專利名稱：檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及其制備方法。
背景技術(shù)：
側(cè)向流免疫層析測(cè)定(LFIA, Lateralflow immunoassay)是20世紀(jì)末期出現(xiàn)的新型免疫檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，在多種病毒檢測(cè)如HIV、乙肝病毒以及激素檢測(cè)方面有廣泛應(yīng)用。其通過(guò)結(jié)合免疫標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，在極短時(shí)間內(nèi)，無(wú)需特殊條件，即可做出結(jié)果判斷，已經(jīng)成為一種重要的便捷免疫檢測(cè)方法。黃熱病(Yellow fever, YF)是黃熱病毒(Yellow fever virus, YFV)引起的急性蟲媒傳染病,主要流行于非洲和南美洲，是舊版國(guó)際衛(wèi)生條例規(guī)定監(jiān)控的三種檢疫傳染病之一，新版國(guó)際衛(wèi)生條例即《IHR (2005)))則將其納入構(gòu)成國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件的疾病清單。該病經(jīng)蚊媒傳播，人類對(duì)黃熱病毒普遍敏感，且不分年齡、性別和種族。該病一般為散發(fā)，但如果媒介蚊蟲大量繁殖，可在人群中引起爆發(fā)流行，危害極大。其臨床表現(xiàn)輕重不一，主要包括發(fā)熱、劇烈頭痛、黃疸、出血及蛋白尿等，重癥患者病死率聞達(dá)50%以上。盡管目前我國(guó)尚無(wú)黃熱病流行及病例報(bào)告，但必須認(rèn)識(shí)到伴隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程加快和我國(guó)對(duì)外交流日益頻繁，切不能忽視黃熱病毒及其傳播媒介傳入國(guó)內(nèi)的危險(xiǎn)性。我國(guó)南方地區(qū)如福建、廣東、廣西、海南廣泛存在可傳播黃熱病毒的埃及伊蚊，且黃熱病常與登革熱和瘧疾等蚊媒病共存，臨床上有時(shí)難以區(qū)別，因此必須加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)。早期快速準(zhǔn)確檢測(cè)黃熱病毒不僅對(duì)于及時(shí)控制患者病情提高治愈率有關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)于口岸衛(wèi)生檢疫機(jī)構(gòu)及時(shí)甄別和隔離病人、嚴(yán)防疫情傳入國(guó)內(nèi)至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外黃熱病檢測(cè)方法種類繁多。按檢測(cè)靶標(biāo)來(lái)主要可分為:核酸分子檢測(cè)、病毒分離鑒定、抗體檢測(cè)以及抗原檢測(cè)等四大類。但大部分由于需要較高的技術(shù)和條件以及檢測(cè)速度相對(duì)較慢，限制了在口岸檢疫中的現(xiàn)場(chǎng)使用。為滿足口岸衛(wèi)生檢疫需要，研制靈敏可靠、結(jié)果便于保存及量化分 析、操作簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)產(chǎn)品對(duì)于疫情監(jiān)控和防范具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，包括相互連接的樣品墊、吸水墊和具有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜，所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸水墊之間，其特征在于:所述樣品墊上負(fù)載有磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體，所述檢測(cè)線包被有黃熱病毒包被抗體，所述質(zhì)控線包被有與所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體特異結(jié)合的第二抗體；所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體為將待標(biāo)記黃熱病毒抗體和羧基修飾的磁性納米粒子以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體。
上述側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中，所述檢測(cè)線與所述樣品墊的距離大于所述質(zhì)控線與所述樣品墊的距離。所述黃熱病毒包被抗體可為黃熱病毒單克隆抗體或黃熱病毒多克隆抗體；所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體可為黃熱病毒單克隆抗體或黃熱病毒多克隆抗體。上述側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中，所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體的親和常數(shù)為IO8M'IO6 IO8IT1或IO7 IO8IT1 ;所述黃熱病毒包被抗體的親和常數(shù)為IO8M'IO6 IO8IT1或IO7 IO8M4 ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的平均直徑為100nm、80-200nm或60-300nm ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的直徑變異系數(shù)(CV)可為15%、10%-20%或10%-30% ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度可為40emu/g。其中，所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體的親和常數(shù)具體可為IO8M'所述黃熱病毒包被抗體的親和常數(shù)具體可為IO6 IO8M'所述羧基修飾的磁性納米粒子的平均直徑可為lOOnm，所述羧基修飾的磁性納米粒子的直徑變異系數(shù)(CV)可為15%，所述羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度可為40emu/g。