專利名稱：轉(zhuǎn)基因油菜ms1品系pcr-dhplc檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)弓I物及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜的檢測(cè)方法主要采用常規(guī)PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR_基因芯片等檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測(cè)方法在平臺(tái)擴(kuò)展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對(duì)體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，區(qū)分效率不高，檢測(cè)結(jié)果不理想。實(shí)時(shí)熒光PCR雖然在檢測(cè)靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法有優(yōu)勢(shì)，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測(cè)通量擴(kuò)展 ，并且檢測(cè)成本高。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測(cè)方法，需要多套引物進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟繁瑣，并不適合大規(guī)模的高通量檢測(cè)。變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有分辨率好、擴(kuò)展性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該方法在50°C條件分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對(duì)的數(shù)量決定，樣品的堿基對(duì)數(shù)量不同洗脫順序也不同，從而產(chǎn)生不同的樣品峰。具體的，當(dāng)過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會(huì)根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與DNA marker比較確定分子量大小，從而判定樣品中是否含有目標(biāo)檢測(cè)基因。PCR-DHPLC，是將PCR與DHPLC相結(jié)合的技術(shù)，即先采用PCR擴(kuò)增出靶標(biāo)序列，然后再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析，從而提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。目前，尚沒有轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的目的是提供一種新的用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，基于該引物的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案:本申請(qǐng)公開了一種用于轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，該引物的上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，下游引物含有Seq ID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5，-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3，Seq ID N0.2:5，-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3，。需要說明的是，本申請(qǐng)的引物是針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系而設(shè)計(jì)的特異性引物，能夠?qū)D(zhuǎn)基因油菜MSl品系進(jìn)行特異性擴(kuò)增，因此，可以理解，該引物除了用于本申請(qǐng)的PCR-DHPLC檢測(cè)以外，同樣適用于常規(guī)的PCR檢測(cè)，以及其它的基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)，如實(shí)時(shí)熒光PCR、基因芯片等等。本申請(qǐng)的另一面還公開了一種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括采用本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物，以待檢測(cè)樣品的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。需要說明的是，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物是針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異性引物，因此，可以理解，如果待檢測(cè)樣品中含有足量的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系成分，即可擴(kuò)增出相應(yīng)的靶標(biāo)片段，并在DHPLC分析時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的洗脫峰。進(jìn)一步的,本申請(qǐng)的檢測(cè)方法還包括以DNA marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與DNA marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。優(yōu)選的本申請(qǐng)的檢測(cè)方法包括如下步驟:(A)采用本申請(qǐng)的引物，以待檢測(cè)樣品的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(B)以步驟(A)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為樣品進(jìn)行DHPLC分析，同時(shí)以DNAmarker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DHPLC分析；(C)將步驟(B)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析結(jié)果與DNA marker的DHPLC分析結(jié)果進(jìn)行比較，確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，從而判斷是否含有檢測(cè)的靶標(biāo)序列。需要說明的是，理論上，本申請(qǐng)的引物是根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系設(shè)計(jì)的特異性引物，能夠?qū)Υ龣z測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系成分?jǐn)U增出約307bp的片段，因此，能夠通過DHPLC分析出307bp的洗脫峰；而對(duì)其它成分不會(huì)有擴(kuò)增，即不會(huì)有其它洗脫峰出現(xiàn)。本申請(qǐng)中，判斷是否含有轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的靶標(biāo)序列的依據(jù)即，是否有307bp的洗脫峰。由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于:本申請(qǐng)的轉(zhuǎn)基因油菜 MSl品系檢測(cè)引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于后續(xù)的多重PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。本申請(qǐng)針對(duì)傳統(tǒng)的電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結(jié)合，提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、分辨率高的轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系檢測(cè)方法。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)不同大小的PCR產(chǎn)物片段區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，甚至能夠區(qū)分出I個(gè)堿基大小差異的片段。本申請(qǐng)的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。


