用于富集、分離和檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于富集、分離和檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽及其應(yīng)用，所述多肽的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列；還包括多肽-磁性納米顆粒，其含有磁性納米顆粒和與其相偶聯(lián)的上述所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽；及所述多肽或多肽-磁性納米顆粒在制備用于富集、分離或檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品或用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提出了一種利用多肽細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性識(shí)別的新方法，并發(fā)明了一種新的富集、分離和檢測(cè)CTC的多肽-磁性納米顆粒物質(zhì)，提供了一種富集、分離和檢測(cè)CTC的快速、準(zhǔn)確和低成本的檢測(cè)技術(shù)，為臨床腫瘤轉(zhuǎn)移患者的診斷、治療及預(yù)后提供了有效方法。
【專利說(shuō)明】用于富集、分離和檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種多肽，尤其涉及一種可以用于富集、分離和檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell, CTC)的多肽-磁性納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，該方法準(zhǔn)確、快速，大大降低了富集、分離和檢測(cè)上皮細(xì)胞粘附因子(EpithelialCell Adhesion Molecule, EpCAM)高表達(dá)的 CTC 細(xì)胞的成本。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是威脅人類的重大疾病之一，侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的特征之一，腫瘤細(xì)胞自發(fā)或因診療操作從原發(fā)腫瘤脫落，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT),從而具有流動(dòng)特性,進(jìn)入外周血中，就形成了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。因此在外周血中檢測(cè)到CTC預(yù)示著有可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，另外，美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的最新研究表明，原位腫瘤組織能夠吸引CTC細(xì)胞再次浸潤(rùn)到原發(fā)腫瘤上從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)(可參考K.Pantel等人，Nat.Rev.Clin.0ncol.2009，6，339-351 ；J.Kaiser等人，Science2010, 327, 1072-1074)，因此CTC的高效檢測(cè)對(duì)于研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制有指導(dǎo)意義，而且可以對(duì)指導(dǎo)腫瘤治療、判斷治療效果、推斷預(yù)后提供可靠參考，對(duì)監(jiān)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)都有非常重要的意義。
[0003]自1869年澳大利亞醫(yī)生Thomas Ashworth在顯微鏡下首次從一名男性腫瘤轉(zhuǎn)移患者的血液里觀察到CTC以來(lái)，CTC的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。CTCs在血液中的含量極少(約幾個(gè)CTCs/105~IO7個(gè)單個(gè)核細(xì)胞)，人們對(duì)CTC的富集檢測(cè)方法進(jìn)行了不斷的探究。這些方法可以分為兩類:機(jī)械法和免疫分離法(可參考P.Paterlin1-BrechOt &N.L.Benali, CancerLett.2007,253, 180-204)。前者是根據(jù)CTC與血液中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞的細(xì)胞直徑及細(xì)胞密度不同，通過(guò)過(guò)濾或密度梯度離心的方法實(shí)現(xiàn)的；后者則主要是利用CTC表面的一些特異性標(biāo)記物如:常見(jiàn)的上皮標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白(Cytokeratins, CKs)>上皮細(xì)胞粘附因子(EpCAM)、腫瘤胚胎抗原(Carcino Embryonic Anti gene, CEA)和人表皮生長(zhǎng)因子受體 2 (HumanEp i derma I Growth Factor Receptor2, HER2)等，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)CTC與血液中其他細(xì)胞的分離(可參考H.Xu等人，Biomaterials2011，32，9758-9765 ；S.L.Stott 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2010,107，18392-18397 ；S.Nagrath 等人，Nature2007,450, 1235-1239 ;Α.-E.Saliba 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2010,107, 14524-14529 ;X.Wang 等人，Cancer Res.2011，71，1526-1532)。
