專利名稱：一種黃曲霉毒素b1殘留快速檢測(cè)試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是一類真菌(如黃曲霉和寄生曲霉)的有毒代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些和人類血液、動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素(AFT)目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其中黃曲霉毒素BI (AFBl)的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素BI的羥基化代謝產(chǎn)物，也是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。當(dāng)哺 乳動(dòng)物攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后，在體內(nèi)經(jīng)羥基化會(huì)將黃曲霉毒素Ml分泌于乳汁當(dāng)中，奶牛經(jīng)攝入黃曲霉毒素BI污染的飼料后產(chǎn)出的牛奶中便含有黃曲霉毒素Ml。由于黃曲霉毒素Ml相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無(wú)法將其消除，所以檢測(cè)黃曲霉毒素Ml不僅要檢測(cè)動(dòng)物飼料原料，而且要檢測(cè)最終產(chǎn)品。為此世界各國(guó)都規(guī)定了牛乳及其制品中黃曲霉毒素Ml的最大允許含量并將其作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，如中國(guó)政府規(guī)定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等)中黃曲霉毒素Ml的最聞允許含量為O. 5 ng/ml?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的黃曲霉毒素殘留檢測(cè)主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和免疫學(xué)分析法等。采用理化分析方法雖然是一種較理想的藥物殘留分析方法，但黃曲霉毒素BI分子中沒(méi)有紫外發(fā)光團(tuán)和熒光團(tuán)，在化學(xué)分析中需要將它轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤獍l(fā)光團(tuán)或熒光團(tuán)的衍生物才能進(jìn)行分析，這給檢測(cè)工作帶來(lái)了極大困難，而且具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，儀器價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)。ELISA檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、能進(jìn)行批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)報(bào)道的黃曲霉毒素BI殘留檢測(cè)試劑盒較少。膠體金標(biāo)記免疫分析法是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速、成本低、無(wú)污染、無(wú)需培訓(xùn)，非常適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。與ELISA相比，具有樣品前處理簡(jiǎn)單，顯色時(shí)間短(3-5 min)，且所有試劑包含在一根試紙條上，無(wú)需使用儀器等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。因此，研制快速、靈敏、高效的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡對(duì)于保障動(dòng)物性食品安全具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好，可進(jìn)行批量檢測(cè)的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述的試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開(kāi)有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜上有黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線(T線)和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線(C線)，兩者間距5 mm，其中黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線(T線)位于靠近樣品墊的一側(cè)，所述的結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體。本實(shí)用新型所述的支撐層是由聚氯乙烯樹(shù)脂與穩(wěn)定劑及輔料配合制成的PVC板。本實(shí)用新型所述的吸收墊是由吸水能力極強(qiáng)的植物長(zhǎng)纖維為原材料制成的純白濾紙。本實(shí)用新型所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊是由玻璃纖維棉制作而成的。本實(shí)用新型所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊的疊壓寬度為2 mm,吸收墊與硝酸纖維素膜的疊壓寬度為2 _。本實(shí)用新型所述的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸收墊上方覆蓋有膠膜保護(hù)層。本實(shí)用新型所述的硝酸纖維素膜兩端分界處有標(biāo)記線。本實(shí)用新型具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)靈敏度高、特異性強(qiáng)。黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子通過(guò)異性電荷間范德華力相結(jié)合，膠體金對(duì)單克隆抗體的特異性和親和力影響很小。因此，快 速檢測(cè)試紙卡具有較高的靈敏度和特異性，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)O. 5 ng/ml ；(2)操作簡(jiǎn)單、方便快捷。