專利名稱：轉(zhuǎn)基因成分四聯(lián)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及ー種轉(zhuǎn)基因成分四聯(lián)檢測試劑盒。
技術(shù)背景在轉(zhuǎn)基因生物的研究工作中，或在對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行篩選或安全性評價時，需要進行外源性基因的檢測。而目前常發(fā)生ー種宿主細(xì)胞(包括原核和真核細(xì)胞)轉(zhuǎn)入了 2種以上外源基因的情況，有時甚至多達(dá)3 4種。因此，往往需要對轉(zhuǎn)入的多種外源性基因分別進行定性或半定量測定，操作很繁瑣，檢測成本高。例如轉(zhuǎn)植物的抗草甘膦EPSPS蛋白的檢測。研究表明來源于不同原核生物的EPSPS的氨基酸同源性較低，如Mosanto公司廣泛使用的來源于根瘤農(nóng)桿菌CP4的EPSPS與本實驗室克隆的來源于施氏假單胞菌A1501的EPSPS的氨基酸同源性為45. 18%，與克 隆自土壤宏基因組GR79-EPSPS同源性為19. 75 %，與克隆自熒光假單胞菌G2的EPSPS的同源性為 24. 17% ;另外，A1501-EPSPS 與 GR79-EPSPS 同源性為 23. 58%, A1501-EPSPS 與G2-EPSPS的同源性為24. 69% ;GR79_EPSPS與G2-EPSPS的同源性為29. 89%，且它們的多克隆抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)。目前，本實驗室克隆的這幾個基因已分別被轉(zhuǎn)入玉米、棉花、大豆、煙草、油菜、水稻等作物，部分轉(zhuǎn)基因作物(例如轉(zhuǎn)G2-EPSPS玉米)已進入生產(chǎn)性試驗階段，商品化生產(chǎn)蓄勢待發(fā)。因此，實踐中對轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑植物樣本往往都需要進行多種基因的檢測。已有試紙條檢測的方法雖可部分克服以上不足，但單ー抗體檢測試紙條只能檢測轉(zhuǎn)基因作物中単一種類的外源基因，實際操作中容易產(chǎn)生漏檢等錯誤結(jié)果。例如如果檢測者僅用檢測CP4-EPSPS試紙條，則不能檢測轉(zhuǎn)入GR79-EPSPS或A1501-EPSPS或G2-EPSPS基因的植物，可能會得出檢測對象不存在外源基因的錯誤結(jié)果，造成不必要的損失。而且在操作時，需要將試紙條浸入待檢測的液體中，操作不是很方便。因此，實踐中很需要有ー種可同時檢測轉(zhuǎn)基因植物中不同的EPSPS蛋白，且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速的裝置
實用新型內(nèi)容
本實用新型的目的是建立ー種操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速，井能同時檢測4種不同轉(zhuǎn)基因成分的檢測試劑盒。本實用新型的技術(shù)方案是這樣的它包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于底板上放置有4條測試帶；上蓋有4個觀測窗和I個加樣孔。底板的上表面可以設(shè)置4條凹槽，每條凹槽內(nèi)嵌入一條測試帶，底板的厚度不限。所述底板或上蓋可具有卡槽，以保證底板與上蓋扣紫。所述觀測窗優(yōu)選是長方形。試劑盒的形狀為扁平的多邊形或圓形盒。本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，每個觀測窗對應(yīng)一條測試帯，通過盒蓋上的単一的加樣孔及4個觀測窗可進行加樣和觀察檢測結(jié)果，每個觀測窗可分別檢查ー種基因。在本實用新型的一個優(yōu)選的實例中，以轉(zhuǎn)植物的抗草甘膦EPSPS蛋白的檢測為例試劑盒為正八邊形扁盒，盒底板的上、下、左、右各設(shè)置有一條凹槽，可放置4條測試帶；上蓋與測試帶相應(yīng)位置有4個觀測窗，I個加樣孔設(shè)置在上蓋最中間(見圖I、圖2)。4條測試帶以此種方式分布，一是加樣方便，一次加樣可保證4條測試帶同時加樣，以檢查4種基因，ニ是檢測結(jié)果互不受影響。上述4條測試帶，一條用于檢測CP4-EPSPS蛋白，一條用于檢測G2-EPSPS蛋白，另兩條分別用于檢測A1501-EPSPS和GR79-EPSPS蛋白。所述測試帶是ー種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分子纖維膜、塑料等多層材料制成。4種蛋白的測試帶 均可分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體；CP4-EPSPS蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性CP4-EPSPS，G2-EPSPS蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被G2-EPSPS，A1501-EPSPS蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性A1501-EPSPS，GR79-EPSPS蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性GR79-EPSPS的單克隆抗體或多克隆抗體。每個觀測窗分為測試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；檢測時，將送檢物品的提取液一次性滴加在試劑盒的單ー加樣孔中，5—10分鐘后，通過肉眼就可以通過上蓋的觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。對于每個觀測窗來說，用以下方式判斷檢測結(jié)果I、陰性(-)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帯。檢測結(jié)果待檢樣品中不含待檢基因或其含量在其閾值以下。2、陽性(+)反應(yīng)狀況觀測窗質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)(T)內(nèi)同時出現(xiàn)紫紅色條帶。檢測結(jié)果待檢基因含量在閾值以上。