[0004]與免疫分離方法相比，機(jī)械分離方法靈敏度底，分離的特異性差。因此人們不斷改進(jìn)免疫分離技術(shù)，試圖提高分離效率。第一種被廣泛用來(lái)檢測(cè)CTC的是CellSearch，它是通過(guò)在磁珠上包被抗-EpCAM抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)上皮組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，如乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞。CellSearch在臨床上成功地用來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后效果，于2004年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用來(lái)作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后診斷方法；為了提高CTCs檢測(cè)的準(zhǔn)確度，麻省總醫(yī)院(MGH)團(tuán)隊(duì)用一種叫做CTC Chip的新裝置來(lái)檢測(cè)CTC，CTC Chip有78000個(gè)微小的包被了抗-EpCAM抗體的作用位點(diǎn)，這樣當(dāng)血液流過(guò)時(shí)，只有腫瘤細(xì)胞被識(shí)別出來(lái)，MGH團(tuán)隊(duì)用于肝癌轉(zhuǎn)移患者的臨床測(cè)試結(jié)果于2007年在Nature上發(fā)表。其后，該組又用CTC Chip收集肺癌患者的CTC并對(duì)其進(jìn)行了基因分析。最近，Andrew Wang課題組報(bào)到用抗體包被的納米氧化鐵顆粒分選CTCs的效率比用微球的分選方法效率大大提高，最大分選率達(dá)到84%。
[0005]在這些免疫分析中，上皮細(xì)胞粘附因子(EpCAM)和CKs是CTC檢測(cè)的常用表面標(biāo)志物。然而，由于抗體生產(chǎn)成本及生產(chǎn)技術(shù)的限制，導(dǎo)致這種基于EpCAM和CKs抗體檢測(cè)CTC的技術(shù)成本較高，如CellSearch檢測(cè)一個(gè)血樣需要約600美元，因此尋找能與EpCAM和CKs特異性靶向結(jié)合的新型的化合物有重要的意義。
[0006]近年來(lái)，研究者們?cè)诶枚嚯倪M(jìn)行腫瘤細(xì)胞的識(shí)別，靶向腫瘤細(xì)胞表面方面展開(kāi)了廣泛的研究，人們已經(jīng)從天然及合成的多肽中篩選出大量能分別靶向不同腫瘤細(xì)胞不同作用位點(diǎn)的多肽化合物(可參考M.Shadidi &M.Sioud，F(xiàn)ASEB J.2003,17, 256-258 ；M.Shadidi & M.Sioud, DrugResist.Updates2003，6，363-371)。對(duì)于高轉(zhuǎn)移腫瘤的 CTC 的檢測(cè)，發(fā)展特異性識(shí)別EpCAM、CKs的多肽具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前檢測(cè)CTC成本高的不足，提供一種富集、分離和檢測(cè)CTC的新思路和新方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是設(shè)計(jì)能夠特異性識(shí)別CTC的多肽片段替代現(xiàn)有的抗-CTC抗體，從而降低檢測(cè)成本。本發(fā)明的另一個(gè)目的是結(jié)合現(xiàn)有的納米技術(shù)，將特異性識(shí)別多肽與納米顆粒偶聯(lián)，即提供一種多肽-納米顆粒，提高對(duì)血液中稀少CTC的檢測(cè)效率。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供特異性識(shí)別多肽-納米顆粒在監(jiān)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)腫瘤治療效果評(píng)價(jià)方面的用途。
[0008]除非另外指明，本文中的“多肽-磁性納米顆?！笔侵浮岸嚯脑诒砻嫘揎椀拇判约{米顆粒”。
[0009]除非另外指明，本文中的“ 2E7，2E8，2E9 ”分別表示“陰性細(xì)胞數(shù)為2 X IO7個(gè)，
2X IO8 個(gè)，和 2 X IO9 個(gè)”。
[0010]除非另外指明，本文中的“結(jié)合率”是指“一個(gè)磁性納米顆粒的活性位點(diǎn)上修飾了多少條多肽”。
[0011 ] 除非另外指明，本文中的“分離率”是指“分離的細(xì)胞樣品的個(gè)數(shù)占加入的細(xì)胞樣品個(gè)數(shù)的比例”。
