專利名稱：一種雙氧水傳感器、其制備方法及其在檢測單細胞雙氧水中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及一種雙氧水傳感器，利用毛細管電泳電化學法檢測單個細胞內(nèi)的H2O2，屬于生物電分析化學檢測技術領域。
背景技術：
H2O2是體內(nèi)較為重要的代謝產(chǎn)物之一，它能穿過細胞膜，并且是比較穩(wěn)定的一種活性氧。許多報道還證明它是細胞信號傳導的第二使者。并且H2O2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和凋亡有密切的聯(lián)系，對生物體內(nèi)，特別是單細胞內(nèi)H2O2的檢測可以診斷和預防由氧化脅迫和損傷誘導的疾病。許多分析方法已被用于H2O2的檢測，如熒光法，分光光度法，電化學檢測法和化學發(fā)光法等。毛細管電泳電化學分析法由于進樣量小、分析速度快、分離效率高等優(yōu)點而被廣泛的用于單細胞分析。Gong等用芯片毛細管電泳法對H2O2進行了檢測，并實現(xiàn)了單個RAW264.7細胞中H2O2的檢測，測定其濃度為1.86±0.05ymol/L。Ruttinger等將金微電極作為工作電極，利用毛細管電泳安培檢測法對H2O2進行了檢測分離?，F(xiàn)有對H2O2的檢測，靈敏度不高，檢測限不夠低，抗壞血酸、半胱氨酸等細胞內(nèi)可能存在的電活性物質(zhì)對H2O2的測定有干擾。申請?zhí)枮?01110020554.4的中國專利公開了一種納米Co-Fe普魯士藍配合物-碳納米管復合雙氧水傳感器的制備方法，該專利的雙氧水傳感器制作比較繁瑣，傳感器較大不適于毛細管電泳電化學檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雙氧水傳感器及其制備方法，該傳感器靈敏度高，檢測限低，線性范圍寬。本發(fā)明的另一目的是提供雙氧水傳感器在檢測單細胞雙氧水中的應用，及對單細胞內(nèi)的H2O2進行測定的方法。本發(fā)明采取的技術方案為:一種雙氧水傳感器，包括鉬電極和分布在鉬電極上的負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管。一種雙氧水傳感器的制備方法，包括步驟如下:(I)用細金相砂紙將鉬絲電極打磨平滑，使得鉬絲截面與毛細管截面平齊，將打磨好的鉬電極分別在二次水、無水乙醇、二次水中超聲清洗；(2)稱取多壁碳納米管，加入H2PtCl6溶液和乙二醇，再加入氫氧化鉀溶液，攪拌均勻，110° C 140° C下還原I 4h，再降至室溫，用丙酮清洗過濾，將過濾得到的固體60-80° C下干燥10-14h，即得到負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管，將干燥后的固體放入Nafion溶液中，超聲分散10-40min，得鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液；
(3)將步驟(I)洗凈后的電極蘸取鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液，倒置自然晾干。上述步驟(2)中所述的H2PtCl6溶液的濃度范圍8 12g/L，氫氧化鉀溶液的濃度范圍0.02 0.05mol/L，碳納米管與氯鉬酸質(zhì)量比為1:10-11，H2PtCl6溶液:乙二醇:氫氧化鉀溶液的體積比1:10:2，Nafion溶液為全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物用水和異丙醇稀釋后的溶液，質(zhì)量分數(shù)為0.1 1%，水和異丙醇體積比1:1。所述的鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液中鉬納米顆粒/多壁碳納米管濃度為I 10mg/mL。上述步驟(3)中鉬納米顆粒與多壁碳納米管質(zhì)量比1:1 1:9。鉬電極蘸取鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液的時間為I 2s，次數(shù)為I 4次。上述雙氧水傳感器在檢測單細胞雙氧水中的應用。