3、無效反應(yīng)狀況質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，檢測結(jié)果表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)，將產(chǎn)生目的蛋白(CP4-EPSPS、G2-EPSPS、A1501-EPSPS和GR79-EPSPS)，因此通過檢測樣品中是否含有上述4種蛋白來確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn)入植物，發(fā)生基因沉默，無目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的(抗草甘膦)。本實用新型所述試劑盒的優(yōu)點在于加樣簡單，一次完成；經(jīng)濟高效一個檢測盒可同時檢測I 4種不同的轉(zhuǎn)基因成份，大大降低了使用成本；簡便快速4種不同的轉(zhuǎn)基因成份ー步法操作，同時檢測，不需其他任何附加儀器設(shè)備。直接將待測樣品液滴加在加樣孔中，5-10分鐘可出結(jié)果；[0033]檢測結(jié)果直觀不借助任何儀器，用肉眼可觀察到結(jié)果；應(yīng)用廣泛可檢測棉花、小麥、水稻、玉米、油菜、煙草、大豆等多種農(nóng)作物的葉片、種子及加工產(chǎn)品。由于本實用新型提供的聯(lián)檢試劑盒可同時對生物樣品進行多種轉(zhuǎn)基因分析，特別適用于實驗室、田間、邊防、海關(guān)植物檢驗、檢驗檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部門對可疑樣本現(xiàn)場、快速篩查。

圖I和圖2是本實用新型ー種轉(zhuǎn)基因成分四聯(lián)檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖I是底板的俯視圖，圖2是試劑盒上蓋的俯視圖；圖I中3是測試帶，圖2中I是加樣孔，2是觀測窗。
具體實施方式
本實用新型試劑盒中的測試帶的制備用制備檢測GR79-EPSPS的測試帶來舉例說明實施例I制備測試帶1.GR79-EPSPS單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟O. 5mL。I周后，將GR79-EPSPS單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞I 3X 106。10天后收獲腹水，以上過程皆在無菌條件下完成。2. GR79-EPSPS單克隆抗體的純化I)以DEAE離子交換層析及S印hacryl S 300分子篩對單抗進行純化；SDS_PAGE平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；2)純化過程取小鼠單抗腹水一3，OOOXg離心15min —上清液加50% (NH4)2SO4沉淀，過夜一3，OOOXg離心20min —沉淀溶于O. OlM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2) — S-300凝膠柱一DEAE Blue層析柱一0-800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95%以上；4)蛋白濃度測定紫外分光光度計測定279nm處的OD值，按以下公式計算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測定選用GR79-EPSPS抗原包被ELISA板(I μ g/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP復(fù)合物，測定各單抗效價(大于I : 5000)。3.羊抗DOAt高效價免疫抗血清的制備和純化I)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強免疫2次，毎次間隔I個月一第二次加強后10天左右取血一離心取血清一(NH4)2SO4沉淀一DEAE離子交換層析純化；2)效價測定ELISA夾心法，抗體效價稀釋度應(yīng)大于I : 256;3)蛋白濃度測定紫外分光法測定OD279，計算蛋白濃度。4.膠體金及金標(biāo)抗體制備 I)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40_60nm的膠體金。將O. 01 % HauCl4加熱至沸，加入一定量的I %檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)，繼續(xù)加熱煮沸5min，待膠體金溶液顔色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期保存，可加入
O.02% NaN3。2)將膠體金液500mL用O. IM NaOH調(diào)pH 8. 4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL，攪拌20min。5，500Xg離心30min,除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用O. 45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進行檢定，其余置4°C保存。5.膜反應(yīng)體系Ml的制備I)將GR79-EPSPS抗體及純化的羊抗鼠IgG以O(shè). IM磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約 O. 2_2mg/mL。2)純化的羊抗鼠IgG溶于O. IM磷酸鹽緩沖液中，濃度為2. Omg/mL ；3)硝酸纖維素膜大小10cmX 27cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機的2個噴頭儲存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm，NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗GR79-EPSPSAD2 (2mg/mL)在NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以I. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對照線，對照線與檢測線的距離為4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24h，用BB封閉液封閉處理O. 5h，用WB洗液抽洗I次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜I. 8cmX 27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置
室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，
