一種微流控免疫傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微流控免疫傳感器的制備方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中超劑量濫用農(nóng)藥，造成農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的多樣性和復(fù)雜性，對(duì)食品安全及人類健康構(gòu)成了很大威脅。毒死蜱為一種廣譜殺蟲劑，被用于防治水稻、玉米、果樹、蔬菜等方面的螟蟲、蚜蟲和螨類等害蟲。毒死蜱在人體內(nèi)累聚后，倘若高濃度可致使生命受到威脅。而近年來(lái)，毒死蜱的比例份額沒(méi)有下降，反之，其需求量與日俱增。在大范圍推廣毒死蜱的同時(shí)，必然對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，因而有必要尋找一種現(xiàn)場(chǎng)、快速、準(zhǔn)確且自動(dòng)化程度高的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)是保障農(nóng)產(chǎn)品安全的有效途徑。
[0003]傳統(tǒng)的用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留的分析方法有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫(ELISA)等，這些檢測(cè)方法雖然精確度高，定量準(zhǔn)確，但其樣品的前處理復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、儀器設(shè)備昂貴、需要專業(yè)技術(shù)的操作人員，只適合實(shí)驗(yàn)室操作，不適宜現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前常用的酶抑制法(酶抑制試紙法和酶抑制分光光度法)，可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較好的實(shí)用價(jià)值。但是，速測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度低，一般只能用于嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜樣品的定性測(cè)量。酶抑制分光光度法的準(zhǔn)確度低，檢測(cè)結(jié)果受到蔬菜水果中色素和氣味的影響。免疫傳感器是基于抗原和抗體特異性結(jié)合所引發(fā)的免疫反應(yīng)的原理所研制的傳感器，與傳統(tǒng)的分析方法相比，它具有特異性強(qiáng)、分析速度快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但目前免疫傳感器的制備過(guò)程中，抗體(Ab)或半抗原(hapten)的固定化并保持其良好的生物活性、空間排布、信號(hào)的放大以及人工差異是制約傳感器靈敏度、穩(wěn)定性、選擇性和重復(fù)性的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，選擇性好的檢測(cè)農(nóng)藥殘留的免疫傳感器的制備方法。
[0005]其技術(shù)方案為:一種微流控免疫傳感器的制備方法，其特征在于:在清洗干凈的通入微流控通道內(nèi)先后通入聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)和納米金膠，并重復(fù)兩次，然后通入蛋白A液，獲得修飾電極，再將毒死蜱抗體通入微通道內(nèi)，干燥清洗后獲得基于聚二烯丙基二甲基氯化銨O3DDA)/納米金膠和蛋白A。毒死蜱抗體修飾的微流控免疫傳感器。
[0006]所述方法步驟為:
1)微流控通道的清洗；
2)將聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)、納米金膠和蛋白A、毒死蜱抗體通入并固定在微流控通道內(nèi)。
[0007]步驟I)所述，微流控通道的清洗:過(guò)程是，首先，用注射泵通入IM的氫氧化鈉溶液15分鐘后通入5分鐘去離子水，氮?dú)獯蹈桑缓笸ㄈ隝M的鹽酸溶液15分鐘后通入5分鐘去離子水后氮?dú)獯蹈?，在pH7.5的鐵氰化鉀溶液中掃描Bode曲線，如果能和電極初始時(shí)的Bode曲線重合則電極清洗干凈，否則重新清洗。