[0012]針對(duì)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0013]一方面，本發(fā)明提供一種用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列為下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列:
tool 4] VrrdaprfsmqgldacggnX1X2 (X3) nl (X4) n2
[0015]其中，X1為 Cys 或 Asn ;
[0016]X2 SCys 或 Asn;
[0017]X3 為 Asn，nl=0 或 I ;
[0018]X4 為 Asn，n2=0 或 I。
[0019]優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，所述多肽可通過(guò)特異性結(jié)合細(xì)胞上皮粘附因子(Epithelial Cell AdhesionMolecule, EpCAM)識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞。[0020]另一方面，本發(fā)明提供一種多肽-磁性納米顆粒，其含有磁性納米顆粒和與其相偶聯(lián)的上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽。
[0021]優(yōu)選地，所述多肽和磁性納米顆粒的質(zhì)量比為0.01:5~4:5。
[0022]優(yōu)選地，所述多肽和磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:5~3:5。
[0023]優(yōu)選地，所述磁性納米顆粒為鏈親和素修飾的磁性納米顆粒。
[0024]優(yōu)選地,所述磁性納米顆粒的粒徑為60(Tl500nm。
[0025]優(yōu)選地,所述磁性納米顆粒的粒徑為800nm。
[0026]還一方面，本發(fā)明提供一種上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒的制備方法，所述方法包括如下步驟:
[0027]1)制備上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽；
[0028]2)將步驟I)中的多肽制成生物素修飾的多肽溶液；
[0029]3)將鏈親和素修飾的磁性納米顆粒溶于緩沖液中制成溶液，優(yōu)選地，還包括將磁性納米顆粒溶液通過(guò)超聲或渦旋的方法進(jìn)行分散的步驟；
[0030]4)將步驟2)中生物素修飾的多肽溶液與步驟3)的磁性納米顆粒溶液混合后，混勻，將多肽偶聯(lián)到磁性納米顆粒表面，即得。
[0031]優(yōu)選地，所述生物素修飾的多肽溶液與鏈親和素修飾的磁性納米顆粒溶液以
0.01:5^4:5的質(zhì)量比混合，優(yōu)選質(zhì)量比為1:5~3:5，該質(zhì)量比能夠獲得更好的效果。
[0032]優(yōu)選地，于4~37 °C混合0.5~2h。
[0033]優(yōu)選地，于20~30°C混合 10mirT2h。
[0034]優(yōu)選地，混合3(T40min，該時(shí)間在確保獲得較好的效果下，用時(shí)較少。
[0035]優(yōu)選地，于恒溫?fù)u床上混合。
[0036]更優(yōu)選地，于4°C的恒溫?fù)u床上混合。
[0037]還優(yōu)選地，搖床的轉(zhuǎn)速為150rpm。
[0038]再一方面，本發(fā)明提供一種上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽或上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒在制備用于富集、分離或檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0039]優(yōu)選地,所述產(chǎn)品為試劑盒或試劑。
[0040]又一方面，本發(fā)明提供一種上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽或上述本發(fā)明所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒在制備用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0041]優(yōu)選地，所述腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病為細(xì)胞上皮粘附因子(EpCAM)高表達(dá)相關(guān)的腫瘤。
[0042]更優(yōu)選地，所述細(xì)胞上皮粘附因子高表達(dá)相關(guān)的腫瘤包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。
[0043]還一方面，本發(fā)明提供了一種多肽-磁性納米顆粒富集分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0044]步驟A:制備生物素修飾的多肽溶液，制備磁性納米顆粒分散的溶液，及生物素修飾多肽與磁性納米顆粒的混合溶液，于搖床混合。
[0045]步驟B:將混合后的步驟A中的溶液,用強(qiáng)磁性磁鐵吸引收集后，吸出溶液,而后用pH=7.2的PBS緩沖溶液將磁鐵富集的顆粒重懸，再用磁鐵富集，如此反復(fù)3遍，用pH=7.2的PBS重懸待用。
[0046]步驟C:將4體積％多聚甲醛固定，Hoechst.33342染色的EpCAM陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)與EpCAM陰性的人早幼粒急性白血病細(xì)胞(HL-60)以50: 2E7，50: 2E8，50: 2E9的比例混合分別混合成Iml的PBS溶液。