所述羧基修飾的磁性納米粒子具體可為羧基修飾的磁性Fe3O4納米粒子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體是購(gòu)自abeam公司的編號(hào)為ab22839抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體。該待標(biāo)記黃熱病毒抗體的親和常數(shù)為IO8M'所述黃熱病毒包被抗體是購(gòu)自abeam公司的編號(hào)為ab36055抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體。所述黃熱病毒包被抗體的親和常數(shù)為IO8M'所述磁性納米粒子是購(gòu)自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MP-2的聚馬來(lái)酸十六醇酯(PMAH)修飾的磁性Fe3O4水溶性納米晶，所述磁性納米粒子為羧基修飾的磁性納米粒子，所述羧基修飾的磁性納米粒子平均直徑為lOOnm，直徑變異系數(shù)(CV)為15%，所述羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為40emu/g。與所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體特異結(jié)合的第二抗體為羊抗鼠IgG抗體。本申請(qǐng)中，所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體和所述黃熱病毒包被抗體親和常數(shù)均是指對(duì)黃熱病毒的親和常數(shù)。
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上述側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中，所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體按照包括如下步驟的方法制備:將所述羧基修飾的磁性納米粒子活化后與所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體以50:3的質(zhì)量比進(jìn)行反應(yīng)得到以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物。所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中，所述羧基修飾的磁性納米粒子用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺進(jìn)行活化；所述活化中，所述羧基修飾的磁性納米粒子活化所用1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的濃度分別為5mM和IOmM ;所述活化的溫度為37°C，時(shí)間為0.5h。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，按照如下方法對(duì)羧基修飾的磁性納米粒子進(jìn)行活化:將2.5mg的上述羧基修飾的磁性納米粒子與5mmoll-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和IOmmol NHS (N-羥基丁二酰亞胺)在MES緩沖液(0.lM、pH4.7)中在37°C反應(yīng)0.5h，得到活化后羧基修飾的磁性納米粒子。所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中，所述將羧基修飾的磁性納米粒子活化后與所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體以50:3的質(zhì)量比進(jìn)行反應(yīng)是在37°C在濃度為50mMpH為8.5的硼砂緩沖液中反應(yīng)3.5小時(shí)。所述50mM pH為8.5的硼砂緩沖液可按照如下方法配制:將1.9g Na2B4O7.1OH2O溶于IOOml水中，調(diào)pH至8.5得到50mM pH為8.5的硼砂緩沖液。所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中還包括將所述磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物用BSA溶液封閉后得到所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的步驟，所述BSA溶液的濃度為5% (質(zhì)量百分濃度)，所述封閉的溫度為37°C，時(shí)間為0.5h。所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中，還包括將用BSA溶液封閉后得到的所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體用0.02M pH為7.4的PBS緩沖液進(jìn)行洗滌和懸浮的步驟。所述檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品還可包括背板和/或保護(hù)膜，可以試紙、卡等形式存在。上述側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品可按照下述方法制備。本發(fā)明所提供的制備上述檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品的方法，包括:1、分別制備上述檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中所述樣品墊和所述包被膜；I1、將步驟I得到的所述樣品墊、所述包被膜和吸水墊相互連接，得到所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸水墊之間的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙。其中，所述包·被膜的制作方法包括:將所述黃熱病毒包被抗體以為2mg/ml的濃度包被于硝酸纖維素膜得到所述檢測(cè)線，將所述檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中所述第二抗體以lmg/ml的濃度包被于所述硝酸纖維素膜上與所述檢測(cè)線相互分離的區(qū)域，得到所述質(zhì)控線，具有所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線的所述硝酸纖維素膜即為所述包被膜。