[0008]步驟2)所述，將聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)、納米金膠和蛋白A、毒死蜱抗體通入并固定在微流控通道內(nèi):是先通入聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA) 10分鐘，干燥后通入去離子水沖洗5分鐘去掉未固定的H)DA，氮?dú)獯蹈珊笸ㄈ爰{米金膠10分鐘，干燥后通入去離子水沖洗5分鐘去掉未固定的納米金膠，將上述過(guò)程重復(fù)一次。然后通入蛋白A液10分鐘，干燥后通入去離子水沖洗5分鐘去掉未固定的蛋白A，氮?dú)獯蹈?，通入毒死蜱抗體10分鐘，干燥后通入去離子水沖洗5分鐘去掉未固定的抗體，制備好聚二烯丙基二甲基氯化銨O3DDA)/納米金膠和蛋白A修飾的微流控免疫傳感器。
[0009]所述的一種微流控免疫傳感器的制備方法，其特征在于:微流控芯片的清洗，免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建及過(guò)程表征，免疫傳感器工作曲線的建立，免疫傳感器性能的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0010]所述的一種微流控免疫傳感器的制備方法，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括測(cè)試底液的pH、通入檢測(cè)時(shí)間以及孵育時(shí)間；所制備的免疫傳感器的工作曲線為:ΛΖ =163.0 + 70.000 IgC (ng/mL), (R2=0.9745.);免疫傳感器性能檢測(cè)包括特異性、穩(wěn)定性、以及免疫傳感器對(duì)多種果蔬樣品回收率的測(cè)定。
[0011]其制備原理為:用聚二烯丙基二甲基氯化銨(roDA)和納米金膠通過(guò)層層自主裝來(lái)修飾微流控芯片內(nèi)置的叉指陣列電極，提高電極穩(wěn)定性和電極表面的生物親和性；然后將蛋白A固定在納米金膠上，再通過(guò)蛋白A與抗體Fe端的特異性結(jié)合定向?qū)⒖贵w牢固的固定在電極上?？贵w的定向固定保持了抗體的生物活性以及自由的抗原結(jié)合位點(diǎn)來(lái)和農(nóng)藥有效的特異性結(jié)合。采用本發(fā)明制備的微流控免疫傳感器可以在蔬果采收、上市前，進(jìn)行農(nóng)藥毒死蜱殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)量進(jìn)行檢測(cè)，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。
[0012]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種微流控免疫傳感器的制備方法，其特征在于:(I)微流控通道的清洗；(2)將聚二烯丙基二甲基氯化銨(roDA)、納米金膠和蛋白A、毒死蜱抗體通入并固定在微流控通道內(nèi)。
[0013]所述微流控免疫傳感器的制備工藝如下:(I)將清洗干凈的微流控芯片通入roDA10分鐘，干燥后通入去離子水5分鐘沖洗；(2)通入納米金膠10分鐘，干燥后通入去離子水5分鐘沖洗；(3)將⑴和⑵重復(fù)一次；⑷通入蛋白AlO分鐘，待干燥45分鐘后通入5分鐘去離子水沖洗去未固定上的蛋白A，通入毒死蜱抗體10分鐘，干燥90分鐘后通入去離子水沖洗5分鐘去掉未固定的抗體。氮?dú)獯蹈?，微流控免疫傳感器制作完成，保存?°C條件下備用。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1 PA/AuNPS/PDDA/AU 傳感器的 Nyquist 組裝圖
a、裸電極，b、修飾H)DA/AuNPS后的電極，C、修飾蛋白A后的電極，d、固定抗體后的電極，e、結(jié)合毒死蜱后的電極；
本試驗(yàn)在包含 5.0 mmol/L [Fe (CN) 6] 3-/4-和 0.1 mol/L KCl 的 0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行EIS表征。如圖1所示，微流控芯片未經(jīng)修飾的裸電極阻抗值(曲線a)，當(dāng)TODA/AuNPS自主裝修飾后電極后，阻抗值明顯減小(曲線b )，因?yàn)锳uNPS具有優(yōu)良的導(dǎo)電性。當(dāng)?shù)鞍譇修飾電極后，阻抗值明顯增大(曲線C)，納米金膠提高了電極的穩(wěn)定性和生物親和性，使得蛋白A更好地結(jié)合在電極上，因蛋白A大分子物質(zhì)阻礙了電子傳遞，電流減小阻抗增大；當(dāng)毒死蜱抗體在蛋白A的定向固定作用下固定在電極上后，阻抗值明顯增大(曲線d)，當(dāng)毒死蜱農(nóng)藥