圖1:是本申請(qǐng)實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖；圖2:是本申請(qǐng)實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖；圖3:是本申請(qǐng)實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖；圖4:是本申請(qǐng)實(shí)施例中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DHPLC分析的部分結(jié)果圖；圖1中自上而下的曲線分別代表al為轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、bl為DNAmarker、Cl水對(duì)照、dl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF1、el為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF2、fl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RF3、gl為轉(zhuǎn)基因油菜品系RT73、hl為轉(zhuǎn)基因油菜品系MS8，圖2中自上而下的曲線分別代表a2為轉(zhuǎn)基因油菜品系T45、b2為轉(zhuǎn)基因油菜品系Topasl9/2、C2為非轉(zhuǎn)基因油菜、d2為轉(zhuǎn)基因玉米品系3272、e2為轉(zhuǎn)基因玉米品系59122、f2為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btll、g2為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76、h2為轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、i2為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604、J2為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、k2為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863，圖3中自上而下的曲線分別代表a3為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N88017、b3為轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034、c3為轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603、d3為轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、e3為轉(zhuǎn)基因玉米品系T25、f3為非轉(zhuǎn)基因玉米、g3為非轉(zhuǎn)基因玉米、h3為轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、 3為轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)5547-127、J3為轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2、k3為轉(zhuǎn)基因大豆品系M0N89788，圖4中自上而下的曲線分別代表a4為非轉(zhuǎn)基因大豆、b4為大豆盲樣、c4為轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614、d4為轉(zhuǎn)基因棉花品系LLCotton25、e4為非轉(zhuǎn)基因棉花、f4為轉(zhuǎn)基因水稻品系LL Rice62、g4為非轉(zhuǎn)基因水稻、h4為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1、 4為木瓜。marker的各峰值從左至右依次為80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具體實(shí)施方式
本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜谵D(zhuǎn)基因油菜MS I品系的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，該引物針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，能夠用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的特異性擴(kuò)增檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上本申請(qǐng)還提供了基于本申請(qǐng)的引物的轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的PCR-DHPLC檢測(cè)方法。
需要說明的是，本申請(qǐng)的引物是針對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，但是，可以理解，該引物本身也是作為PCR擴(kuò)增使用的，因此，同樣可以用于常規(guī)的PCR擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增、與基因芯片結(jié)合的PCR擴(kuò)增等。
下面通過具體實(shí)驗(yàn)例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)驗(yàn)例僅僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
實(shí)施例1DNA提取
(I)DNA提取:參照植物基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN, Cat.N0.69104)所提供的方法稍作改進(jìn)提取DNA，具體操作步驟如下:
①65°C 預(yù)熱的 APl 溶液和 Buffer AE ；
②液氮研磨樣品至粉末狀后，取適量樣品入1.5mL的離心管中；
③向離心管中加入400 μ L預(yù)熱的APl溶液和4 μ L100mg/mL的RNA酶，充分混勻后，65°C水浴10min-15min，期間振蕩混勻2-3次；
④水浴完成后，直接加入130 μ L ΑΡ2溶液，充分振蕩混勻后冰浴5min冰浴時(shí)不可震蕩，然后14000r/min離心5min ；
⑤吸取上清加入到QIA shredder Mini spin column柱子中，即試劑盒中的紫色柱子，14000rpm/min離心2min,記錄吸取的上清液的體積數(shù)；
⑥棄上面的柱子，向過濾后的溶液中加入1.5倍體積的Buffer AP3/E溶液，用移液槍輕輕混勻；
⑦每次取650 μ L步驟⑥的混勻的溶液轉(zhuǎn)移到DNeasy Mini spin column柱子內(nèi)，即試劑盒中白色的柱子，14000rpm/min離心Imin,棄濾液,直至步驟⑥的混勻的溶液完全過濾完；需要說明的是，進(jìn)行過濾時(shí)DNeasy Mini spin column柱所能容納的體積約為650 μ L，而步驟⑥的溶液一般都是大于650 μ L的，因此，每次只能取650 μ L溶液，過濾、棄濾液后才能再加入剩余的溶液；