[0047]步驟D:取少量步驟B中修飾后的磁性納米顆粒加入步驟C中的細(xì)胞混合液或待測(cè)血樣，于搖床上混合。
[0048]步驟E:取下步驟D中的混合液，用強(qiáng)磁性磁鐵吸引收集磁性納米顆粒，棄去細(xì)胞液，用PBS重懸富集的磁性納米顆粒，再用磁鐵富集，如此反復(fù)3次。
[0049]步驟F:于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分離出的細(xì)胞并拍照。
[0050]優(yōu)選地，所述步驟A具體包括以下步驟:
[0051]步驟A.1:將多肽溶解于緩沖液中，優(yōu)選地，將多肽溶解到pH=6.8^7.5的磷酸鹽緩沖液中，更優(yōu)選地，將多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中； [0052]步驟A.2:將分散于水中的磁性納米顆粒提取出來(lái)，溶分散在少量的pH=6.8^7.5磷酸鹽緩沖液中，優(yōu)選地，將磁性納米顆粒多肽溶解到pH=7.2的PBS溶液中，并在渦旋儀上潤(rùn)旋3~5min ；
[0053]步驟A.3:將A.1中制得的多肽溶液加入到A.2中的磁性納米顆粒中制得共混液，優(yōu)選地，多肽與磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:5~3:5,優(yōu)選地,該混合液于25°C, 150rpm的恒溫?fù)u床上混合30~40min ；
[0054]優(yōu)選地，步驟B及步驟E中，富集磁性納米顆粒時(shí)，用強(qiáng)磁性磁鐵，優(yōu)選地，富集顆粒過(guò)程中，不斷晃動(dòng)被富集溶液，更優(yōu)選地，磁鐵富集過(guò)程持續(xù)至少IOmin/次；
[0055]優(yōu)選地，所述步驟C具體包括以下步驟:
[0056]步驟C.1:取一定量的MCF-7，用4體積％的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞20~40min，優(yōu)選地，室溫下固定30min。
[0057]步驟C.2:利用PBS緩沖液除去洗去細(xì)胞固定液，用60-120 μ g/ml的Hoechest.33342在室溫作用下進(jìn)行細(xì)胞染色30~50min，優(yōu)選地，80 μ g/ml作用的Hoechest.33342在室溫下進(jìn)行細(xì)胞染色30min。
[0058]優(yōu)選地，步驟D中，加入的磁性納米顆粒的量為5~10 μ I，更優(yōu)選地，加入5 μ I。
[0059]具體的為了獲得本發(fā)明的技術(shù)方法，本發(fā)明進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的試驗(yàn)和研究:
[0060]I)設(shè)計(jì)并合成了一系列異硫氰酸突光素(FITC, fluoresceinisothiocyanate)-多肽-生物素(Biotin)，以EpCAM陽(yáng)性的MCF-7和EpCAM陰性的HL-60細(xì)胞為測(cè)試對(duì)象，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的P印7-2和P印7-3能夠特異性結(jié)合EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞，EpCAM陰性細(xì)胞結(jié)合率低，并且結(jié)合常數(shù)比較合適；而對(duì)于陰性細(xì)胞，作為對(duì)照的P印7表現(xiàn)出一定的陰性結(jié)合特性，但是陰性結(jié)合率較高，選擇性較低；
[0061]所述試驗(yàn)過(guò)程包括如下步驟:
[0062]al:將設(shè)計(jì)的多肽制成溶液；
[0063]bl:取一定量的步驟al得到的溶液，與MCF-7和HL-60細(xì)胞共混，4°C孵育30min。
[0064]cl:利用PBS緩沖液洗去未結(jié)合的多肽后制成一定密度O IO6個(gè)/ml)的細(xì)胞懸液。
[0065]將懸液于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)多肽與細(xì)胞的結(jié)合情況。[0066]2)將I)中證明特異性識(shí)別EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞的多肽溶液加入到磁性納米顆粒中，制備成多肽-磁性納米顆粒；
[0067]所述特異性識(shí)別EpCAM的多肽-磁性納米顆粒的制備方法包括如下步驟:
[0068]a2:將所述FITC-多肽-Biotin與磁性納米顆粒充分混合，形成混合液；
[0069]b2:并將上述a2中的溶液于25 °C搖床上以150rpm的轉(zhuǎn)速混合30~40min。
[0070]c3:除去未結(jié)合的多肽溶液，將多肽-磁性納米顆粒重懸于PBS中。
[0071]利用熒光顯微鏡及激光粒度儀對(duì)合成的多肽-磁性納米顆粒進(jìn)行表征。
[0072]在制備多肽-磁性納米顆粒中，采用恒溫?fù)u床來(lái)充分混合。去除未結(jié)合的多肽溶液，優(yōu)選使用強(qiáng)力磁鐵，優(yōu)選吸附時(shí)間為lOmin，為了防止磁性納米顆粒流失，對(duì)棄去溶液，用吸管從顆粒聚集的另一側(cè)將其緩慢吸出。
[0073]此外，在制備多肽-磁性納米顆粒前，還包括分散磁性納米顆粒的步驟，可以采用超聲/渦旋的方法分散磁性納米顆粒。