上述包被膜的制作方法中，所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線的包被均是采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet Quant 13000噴頭將2mg/ml所述黃熱病毒包被抗體溶液和lmg/ml所述第二抗體溶液噴涂至所述硝酸纖維素膜，完成所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線的包被。其中，2mg/ml所述黃熱病毒包被抗體溶液和lmg/ml所述第二抗體溶液的溶劑均可為pH為7.4的0.02M PBS緩沖液。所述pH為7.4的0.02M PBS緩沖液可按照如下方法配制:稱取 2.3g Na2HP04、0.524g NaH2PO4.H20,8.77g NaCl 溶于水，用水定容至 1L，調(diào) pH 至 7.4，得到pH為7.4的0.02M PBS緩沖液。其中，所述樣品墊的制作方法包括:將所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體以0.5mg/ml的濃度包被于玻璃纖維素膜得到所述樣品墊。所述樣品墊的制作方法中，所述玻璃纖維素膜在包被所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體前，進(jìn)行如下預(yù)處理:將所述玻璃纖維素膜在膜處理緩沖液中在37°C浸泡I小時(shí)，得到經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玻璃纖維素膜；所述膜處理緩沖液按照如下方法配制^fTritonX-100、BSA、蔗糖溶于上述pH為7.4的0.02M PBS緩沖液使Triton X-100的質(zhì)量百分含量為0.2%、BSA的質(zhì)量百分含量為1%、蔗糖的質(zhì)量百分含量為1%，調(diào)pH至7.4，得到膜處理緩沖液。所述將所述的磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體以0.5mg/ml的濃度包被于玻璃纖維素膜是將所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體用所述膜處理緩沖液配成所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體含量為0.5mg/ml的液體，將所述液體噴涂于將所述經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玻璃纖維素膜，經(jīng)干燥后得到所述樣品墊。其中，所述噴涂可采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet Quanti3000噴頭進(jìn)行。
本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品可用于檢測(cè)血清或血漿樣品中是否含有黃熱病毒。本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品與磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的免疫層析檢測(cè)技術(shù)相關(guān)，是采用磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，進(jìn)行快速免疫層析測(cè)定的一類方法，該技術(shù)整合了磁性納米材料化學(xué)合成、標(biāo)記技術(shù)、測(cè)流免疫層析技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品基于側(cè)流免疫層析的原理，加入待測(cè)樣品后，樣品中的黃熱病毒與磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體結(jié)合后層析到檢測(cè)線(T線)處，在T線處與噴涂的黃熱病毒包被抗體形成包被抗體-抗原-磁標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物，多余的磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體則在質(zhì)控線(C線)處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。用磁性試紙判讀儀測(cè)定T線處磁性微球的磁強(qiáng)強(qiáng)度，通過(guò)與設(shè)定的閾值比對(duì)而確定其陽(yáng)性或陰性結(jié)果，C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)對(duì)磁性復(fù)合粒子、黃熱病毒和黃熱病毒抗體分子特性的研究，通過(guò)選擇適合的磁性復(fù)合粒子與特異性的抗體進(jìn)行定向共價(jià)化學(xué)偶聯(lián)，獲得功能性的磁性標(biāo)記探針，并通過(guò)優(yōu)化雙抗體夾心免疫反應(yīng)的各種條件，制備得到本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃熱病毒的快速和高靈敏測(cè)定，具有如下優(yōu)點(diǎn):靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)客觀化測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙對(duì)黃熱病毒的靈敏度達(dá)10U/ml。


圖1為檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為磁性復(fù)合粒子電鏡圖。圖3為檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙檢測(cè)值與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用的磁性納米粒子是購(gòu)自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MP-2的聚馬來(lái)酸十六醇酯(PMAH)修飾的磁性Fe3O4水溶性納米晶(圖2)，其核心為Fe3O4納米顆粒，固含量為30mg/ml,為羧基修飾的磁性納米粒子,該羧基修飾的磁性納米粒子平均直徑為lOOnm，直徑變異系數(shù)(CV)為15% ;該羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為 40emu/g。下述實(shí)施例中所用的待標(biāo)記黃熱病毒抗體是購(gòu)自abeam公司的編號(hào)為ab22839抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體。該待標(biāo)記黃熱病毒抗體對(duì)黃熱病毒的親和常數(shù)為IO8M'下述實(shí)施例中的黃熱病毒包被抗體是購(gòu)自abeam公司的編號(hào)為ab36055抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體。該黃熱病毒包被抗體對(duì)黃熱病毒的親和常數(shù)為IO8M'下述實(shí)施例中用于制作樣品墊的玻璃纖維素膜購(gòu)自Whatman公司、商品目錄號(hào)為Standardl70下述 實(shí)施例中用于制作包被膜的硝酸纖維素膜購(gòu)自Whatman公司、商品目錄號(hào)為Imunopore FP0下述實(shí)施例中的pH為7.4的0.02M PBS緩沖液按照如下方法配制:稱取