室溫保存。l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 8cm/條；3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 2cm/條。7.膜反應(yīng)體系M4的制備I)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機Biodot的Airjet噴頭儲存瓶中；3)設(shè)定壓カ為15PSI，玻璃纖維膜的移動速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為O. 5-1. 5cmX 25cm/條，姆條噴2遍；5)于37°C烘干12h，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封ロ，室溫保存。8.反應(yīng)體組裝I)在M6塑料基板上貼4條雙面膠帶M7 ；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22_ ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對齊并與Ml上緣交1_ ;4)在M7上貼M2a(12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (IOmm)，壓住 Ml 下緣 O. 5_ ;6)在 M7 上貼 M3 (12mm),上緣壓住 M4 約 2/3 ；[0082]7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對齊；8)在M4和M7上貼透明保護膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約I. 5mm ;9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9,與Ml上緣交Imm,另一端翻過M6上緣,貼于M6被面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動切條機切成3. 5mm規(guī)格。實施例2試劑盒裝配試劑盒呈正八邊形扁盒，盒底板的上、下、左、右各設(shè)置有一條凹槽，放置4條測試帶；上蓋與測試帶相應(yīng)位置有4個觀測窗，I個加樣孔設(shè)置在上蓋最中間(見圖I、圖2)。將制備好的檢測CP4-EPSPS、G2-EPSPS、A1501-EPSPS 和 GR79-EPSPS 蛋白的四種測試帶分別嵌入底板的4個凹槽中，然后將上蓋與底板扣緊，即成試劑盒。 將試劑盒、滴管和使用說明書裝塑料袋封裝后，即可。實施例3試劑盒使用過程I.檢測樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為獲得最佳檢測效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣本混勻，靜置，取上清液作為檢測樣品。
葉子及籽苗種子
植物種類
__葉子/蒸懼水(g/mL·)__種子/蒸懼水(g/mL)_^__L^o___
_大豆__I 10__I _ 4 _
其余雙子葉植物__I 10__I 4_
其余單子葉植物_I 20__I 2_2.檢測及結(jié)果將檢測盒平放，用所配塑料吸管吸取樣品液，滴加15-20滴于檢測盒的加樣孔I中，吸水材料使待檢樣品緩慢移動，膜反應(yīng)體系被啟動。無論待測基因是否存在于植物樣品中，一條紫紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果判定每ー個觀測窗檢測ー種待檢基因是否存在。以下以檢測GR79-EPSPS為例說明I)如樣本中不含特定GR79-EPSPS蛋白，或其濃度低于檢測靈敏度，膠體金抗體在層析過程中不會被固定在膜上檢測帶內(nèi)的單抗免疫，因而測試區(qū)內(nèi)(T)不會出現(xiàn)一條紫紅色檢測帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帯。2)如果待植物樣品中GR79-EPSPS蛋白濃度高于其檢測閾值時，抗原免疫金與檢測帶上的另ー單抗結(jié)合，在測試區(qū)內(nèi)(T)將還出現(xiàn)另ー紫紅色檢測帶，顯示陽性(+)結(jié)果，即在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帯。注意測試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顔色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都應(yīng)判定為陽性結(jié)果。[0100]3)如質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測結(jié)果無效，表明不正確的操作過程或 試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求1.ー種轉(zhuǎn)基因成分四聯(lián)檢測試劑盒，包括底板和上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征在于底板上放置有4條測試帶；上蓋有4個觀測窗和I個加樣孔，試劑盒的形狀為扁平的多邊形或圓形盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述底板的上表面設(shè)置有4條可嵌入測試帶凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述底板或上蓋具有卡槽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述觀測窗是長方形，且試劑盒的形狀為扁平的正八邊形盒。
專利摘要本實用新型涉及一種轉(zhuǎn)基因成分四聯(lián)檢測試劑盒。本試劑盒由底板、上蓋組成；底板內(nèi)有4條測試帶；上蓋有4個觀測窗和1個加樣孔。利用本試劑盒可一步同時確認(rèn)1～4種不同來源的轉(zhuǎn)基因成份是否已轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞(包括原核和真核細(xì)胞)并表達(dá)，也可對多種轉(zhuǎn)入基因進行半定量檢測，不需其他任何附加儀器設(shè)備。
文檔編號G01N33/68GK202443022SQ201220078379
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者張維, 林敏 , 陸偉, 陳明, 陳震 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所