[0074]3)將細(xì)胞用4體積％的多聚甲醛固定，Hoechst.33342染色后的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)與人早幼粒急性白血病細(xì)胞(HL-60)以50: 2E7，2E8，2E9的比例混合，分別溶解在Iml的PBS溶液中。
[0075]a3:取一定量的MCF-7細(xì)胞，用4體積％的多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞30分鐘。
[0076]b3:PBS除去細(xì)胞固定液，用80 μ g/ml Hoechest.33342室溫作用細(xì)胞30分鐘。
[0077]c3:細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)兩種細(xì)胞后，取適量混合后定容至995μ I。
[0078]4)取少量多肽-磁性納米顆粒加入步驟3)中的細(xì)胞混合液或待測(cè)血樣，于搖床上混合，利用磁鐵對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行富集和分離。
[0079]具體地，富集和分離MCF-7細(xì)胞的步驟如下:
[0080]a4:取5 μ I多肽_磁性納米顆粒，加入到995 μ I的待分離樣品中。
[0081]b4:將多肽-磁性納米顆粒于細(xì)胞樣品的混合液置于150rpm的恒溫?fù)u床上，4°C下共同孵育30min。
[0082]C4:強(qiáng)磁性磁鐵吸附磁性納米顆粒lOmin，并不斷晃動(dòng)混合液，從富集位置的另一偵牝?qū)⑽唇Y(jié)合的細(xì)胞懸液吸出，再用PBS重懸磁性納米顆粒，再富集磁性納米顆粒，如此反復(fù)3次。
[0083]5)于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。
[0084]具體的統(tǒng)計(jì)與成像包括如下步驟:
[0085]a5:將上面收集到的磁性納米顆粒用PBS緩沖液重懸成10~20 μ I的懸液，為了增強(qiáng)分散性，可在渦旋儀上渦旋3~5min。
[0086]b5:吸取一定量的上述a6懸液于載玻片上，而后用蓋玻片蓋上，即可用突光顯微鏡觀察。
[0087]c5:在顯微鏡下，取不同視野(至少3個(gè))對(duì)明場(chǎng)中的所有細(xì)胞及暗場(chǎng)中發(fā)藍(lán)光的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，拍照。
[0088]綜上所述，本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種分離、富集和檢測(cè)CTC的新方法，設(shè)計(jì)了兩個(gè)具有特異性識(shí)別CTC的多肽片段，有望替代現(xiàn)有的抗體，并結(jié)合磁性納米顆粒技術(shù)簡(jiǎn)單快速富集和分離CTC，從而大大降低臨床CTC檢測(cè)高昂的成本，并且可以為抗原-抗體免疫研究提供新的思路。[0089]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案:在細(xì)胞水平，利用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證多肽能夠特異性結(jié)合EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞；并在分子水平上利用表面等離子激元共振技術(shù)(Surface PlasmonResonance technology, SPR)進(jìn)一步驗(yàn)證了該多肽片段及抗-EpCAM抗體與EpCAM的結(jié)合解離情況。利用動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)及突光技術(shù)對(duì)利用鏈親和素反應(yīng)制得多肽-磁性納米顆粒進(jìn)行表征，具體地，通過(guò)DLS測(cè)得偶聯(lián)前后磁性納米顆粒的zeta電位及粒徑的變化，利用熒光顯微鏡拍照表明對(duì)修飾前后磁性納米顆粒的變化進(jìn)行觀察。利用磁鐵對(duì)磁性納米顆粒的聚集、吸引、收集作用，對(duì)CTC進(jìn)行富集和分離。具體包括如下步驟:
[0090] 步驟1:設(shè)計(jì)并合成一系列FITC-多肽-Biotin，利用流式細(xì)胞技術(shù)及EpCAM陽(yáng)性的MCF-7和EpCAM陰性的HL-60細(xì)胞，驚奇地發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的P印7-2、Pep7_3和P印7能夠特異性結(jié)合EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞，但對(duì)于EpCAM陰性細(xì)胞，P印7表現(xiàn)出一定的陰性結(jié)合特性，選擇性較低；而P印7-2、Pep7-3與EpCAM陰性細(xì)胞HL-60的結(jié)合率很低，選擇性高；
[0091 ] 步驟2:利用SPR技術(shù)檢測(cè)步驟I中具有特異性識(shí)別CTC的多肽片段及抗EpCAM抗體與EpCAM的結(jié)合-解離常數(shù)，結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn)Pep7-2、P印7_3與目標(biāo)蛋白EpCAM的親合力與抗體相當(dāng)，而Pep7與EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞的親合力稍低；