2.3gNa2HP04、0.524g NaH2PO4.H20,8.77g NaCl 溶于純水，用純水定容至 1L，調(diào) pH 至 7.4，得到pH為7.4的0.02M PBS緩沖液。下述實(shí)施例中的膜處理緩沖液按照如下方法配制:將Triton X_100、BSA、蔗糖溶于上述pH為7.4的0.02M PBS緩沖液使Triton X-100的質(zhì)量百分含量為0.2%、BSA的質(zhì)量百分含量為1%、蔗糖的質(zhì)量百分含量為1%，調(diào)PH至7.4，得到膜處理緩沖液。下述實(shí)施例中的50mM pH為8.5的硼砂緩沖液按照如下方法配制:稱取
1.9gNa2B407.1OH2O溶于IOOml純水，調(diào)pH至8.5得到50mM pH為8.5的硼砂緩沖液。本發(fā)明的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品的制備方法包括以下步驟:(—)羧基修飾的磁性納米粒子標(biāo)記探針的制備采用適合的羧基修飾的磁性納米粒子，活化其表面的羧基后，采用化學(xué)偶聯(lián)的方式將黃熱病病毒抗體定向連接到該羧基修飾的磁性納米粒子表面。(二)測(cè)試區(qū)T線和C線處抗原/抗體的包被采用噴膜儀器，于測(cè)試區(qū)的T線處噴涂黃熱病毒包被抗體，于C線處噴涂抗鼠IgG抗體。(三)樣品墊處標(biāo)記探針的包被采用噴涂?jī)x器，于樣品墊特定位置處噴涂磁性微球標(biāo)記的抗黃熱病病毒抗體(磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體)。(四)反應(yīng)板的組裝成型按照反應(yīng)板的結(jié)構(gòu)圖(見圖1)要求，于塑料支撐背板中間粘貼作為測(cè)試區(qū)的硝酸纖維素(NC)膜，于NC膜的T線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。在其上面粘貼透明保護(hù)膜。采用試紙分切機(jī)，將整塊反應(yīng)板分切為一定寬帶的紙條，用裝有干燥劑的專門的鋁箔袋進(jìn)行包裝。(五)抗原-抗體磁標(biāo)免疫復(fù)合物的形成于上述組裝成型的反應(yīng)板的加樣孔處加入待測(cè)樣品，樣品中的黃熱病毒與磁標(biāo)記的黃熱病毒抗體(磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體)結(jié)合后層析到T線處噴涂的黃熱病毒包被抗體，在T線處形成包被抗體-抗原-磁標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物，多余的磁標(biāo)黃熱病毒抗體(磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體)則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。(六)磁標(biāo)免疫復(fù)合物磁場(chǎng)強(qiáng)度檢測(cè)用磁性試紙判讀儀測(cè)定T線處磁性微球的磁場(chǎng)強(qiáng)度，通過(guò)與設(shè)定的閾值比對(duì)而確定其陽(yáng)性或陰性結(jié)果，C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。所述的磁標(biāo)免疫復(fù)合物的磁場(chǎng)強(qiáng)度，是指在T線和C線處分別滯留下的結(jié)合磁珠的數(shù)量用美國(guó)Quantum Dot的磁共振檢測(cè)儀MAR測(cè)定后所得到的數(shù)值。通過(guò)雙抗體夾心免疫反應(yīng)的條件，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大量測(cè)定不同臨床血清樣本可確定出各不同正常樣本的測(cè)定均值，以此作為臨界值(cutoff)來(lái)確定T線檢測(cè)樣本的陽(yáng)性或陰性結(jié)果。C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。實(shí)施例1、檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的制備

(一)磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備
以飽和磁化強(qiáng)度為40emu/g、平均直徑為lOOnm、直徑變異系數(shù)(CV)為15%的聚馬來(lái)酸十六醇酯(PMAH)修飾的磁性Fe3O4水溶性納米晶(購(gòu)自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MP-2)作為羧基修飾的磁性納米粒子，以對(duì)黃熱病毒親和常數(shù)為IO8M4的抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體(購(gòu)自abeam公司，編號(hào)為ab22839)作為待標(biāo)記黃熱病毒抗體，按照下述方法制備磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體:取2.5mg的上述羧基修飾的磁性納米粒子用MES緩沖液(0.1M、pH4.7)洗滌并用