使用快速檢測(cè)試紙卡時(shí)無(wú)需其它任何試劑，只要將處理后的樣品溶液用滴管滴入試紙卡加樣孔內(nèi)3 4滴，3飛min即可觀察結(jié)果；(3)檢測(cè)結(jié)果形象、直觀。試紙卡以紅色印跡線“ I ”或“ Il ”作為檢測(cè)線的陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“ I ”印跡時(shí)，表示被檢測(cè)樣品溶液中黃曲霉毒素BI殘留含量> O. 5 ng/ml ;若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)同時(shí)出現(xiàn)兩條紅色“ Il ”印跡時(shí)，表示樣品溶液中黃曲霉毒素BI殘留含量<0.5 ng/ml。結(jié)果形象直觀，簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，不容易出現(xiàn)誤判；(4)膠膜的使用可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，試紙卡穩(wěn)定性好。本試紙卡樣品吸收墊將檢測(cè)溶液完全吸收，使之與偶聯(lián)墊上金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，可以有效減少誤差率；還可以防止外界雜質(zhì)干擾，影響金標(biāo)抗體與檢測(cè)抗原的結(jié)合；(5)成本低、投資少。使用本實(shí)用新型試紙卡，不需要另配復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)一步到位，成本低廉，見(jiàn)效快；(6)易于大范圍推廣應(yīng)用。本試紙卡操作簡(jiǎn)單，適合不同類別的人員使用，如實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生監(jiān)督、規(guī)模養(yǎng)殖及個(gè)體生產(chǎn)等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

圖I是本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實(shí)用新型中試紙條的側(cè)視圖；圖3是本實(shí)用新型中試紙條的俯視圖；圖4是本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為陰性的使用狀態(tài)參考圖；圖5是本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的使用狀態(tài)參考圖；圖6是本實(shí)用新型檢測(cè)結(jié)果無(wú)效的使用狀態(tài)參考圖。
具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖詳細(xì)描述實(shí)施例。一種黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，包括塑料盒體I和封裝于塑料盒體I內(nèi)的試紙條2，所述的試紙條2的底層為支撐層3，該支撐層3上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊4、金標(biāo)抗體結(jié)合墊5、硝酸纖維素膜6和吸收墊7，所述的塑料盒體I上開(kāi)有加樣孔8和觀察窗9，該加樣孔8的位置與試紙條2上的樣品墊4位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗9與試紙條2上的硝酸纖維素膜6位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜6上有黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線(T線)11和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線(C線)10，兩者間距5 mm，其中黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線(T線)11位于靠近樣品墊4的一側(cè)，所述的結(jié)合墊5上灌注有膠體金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體。本實(shí)用新型所述的支撐層3是由聚氯乙烯樹(shù)脂與穩(wěn)定劑及輔料配合制成的PVC板。本實(shí)用新型所述的吸收墊7是由吸水能力極強(qiáng)的植物長(zhǎng)纖維為原材料制成的純白濾紙。本實(shí)用新型所述的樣品墊4和金標(biāo)抗體結(jié)合墊5是由玻璃纖維棉制作而成的。本實(shí)用新型所述的樣品墊4和金標(biāo)抗體結(jié)合墊5的疊壓寬度為2 mm,吸收墊7與硝酸纖維素膜6 的疊壓寬度為2 _。本實(shí)用新型所述的樣品墊4、金標(biāo)抗體結(jié)合墊5和吸收墊7上方覆蓋有膠膜保護(hù)層12。本實(shí)用新型所述的硝酸纖維素膜6兩端分界處有標(biāo)記線13。本實(shí)用新型所述的試紙卡的制備方法I)硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，檢測(cè)抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓緊，開(kāi)機(jī)后將抗原和二抗分別點(diǎn)射于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)。室溫自然干燥后，將其浸入封閉液(質(zhì)量濃度為1%的BSA的PBS緩沖液，pH 7. 4)中30 min, 37 °C烘干后，加入干燥劑，4 °C密封保存。2)結(jié)合墊的制備將玻璃纖維棉裁成4 mm寬的細(xì)條，放入含質(zhì)量濃度為5%的BSA,質(zhì)量濃度為2%的蔗糖，質(zhì)量濃度為O. 8%的NaCl和質(zhì)量濃度為O. 05%的NaN3的PBS處理液中20 min, 37 1恒溫烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4 h，即為結(jié)合墊。3)樣品墊的制備玻璃纖維棉要用含質(zhì)量濃度為2%的BSA，質(zhì)量濃度為1%的蔗糖，質(zhì)量濃度為O. 5%的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為O. 1%的NaN3的PBS處理后，干燥備用，即為樣品墊。