⑧棄下面的收集管，將spin column柱放入一個(gè)新的2mL收集管中，加入500 μ LBuffer Aff溶液，14000rpm/min 離心Imin洗脫雜質(zhì)，重復(fù)洗脫雜質(zhì)的操作一次，棄濾液，12000rpm/min 空管離心 lmin ；⑨棄下面的收集管，換一新的1.5mL離心管，加入100 μ L預(yù)熱后的Buffer AE溶解DNA，室溫靜置5min沉淀DNA，12000rpm/min離心lmin，收集的溶液即DNA溶液；需要說明的是100 μ L預(yù)熱后的Buffer AE可以分兩次或多次加入；⑩棄上面的柱子，_20°C保存DNA溶液。(2)DNA純化:當(dāng)DNA中含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的量較高時(shí)，其純度不能滿足實(shí)驗(yàn)要求，需要對(duì)其進(jìn)行純化，具體純化步驟如下:①將提取的DNA溶液稀釋到500 μ L-700 μ L后，加入等體積的酚和氯仿，充分混勻；②14000rpm/min 離心 IOmin,取上清液；③在上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，-20°C靜置30min以上；④在4°C條件下14000rpm/min離心lOmin，棄上清；⑤向步驟④中棄上清液的沉淀中加入lmL4°C預(yù)冷的70%的乙醇，14000rpm/min離心lOmin，棄上清，重復(fù)操作一次；⑥將經(jīng)過步驟⑤的乙醇洗滌的沉淀在無菌條件下風(fēng)干，加適量AE Buffer溶解DNA，即獲得純度較高的DNA溶液。需要說明的是，AE Buffer的加入量根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求而定，如果希望獲得DNA溶液的濃度較高，則可以加入較少量的AE Buffer,如10 μ L-50 μ L，也可以直接再加入IOOyL Buffer AE，則DNA濃度與純化前相當(dāng)，或者加入更多量的BufferAE以獲得較低濃度的DNA溶液。實(shí)施例2DNA濃度測(cè)定對(duì)提取的樣品DNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定；采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處吸收值，分別計(jì)算核酸的純度和濃度，計(jì)算公式如下:DNA 純度=0D260/0D280DNA 濃度=5O X 0D260mg/mLDNA的純度比值在1.7 L 9之間，濃度大于IOng/μ L。實(shí)施例3PCR擴(kuò)增根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜MSI品系的DNA序列設(shè)計(jì)引物(表I )，并提取以下樣品的DNA進(jìn)行特異性檢測(cè):轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF1、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF2、轉(zhuǎn)基因油菜品系RF3、轉(zhuǎn)基因油菜品系RT73、轉(zhuǎn)基因油菜品系MS8、轉(zhuǎn)基因油菜品系T45、轉(zhuǎn)基因油菜品系Topasl9/2、非轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因玉米品系3272、轉(zhuǎn)基因玉米品系59122、轉(zhuǎn)基因玉米品系Btll、轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76、轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR604、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N810、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N863、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N88017、轉(zhuǎn)基因玉米品系M0N89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系NK603、轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米品系T25、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆品系A(chǔ)5547-127、轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2、 轉(zhuǎn)基因大豆品系M0N89788、非轉(zhuǎn)基因大豆、大豆盲樣、轉(zhuǎn)基因棉花品系GHB614、轉(zhuǎn)基因棉花品系LLCotton25、非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻品系LL Rice62、非轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系EH92-527-1、木瓜。表I轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的檢測(cè)引物
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，所述下游引物含有SeqID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5’ -GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3’Seq ID N0.2:5，-ATGGTGAAACCGGTGTTAAAGAG-3，。
2.—種轉(zhuǎn)基因油菜MSl品系的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，其特征在于:所述檢測(cè)方法包括采用權(quán)利要求1中的引物，以待檢測(cè)樣品的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述檢測(cè)方法還包括以DNAmarker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與DNA marker的變性高效液 相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了一種轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的PCR-DHPLC檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，該引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于PCR，并特異性的擴(kuò)增出轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的DNA片段，并且其擴(kuò)增產(chǎn)物能夠適合于后續(xù)的DHPLC分析。該檢測(cè)方法提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、特異性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的檢測(cè)方法。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，其片段大小區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，分辨率高。本申請(qǐng)的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因油菜MS1品系的檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103173551SQ20131007939
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者向才玉, 章桂明, 潘廣, 凌杏園 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心