上述雙氧水傳感器檢測單細胞內(nèi)雙氧水的方法，步驟如下:(I)中性粒細胞的提取:取新鮮抗凝血與全血及組織勻漿稀釋液于離心管中混勻，20-30° C下靜置30-40min，取上清液離心，分離出中性粒細胞層，細胞洗滌、破紅細胞得中性粒細胞待測樣；(2)單個全細胞進樣:將盛有PB (磷酸鹽緩沖液)的自制進樣池放在倒置顯微鏡的載物臺上，選擇放大倍數(shù)為400倍，將毛細管的進樣端小心的插入進樣池中，并將毛細管固定好，調(diào)節(jié)三維顯微操縱器，使毛細管的進樣端位于顯微鏡的觀察視野范圍內(nèi)，事先燒掉毛細管進樣端外壁2-3mm的聚酰亞胺涂層，再將中性粒細胞待測樣放入自制進樣池中，使其懸浮，后迅速將高壓電源的正極也放入中性粒細胞待測樣中，調(diào)節(jié)進樣電壓約為3.0kV，當單個中性粒細胞漂移到毛細管口附近時，在電滲流的作用下整個單細胞進入到毛細管內(nèi)，然后將毛細管和高壓電源的正極都放回緩沖池中，調(diào)節(jié)高壓電源至18kV ；(3)毛細管電泳檢測單個中性粒細胞中H2O2:調(diào)節(jié)高壓電源至18kV，待基線平穩(wěn)后，調(diào)節(jié)高壓電源至5kV，進樣H2O2標準樣品10s，再將高壓電源調(diào)回至18kV，運行實驗并記錄電泳圖。鉬電極表面的鉬納米顆粒和多壁碳納米管具有多孔的結構，從而增大了電極的表面積，促進了電子的轉移，提高了靈敏度。本發(fā)明傳感器靈敏度高，檢測限低，線性范圍寬，將該傳感器作為毛細管電泳的檢測器，實現(xiàn)了對單細胞中H2O2的定量檢測。本發(fā)明的雙氧水傳感器是微型傳感器，適于毛細管電泳電化學檢測，適于單細胞中活性物質(zhì)的檢測，而且制作簡單。


圖1為本發(fā)明鉬納米顆粒/多壁碳納米管修飾鉬微電極的掃描電鏡圖；a_鉬電極掃描電鏡圖，b-鉬納米顆粒/多壁碳納米管修飾鉬電極掃描電鏡圖；圖2為本發(fā)明毛細管電泳電化學檢測H2O2的裝置圖；圖3為本發(fā)明干擾物質(zhì)混合樣的電泳譜圖；a、b、c、d、e分別為多巴胺、腎上腺素、過氧化氫、半胱氨酸、抗壞血酸；圖4為本發(fā)明單細胞的進樣圖；圖5為本發(fā)明單細胞的電泳譜圖；圖6為H2O2在鉬微電極、多壁碳納米管修飾鉬電極和鉬納米顆粒/多壁碳納米管修飾鉬電極上的電泳對比圖；a、鉬微電極，b.多壁碳納米管修飾鉬電極，c.鉬納米顆粒/多壁碳納米管修飾鉬電極。其中，1.工作電極；2.參比電極；3.對電極；4.石英玻璃毛細管；5.參比池；6.檢測池；7.連接管。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明做進一步闡述。實施例1雙氧水傳感器的制備方法:(I)將一根鉬絲(直徑200 μ m，長度約為5cm)穿入到長度約為3cm，內(nèi)徑為250 μ m，外徑為375 μ m的石英毛細管中，兩端露出鉬絲。將其一端涂滿JC-311型環(huán)氧樹脂膠，將鉬絲從另一端往回至毛細管內(nèi)，使毛細管內(nèi)填充涂有環(huán)氧樹脂膠的鉬絲，并使鉬絲剛好露至毛細管端口，將用金相砂紙打磨好的銅絲與毛細管用502膠粘在一起，接觸的長度大約為Icm0將露出的鉬絲纏繞在銅絲上，并用銀漿涂抹鉬絲和銅絲，70° C下烘干30min。將電極插入到一段長約3cm,內(nèi)徑約為0.5mm,外徑約為Imm的石英玻璃管中，使涂有銀衆(zhòng)和502膠的部分正好包含在玻璃管中，然后用JC-311型環(huán)氧樹脂膠封住玻璃管兩端，24小時固化，備用。將其在金相砂紙上磨平，然后在二次水、無水乙醇、二次水中各超聲5min。(2)稱取60mg的多壁碳納米管，加入2.5mL的H2PtCl6溶液和25mL的乙二醇，再加入5mL0.04mol/L的氫氧化鉀溶液，攪拌均勻。130° C下還原2h，再降至室溫，用丙酮清洗過濾三次。最后將過濾得到的固體80° C下干燥12h，即得到負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管。將干燥后的固體放入0.5%Nafion溶液中，超聲分散30min，得鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液，鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液中鉬納米顆粒/多壁碳納米管濃度為5mg/
mLo(3)將步驟(I)洗凈后的電極蘸取分散好的鉬納米顆粒/多壁碳納米管，鉬納米顆粒與多壁碳納米管質(zhì)量比分別為1:5，倒置自然晾干。多壁碳納米管和負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管的透射電鏡圖如圖1所示。實施例2雙氧水傳感器的制備方法:包括步驟(I)、(2)、(3)，步驟(3)鉬納米顆粒與多壁碳納米管質(zhì)量比分別為1:1、1:3、1:7、1:9，其他步驟如實施例1。實施例3雙氧水傳感器的制備方法:包括步驟(1)、(2)、(3)，步驟(2)中鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液中鉬納米顆粒/多壁碳納米管濃度分別為3mg/mL,7mg/mL, 10mg/mL,其他步驟如實施例1。單細胞內(nèi)雙氧水的檢測自組裝毛細管電泳系統(tǒng):CHI810c電化學分析儀(上海辰華儀器有限公司);0_30kV高壓電源(山東師范大學儀器廠，山東)。使用實施例1制備的雙氧水傳感器。實驗步驟:
(I)中性粒細胞的提取:取2mL新鮮抗凝血與2mL全血及組織勻漿稀釋液于IOmL的離心管中混勻，20-30° C下靜置30min。此時大量的血紅細胞沉于離心管底部，上層清液呈微紅色，含有大量的白細胞、少量紅細胞、淋巴細胞和血清。取三份上清液慢慢鋪在三份細胞分離液(事先放入離心管中)液面之上，保持兩相界面清晰，1000r/m離心15min。此時，離心管中由上至下細胞分為四層:第一層為血漿層；第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層；第三層為透明分離液；第四層為含有少量紅細胞的中性粒細胞層。收集第四層細胞，加入2mL細胞洗滌液，吹散混勻后，2000r/m離心5min，棄去上清液。再加入2mL無菌水，震蕩20s，紅細胞由于不等滲而破膜。后立即加入2mL的1.8%NaCl溶液，輕輕震蕩混勻，恢復等滲。2000r/m離心5min，此時離心管底部只剩中性粒細胞。棄去上清液，加入2mL細胞洗滌液，吹散混勻后，2000r/m離心5min,如此重復清洗三次后,備用。(2)單個全細胞進樣及溶膜:將盛有PB的自制進樣池放在倒置顯微鏡的載物臺上，選擇放大倍數(shù)為400倍。緩沖溶液為0.025mol/L pH=7.4的磷酸鹽緩沖液。將毛細管的進樣端小心的插入進樣池中，并將毛細管固定好。調(diào)節(jié)三維顯微操縱器，使毛細管的進樣端位于顯微鏡的觀察視野范圍內(nèi)。為便于觀察，事先燒掉毛細管進樣端外壁2-3_的聚酰亞胺涂層。再將清洗干凈的細胞放入自制進樣池中，使其懸浮，后迅速將高壓電源的正極也放入細胞懸浮液中，調(diào)節(jié)進樣電壓約為3.0kV。當單個中性粒細胞漂移到毛細管口附近時，在電滲流的作用下整個單細胞進入到毛細管內(nèi)，然后將毛細管和高壓電源的正極都放回緩沖池中，調(diào)節(jié)高壓電源至18kV，開始檢測。(3)毛細管電泳檢測單個中性粒細胞中的H2O2:待基線平穩(wěn)后，調(diào)節(jié)高壓電源至5kV，進樣H2O2標準樣品10s，再將高壓電源調(diào)回至18kV，運行實驗并記錄電泳圖。結果表明單個中性粒細胞中的含量約為3.39±1.0lfmol (平均值土標準偏差)在上述實驗步驟條件下，對不同濃度的H2O2進行了三次平行檢測，取平均值，結果表明，H2O2的濃度0.8μπιΟπι/1 0.8mmol/L范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Ap(nC)=2.5112+406.58C(mmol/L)，線性相關系數(shù)為0.9989。H2O2的物質(zhì)的量在2.18fmol 21.76fmol和21.76fmol 2.18pmol/L范圍內(nèi)，物質(zhì)的量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程分別為Ap (nC) =0.5851+0.1646n (fmol)和Ap(nC) =4.9116+153.149n (pmol)，相關系數(shù)分別為0.9997和0.9998。說明該傳感器線性范圍寬，適于單細胞中H2O2含量的檢測。檢測限及重現(xiàn)性在上述實驗步驟條件下對0.lmmol/L的H2O2進行八次平行測定，遷移時間tm和峰電流ip的相對標準偏差分別為0.93%，4.33%。說明該修飾電極對H2O2有良好的重現(xiàn)性。當信噪比S/N=3時，H2O2的濃度檢測限為0.4μ mol/L。進樣體積為2.72nL，H2O2的摩爾濃度的檢測限為2.18fmol。表I列出了電化學法檢測H2O2的工作電極、線性范圍和檢測限。本發(fā)明所用的工作電極制作簡單、修飾方法簡單，而且對H2O2的檢測是在正電位區(qū)進行的，操作過程無須除氧，比文獻報道的其他電化學法檢測H2O2的檢測限低。表I電化學檢測H2O2所用工作電極、線性范圍、檢測限對比
權利要求
1.一種雙氧水傳感器，包括鉬電極和分布在鉬電極上的負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管。