4)吸收墊的制備將吸水能力極強(qiáng)的植物長(zhǎng)纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機(jī)切成4 mm寬的細(xì)條，并用膠膜進(jìn)行一側(cè)封閉，干燥備用。5)試紙條的制備在支撐板(PVC板)上，將硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊和膠膜等按一定工藝組裝在一起，用CM4000切割機(jī)制成4 mm寬的試紙條，放入帶干燥劑的密閉容器中儲(chǔ)存。6)試紙卡的組裝按一定工藝將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的特制的塑料盒體中，即為本實(shí)用新型試紙卡。本實(shí)用新型所述的試紙卡的檢測(cè)原理試紙卡根據(jù)抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析原理設(shè)計(jì)。滴加樣品液后，在吸收墊和硝酸纖維素膜的毛細(xì)作用下，樣品溶液向上遷移，到達(dá)結(jié)合墊時(shí)，金標(biāo)抗體將被溶解。當(dāng)樣品中含有黃曲霉毒素BI時(shí)，它們將和金標(biāo)抗體結(jié)合，并一起向上遷移，到達(dá)固定有AFBl-OVA的檢測(cè)線位置時(shí)，檢測(cè)抗原將和黃曲霉毒素BI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)抗體上有限的抗原結(jié)合位點(diǎn)。樣品中AFBl含量越高，檢測(cè)抗原和金標(biāo)抗體結(jié)合數(shù)量就越少，T線顯色就越弱；當(dāng)樣品中AFBl高于一定數(shù)值(O. 5 ng/ml)時(shí),檢測(cè)抗原就無(wú)法和金標(biāo)抗體結(jié)合，T線不顯色。無(wú)論樣品中是否有AFBl存在，過(guò)量的金標(biāo)抗體或檢測(cè)抗原與金標(biāo)抗體的結(jié)合物都將和二抗RaMIgG結(jié)合，在C線形成 紅色。本實(shí)用新型所述的試紙卡的使用方法I)樣品前處理飼料樣取3 g粉碎飼料樣品,加入9 ml樣品提取液；劇烈振蕩10 min ；4000 r/min離心5 min,或用定量分析濾紙過(guò)濾；上清液稀釋后待測(cè)。食用油稱取5 ml食用油樣品于50 ml離心管中；加入10 ml石油醚(或正己烷)混勻；再加入15 ml樣品提取液,振蕩5 min ；6000 r/min離心5 min ;棄掉上層液體,用樣品稀釋液稀釋后待測(cè)。2)樣品滴加將試紙卡平放后，用滴管將樣品溶液滴入試紙卡加樣孔內(nèi)3 4滴，3飛min后即可觀察結(jié)果。3)檢測(cè)結(jié)果分析陰性若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)同時(shí)出現(xiàn)兩條紅色“ Il ”印跡時(shí),表示樣品溶液中黃曲霉毒素BI殘留含量< O. 5 ng/ml,判為陰性,如圖4所示。陽(yáng)性若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“ I ”印跡，而檢測(cè)線(T線)不顯色，表示被檢測(cè)樣品溶液中黃曲霉毒素BI殘留含量> O. 5 ng/ml，判為陽(yáng)性，如圖5所
/Jn ο無(wú)效若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)不顯示紅色條帶，則無(wú)論檢測(cè)線(T線)是否出現(xiàn)紅色印跡，該試紙卡均判為無(wú)效，如圖6所示。
權(quán)利要求1.一種黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述的試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開(kāi)有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜上有黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，兩者間距5 _，其中黃曲霉毒素BI —載體蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測(cè)線位于靠近樣品墊的一側(cè)，所述的結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的支撐層是PVC板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的吸收墊是由植物長(zhǎng)纖維為原材料制成的純白濾紙。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊是由玻璃纖維棉制作而成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊的疊壓寬度為2 mm,吸收墊與硝酸纖維素膜的疊壓寬度為2 _。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸收墊上方覆蓋有膠膜保護(hù)層。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃曲霉毒素BI殘留快速檢測(cè)試紙卡，其特征在于所述的硝酸纖維素膜兩端分界處有標(biāo)記線。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種黃曲霉毒素B1殘留快速檢測(cè)試紙卡。本實(shí)用新型的技術(shù)方案要點(diǎn)為一種黃曲霉毒素B1殘留快速檢測(cè)試紙卡，包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述的試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開(kāi)有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對(duì)應(yīng)。本實(shí)用新型操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好，可進(jìn)行批量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK202794181SQ20122045741
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者姜金慶, 齊永華, 徐之勇, 郭芳, 葛會(huì)會(huì), 趙莉 申請(qǐng)人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技學(xué)院