0.4T的磁架分離富集后，用Iml MES緩沖液(0.1M、pH4.7)重懸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)至終濃度為5mM、加入NHS (N-羥基丁二酰亞胺)至終濃度為IOmM,在37°C，反應(yīng)半小時(shí)得到活化后羧基修飾的磁性納米粒子。用50mM pH8.5的硼砂緩沖液洗滌該活化后羧基修飾的磁性納米粒子，取0.15mg上述待標(biāo)記黃熱病毒抗體和2.5mg上述活化后羧基修飾的磁性納米粒子混合到50mMPH8.5的硼砂緩沖液中充分混勻。37°C下反應(yīng)3.5小時(shí)，讓抗體和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價(jià)結(jié)合得到磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物。反應(yīng)結(jié)束后，加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的BSA溶液對(duì) 磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物上剩余活性羧基位點(diǎn)進(jìn)行封閉，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行0.5小時(shí)。完成后，用pH7.4的0.02M PBS緩沖液洗滌、重懸得到25mg/ml磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體液體，4°C保存待用。(二)檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的制備以對(duì)黃熱病毒親和常數(shù)為IO8IVr1的abeam公司的編號(hào)為ab36055抗黃熱病毒的鼠單克隆抗體，作為黃熱病毒包被抗體，以羊抗鼠IgG抗體作為與所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體特異結(jié)合的第二抗體制備包被膜，具體方法如下:采用pH7.4的0.02M PBS緩沖液，將羊抗鼠IgG抗體(長(zhǎng)沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500)配制為濃度lmg/ml溶液,將黃熱病毒包被抗體(abeam公司，ab36055)的濃度配制為濃度2mg/ml溶液，選用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet Quant 13000噴頭將羊抗鼠IgG抗體噴至硝酸纖維素膜(NC膜)的質(zhì)控線(Control Line, C線)位置,將黃熱病毒包被抗體噴至檢測(cè)線(Test Line, T線)位置，于相對(duì)濕度為10%以下的干燥車間進(jìn)行抽濕4小時(shí)后干燥待用，得到具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜。用上述膜處理緩沖液浸泡玻璃纖維紙I小時(shí)，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進(jìn)行抽濕4小時(shí)后，用上述膜處理緩沖液稀釋步驟(一)磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體液體至磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體含量為0.5mg/ml后，采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet Quanti3000噴頭將其噴涂至上述處理過(guò)的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊，于同樣的抽濕條件進(jìn)行干燥。在10萬(wàn)級(jí)潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜、上述樣品墊、吸水紙(作為吸水墊)、背板和保護(hù)膜按圖1所示進(jìn)行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，得到檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙，裝入檢測(cè)用夾片待用。該試紙的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。實(shí)施例2、檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的靈敏度檢測(cè)以黃熱病毒減毒活疫苗作為待測(cè)樣品來(lái)測(cè)定實(shí)施例1的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的靈敏度。將法國(guó)SANOFI PASTEUR公司黃熱病毒減毒活疫苗用生理鹽水配制成系列濃度(0、5、10、25、50、100U/ml)的稀釋液，分別加入由實(shí)施例1得到的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙中，并采用磁共振檢測(cè)儀MAR (Magna BioSciences,8094-101-01&8094-101-02)讀取RMU (相對(duì)磁場(chǎng)強(qiáng)度)。檢測(cè)步驟:檢測(cè)前先將待檢測(cè)樣品恢復(fù)室溫(25°C)，用精確移液器取待檢測(cè)樣品50 Ul垂直緩慢滴入實(shí)施例1得到的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的樣品墊，然后滴入IOOul上述pH為7.4的0.02M PBS緩沖液，20分鐘后用MAR進(jìn)行測(cè)試。該黃熱病毒減毒活疫苗中，U的定義為國(guó)際單位。其檢測(cè)結(jié)果如下表I所示。從檢測(cè)結(jié)果中可以得出實(shí)施例1的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙的靈敏度為10U/ml (cut-off值RMU大于30為陽(yáng)性值)。黃熱病毒磁性試紙檢測(cè)值與濃度曲線圖如圖3所示。表1、黃熱病毒減毒活疫苗不同濃度稀釋液的磁性試紙檢測(cè)值
權(quán)利要求
