其中香蒲新苷、異鼠李素-3-0-新橙皮苷、芍藥苷、天麻素、P -蛻皮甾酮的濃度分別為0. 01 3mg/ml ； (2)采用高效液相色譜法分析供對(duì)照品溶液，得到對(duì)照品指紋圖譜，色譜條件為進(jìn)樣量5 30 ill ;色譜柱為ODS C18,3um ;流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 70分鐘，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-磷酸水溶液由2:0:98漸變?yōu)?0:10:70 ;柱溫20° C ；檢測(cè)波長0 53min為254nm，于53min后將波長切換為275nm ； (3)利用DAD檢測(cè)器和RRLC/MS/MS技術(shù)手段對(duì)HPLC指紋圖譜一和對(duì)照品指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行色譜峰歸屬及峰純度檢測(cè)，通過UV吸收曲線的比較確定6號(hào)峰為天麻素、7號(hào)峰為沒食子酸、11號(hào)峰為氧化芍藥苷、13號(hào)峰為筋骨草素C、15號(hào)峰為芍藥苷、18號(hào)峰為^ -蛻皮留酮、20號(hào)峰為香蒲新苷、21號(hào)峰為沒食子酰基芍藥苷或沒食子?；炙巸?nèi)酯苷或二者的異構(gòu)體、22號(hào)峰為異鼠李素-3-0-新橙皮苷、25號(hào)峰為苯甲酰氧芍藥苷。
5.如權(quán)利要求1所述的腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二的構(gòu)建方法包括以下步驟 (1)供試品溶液的制備精密稱取腦栓通制劑1.Og 10. 0g，用甲醇提取，濾過，取濾液適量，蒸干，適當(dāng)凈化，用甲醇配成腦栓通制劑供試品溶液二 ； (2)采用高效液相色譜法分析上述供試品溶液，得到腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二，色譜條件為進(jìn)樣量5 30 ill ;色譜柱為ODS C18，3 iim;流動(dòng)相為乙腈-磷酸水溶液；梯度洗脫；0 5分鐘，流動(dòng)相乙腈-磷酸水溶液由30:70漸變?yōu)?5:45，5 20分鐘流動(dòng)相乙腈-磷酸水溶液為55:45 ;柱溫25。C ;檢測(cè)波長390nm。
6.如權(quán)利要求5所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)出5個(gè)共有色譜峰，歸屬于郁金的共有色譜峰為5號(hào)峰。
7.如權(quán)利要求6所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于利用DAD檢測(cè)器和RRLC/MS/MS技術(shù)手段對(duì)色譜峰進(jìn)行峰歸屬2號(hào)峰為去甲氧基姜黃素。
8.如權(quán)利要求2或5所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于配制供試品溶液和對(duì)照品溶液的所用的甲醇濃度為30%。
9.利用權(quán)利要求1所述腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法得到的HPLC指紋圖譜在腦栓通制劑及其浸膏半成品檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦栓通制劑HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括構(gòu)建腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一和腦栓通制劑HPLC指紋圖譜二，通過HPLC指紋圖譜一和HPLC指紋圖譜二共同組成了完整的腦栓通制劑的指紋圖譜特征。本發(fā)明還公開了上述方法得到的HPLC指紋圖譜在腦栓通制劑及其浸膏半成品檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明采用不同流動(dòng)相系統(tǒng)和不同檢測(cè)波長，分別建立腦栓通制劑HPLC指紋圖譜一和HPLC指紋圖譜二，共同檢出腦栓通制劑半成品和成品中的全部五味藥材成分，以全面監(jiān)控腦栓通制劑半成品和成品的質(zhì)量，保證其質(zhì)量的穩(wěn)定、均一、可控。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103063766SQ20121056280
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者蘇薇薇, 龍超峰, 陳思, 謝稱石, 彭維, 劉忠政 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司