[0092]步驟3:將步驟2證明的特異性識(shí)別多肽進(jìn)行生物素修飾，并將其溶液與鏈親和素修飾的磁性納米顆?；旌?0min,制備成多肽-磁性納米顆粒；
[0093]步驟4:利用DLS、熒光顯微技術(shù)和MALD1-T0F質(zhì)譜法分析對(duì)步驟3中的多肽-磁性納米顆粒進(jìn)行表征；
[0094]步驟5:將利用4體積％的多聚甲醛固定，并利用Hoechst.33342染色后的乳腺癌MCF-7細(xì)胞與人早幼粒急性白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞以50:2E7，50:2E8，50:2E9的比例分別混合成Iml的PBS溶液；其中2E7，2E8，2E9分別表示陰性細(xì)胞數(shù)為2 X IO7個(gè)，2 X IO8個(gè)，和2X109 個(gè)。
[0095]步驟6:取少量多肽-磁性納米顆粒加入步驟3中的細(xì)胞混合液或待測(cè)血樣，于搖床上混合30min，富集和分離CTC。
[0096]步驟7:于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)明暗場(chǎng)下的細(xì)胞并拍照。
[0097]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一系列多肽片段，并發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)具有特異性識(shí)別EpCAM特異性的多肽片段；在分子水平上利用SPR進(jìn)一步分析了這兩條多肽片段及抗-EpCAM抗體與EpCAM的結(jié)合解離情況特性。
[0098]本發(fā)明利用生物素-鏈親和素的強(qiáng)相互作用，將生物素修飾的特異性識(shí)別多肽與鏈親和素修飾的磁性納米顆粒偶聯(lián)，利用DLS表征了偶聯(lián)前后磁性納米顆粒Zeta電位的變化，用熒光顯微鏡觀察了修飾FITC-多肽-Biotin后發(fā)熒光的磁性納米顆粒；并通過(guò)試驗(yàn)證明本發(fā)明所述的多肽-磁性納米顆粒能夠用于CTC的分離、富集和檢測(cè)，且本發(fā)明的兩種多肽修飾后的納米顆粒在對(duì)模擬的CTCs樣品中CTCs的分離率達(dá)到80%以上，重現(xiàn)性很好，其研究對(duì)臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷及腫瘤的預(yù)后有重要的意義。
[0099]本發(fā)明提出了一種利用多肽對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性識(shí)別的新方法，并發(fā)明了一種新的富集、分離和檢測(cè)CTC的多肽-磁性納米顆粒物質(zhì)，提供了一種富集、分離和檢測(cè)CTC的快速、準(zhǔn)確和低成本的檢測(cè)技術(shù)，為臨床腫瘤轉(zhuǎn)移患者的診斷、治療及預(yù)后提供了有效方法?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0100]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0101]圖1表明特異性識(shí)別多肽(摩爾濃度均為50 μ Μ)與MCF-7細(xì)胞作用后的熒光照片；A、B、C 和 D 依次是 PBS,50 μ M P印7、50 μ M P印7-2 和 50 μ M P印7-3 作用 MCF-7 細(xì)胞 30min后的滅光照片；
[0102]圖2表明Pep7-2_磁性納米顆粒和Pep7_3-磁性納米顆粒的熒光顯微鏡照片；其中A、B分別代表Pep7-2-磁性納米顆粒在明視場(chǎng)和藍(lán)光激發(fā)下的照片；C、D分別代表Pep7-3-磁性納米顆粒在明視場(chǎng)和藍(lán)光激發(fā)下的照片；
[0103]圖3表明P印7-2和P印7-3在495nm處的吸光度隨濃度變化的關(guān)系及擬合直線，其中，其中圖3a代表P印7-2的濃度-OD曲線，圖3b代表P印7_3的濃度-OD曲線；
[0104]圖4表明Pep7-2_磁性納米顆粒和Pep7_3-磁性納米顆粒對(duì)MCF-7細(xì)胞富集和分離的熒光顯微鏡照片；其中，A、B分別代表Pep7-2-磁性納米顆粒分離的CTC在明視場(chǎng)和紫光激發(fā)下的照片；C、D分別代表Pep7-3-磁性納米顆粒分離的CTC在明視場(chǎng)和紫光光激發(fā)下的照片；E、F分別代表磁性納米顆粒分離的CTC在明視場(chǎng)和紫光激發(fā)下的照片；
[0105]圖5表明Pep7-2_磁性納米顆粒和Pep7_3-磁性納米顆粒對(duì)MCF-7細(xì)胞的富集和分離效率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖中，MINPs-Pep7-3表示Pep7_3-磁性納米顆粒，MINPs-Pep7_3表示P印7-2-磁性納米顆粒，2E7表示MCF-7細(xì)胞與HL-60細(xì)胞數(shù)比例為50: 2E7，2E8表示MCF-7細(xì)胞與HL-60細(xì)胞數(shù)比例為50: 2E8，2E9表示MCF-7細(xì)胞與HL-60細(xì)胞數(shù)比例為50: 2E9。
【具體實(shí)施方式】
[0106]除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人早幼粒急性白血病細(xì)胞(HL-60 )均購(gòu)自醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)研究所的細(xì)胞庫(kù)。