2.一種雙氧水傳感器的制備方法，其特征是，包括步驟如下: (1)用細金相砂紙將鉬絲電極打磨平滑，使得鉬絲截面與毛細管截面平齊，將打磨好的鉬電極分別在二次水、無水乙醇、二次水中超聲清洗； (2)稱取多壁碳納米管，加入H2PtCl6溶液和乙二醇，再加入氫氧化鉀溶液，攪拌均勻，110° C 140° C下還原I 4h，再降至室溫，用丙酮清洗過濾，將過濾得到的固體60-80° C下干燥10-14h，即得到負載鉬納米顆粒的多壁碳納米管，將干燥后的固體放入Nafion溶液中，超聲分散10-40min，得鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液； (3)將步驟(I)洗凈后的電極蘸取鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液，倒置自然晾干。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種雙氧水傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的H2PtCl6溶液的濃度范圍8 12g/L，氫氧化鉀溶液的濃度范圍0.02 0.05mol/L，碳納米管與氯鉬酸質(zhì)量比為1:10-11 ,H2PtCl6溶液:乙二醇:氫氧化鉀溶液的體積比1:10:2。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種雙氧水傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的Nafion溶液為全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物用水和異丙醇稀釋后的溶液，質(zhì)量分數(shù)為0.1 1%，水和異丙醇體積比1:1。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種雙氧水傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)中所述的鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液中鉬納米顆粒/多壁碳納米管濃度為I 10mg/mL。
6.根據(jù)權利要求2所述的一種雙氧水傳感器的制備方法，其特征是，步驟(3)中鉬納米顆粒與多壁碳納米管質(zhì)量比1:1 1: 9，鉬電極蘸取鉬納米顆粒/多壁碳納米管分散液的時間為I 2s,次數(shù)為I 4次。
7.權利要求1所述的雙氧水傳感器在檢測單細胞雙氧水中的應用。
8.權利要求1所述的雙氧水傳感器檢測單細胞內(nèi)雙氧水的方法，其特征是，步驟如下: (1)中性粒細胞的提取:取新鮮抗凝血與全血及組織勻漿稀釋液于離心管中混勻，20-30° C下靜置30-40min，取上清液離心，分離出中性粒細胞層，細胞洗滌、破紅細胞得中性粒細胞待測樣； (2)單個全細胞進樣:將盛有磷酸鹽緩沖溶液的自制進樣池放在倒置顯微鏡的載物臺上，選擇放大倍數(shù)為400倍，將毛細管的進樣端小心的插入進樣池中，并將毛細管固定好，調(diào)節(jié)三維顯微操縱器，使毛細管的進樣端位于顯微鏡的觀察視野范圍內(nèi)，事先燒掉毛細管進樣端外壁2-3mm的聚酰亞胺涂層，再將中性粒細胞待測樣放入自制進樣池中，使其懸浮，后迅速將高壓電源的正極也放入中性粒細胞待測樣中,調(diào)節(jié)進樣電壓約為3.0kV,當單個中性粒細胞漂移到毛細管口附近時，在電滲流的作用下整個單細胞進入到毛細管內(nèi)，然后將毛細管和高壓電源的正極都放回緩沖池中，調(diào)節(jié)高壓電源至18kV ； (3)毛細管電泳檢測單個中性粒細胞中H2O2:調(diào)節(jié)高壓電源至18kV，待基線平穩(wěn)后，調(diào)節(jié)高壓電源至5kV，進樣H2O2標準樣品10s，再將高壓電源調(diào)回至18kV，運行實驗并記錄電泳圖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙氧水傳感器、其制備方法及其在檢測單細胞雙氧水中的應用，用乙二醇還原法將鉑納米顆粒負載到多壁碳納米管上，再將其制成鉑納米顆粒/多壁碳納米管分散液，用鉑電極蘸取分散好的鉑納米顆粒/多壁碳納米管制得雙氧水傳感器，本發(fā)明傳感器靈敏度高，檢測限低，線性范圍寬，將該傳感器作為毛細管電泳的檢測器，實現(xiàn)了對單細胞中H2O2的定量檢測。
文檔編號G01N27/447GK103196966SQ20131008716
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權日2013年3月18日
發(fā)明者王曉蕾, 李玲君, 馬艷芳, 王軍, 劉冬菊 申請人:山東師范大學