[0107]除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純?cè)噭铱蓮恼?guī)渠道商購(gòu)獲得。
[0108]實(shí)施例1.多肽特異性識(shí)別EpCAM的驗(yàn)證
[0109]1、所使用的多肽的序列、試劑及驗(yàn)證細(xì)胞
[0110]多肽片段(由上海科肽生物技術(shù)有限公司合成，純度為98質(zhì)量％)，如下表1所示。磁性納米顆粒:鏈親和素-磁性納米顆粒(solulink，ST022912，美國(guó))。
[0111]表1
【權(quán)利要求】
1.一種用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽，所述多肽的氨基酸序列為下述SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列:
VrrdaprfsmqgldacggnX1X2 (X3) nl (X4)也 其中，X1 SCys 或 Asn ；
X2 為 Cys 或 Asn ；
X3 為 Asn, nl=0 或 I ；
X4 為 Asn, n2=0 或 I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID N 0:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
3.一種用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒，其含有磁性納米顆粒和與其相偶聯(lián)的權(quán)利要求1或2所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒，其特征在于，所述多肽和磁性納米顆粒的質(zhì)量比為0.01: 5~4:5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒，其特征在于，所述多肽和磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1: 5~3:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒，其特征在于，所述磁性納米顆粒為鏈親和素修飾的磁性納米顆粒，優(yōu)選地，所述磁性納米顆粒的粒徑為600~1500nm,更優(yōu)選地,所述粒徑為800nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒的制備方法，所述方法包括如下步驟: 1)制備權(quán)利要求1或2所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽； 2)將步驟I)中的多肽制成生物素修飾的多肽溶液； 3)將鏈親和素修飾的磁性納米顆粒溶于緩沖液中制成溶液，優(yōu)選地，還包括將磁性納米顆粒溶液通過(guò)超聲或渦旋的方法進(jìn)行分散的步驟； 4 )將步驟2 )中生物素修飾的多肽溶液與步驟3 )的磁性納米顆粒溶液混合后，混勻，將多肽偶聯(lián)到磁性納米顆粒表面，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒的制備方法，所述生物素修飾的多肽溶液與鏈親和素修飾的磁性納米顆粒溶液以0.01:5^4:5的質(zhì)量比混合，優(yōu)選質(zhì)量比為1:5~3:5，優(yōu)選地，于4~371:混合0.5^2h ;更優(yōu)選地，于2(T30°C混合IOmin~2h混勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于特異性識(shí)別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒的制備方法，混合3(T40min，優(yōu)選地，于恒溫?fù)u床上混合，更優(yōu)選地，于4°C的恒溫?fù)u床上混合，還優(yōu)選地，搖床的轉(zhuǎn)速為150rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽或權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒在制備用于富集、分離或檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為試劑盒或試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽或權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的用于特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽-磁性納米顆粒在制備用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病為細(xì)胞上皮粘附因子高表達(dá)相關(guān)的腫瘤；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞上皮粘附因子高表達(dá)相關(guān)的腫瘤包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103923192SQ201310013908
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月15日
【發(fā)明者】王琛, 白林靈, 杜一萌, 楊延蓮 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心