1.檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，包括相互連接的樣品墊、吸水墊和具有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜，所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸水墊之間，其特征在于:所述樣品墊上負(fù)載有磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體，所述檢測(cè)線包被有黃熱病毒包被抗體，所述質(zhì)控線包被有與所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體特異結(jié)合的第二抗體； 所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體為將待標(biāo)記黃熱病毒抗體和羧基修飾的磁性納米粒子以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體的親和常數(shù)為IO8M-1UO6 IO8M4或IO7 IO8M4 ;所述黃熱病毒包被抗體的親和常數(shù)為IO8M-1UO6 IO8M-1或IO7 IO8M-1 ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的平均直徑為lOOnm、80-200nm或60_300nm ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的直徑變異系數(shù)為15%、10%_20%或10%-30% ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為40emu/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體按照包括如下步驟的方法制備:將所述羧基修飾的磁性納米粒子活化后與所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體以50:3的質(zhì)量比進(jìn)行反應(yīng)得到以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中，所述羧基修飾的磁性納米粒子用1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺進(jìn)行活化；所述活化中，所述羧基修飾的磁性納米粒子活化所用1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺的濃度分別為5mM和IOmM ;所述活化的溫度為37°C，時(shí)間為0.5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中，所述將羧基修飾的磁性納米粒子活化后與所述待標(biāo)記黃熱病毒抗體以50:3的質(zhì)量比進(jìn)行反應(yīng)是在37°C在濃 度為50mM pH為8.5的硼砂緩沖液中反應(yīng)3.5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的制備方法中還包括將所述磁性納米粒子與黃熱病毒抗體的偶聯(lián)物用BSA溶液封閉后得到所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體的步驟，所述BSA溶液的濃度為5% (質(zhì)量百分濃度)，所述封閉的溫度為37°C，時(shí)間為0.5h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，其特征在于:所述側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品按照權(quán)利要求8-10中任一所述的方法制備。
8.制備權(quán)利要求1-6中任一所述的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品的方法，包括: 1、分別制備權(quán)利要求1-6中任一所述的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中所述樣品墊和所述包被膜； I1、將步驟I得到的所述樣品墊、所述包被膜和吸水墊相互連接，得到所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸水墊之間的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定試紙。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述包被膜的制作方法包括:將所述黃熱病毒包被抗體以為2mg/ml的濃度包被于硝酸纖維素膜得到所述檢測(cè)線，將權(quán)利要求1-6中任一所述的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品中所述第二抗體以lmg/ml的濃度包被于所述硝酸纖維素膜上與所述檢測(cè)線相互分離的區(qū)域，得到所述質(zhì)控線，具有所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線的所述硝酸纖維素膜即為所述包被膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述樣品墊的制作方法包括:將權(quán)利要求1- 6中任一所述的磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體以0.5mg/ml的濃度包被于玻璃纖維素膜得到所述樣品墊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)黃熱病毒的側(cè)向流免疫層析測(cè)定產(chǎn)品，包括相互連接的樣品墊、吸水墊和具有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜，所述包被膜位于所述樣品墊和所述吸水墊之間，其特征在于所述樣品墊上負(fù)載有磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體，所述檢測(cè)線包被有黃熱病毒包被抗體，所述質(zhì)控線包被有與所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體特異結(jié)合的第二抗體；所述磁性納米粒子標(biāo)記黃熱病毒抗體為將待標(biāo)記黃熱病毒抗體和羧基修飾的磁性納米粒子以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明提供的產(chǎn)品檢測(cè)黃熱病毒，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)客觀化測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/531GK103235131SQ201310141809
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者史蕾, 馬嵐, 顧大勇, 吳峰, 向軍儉, 徐云慶, 趙純中, 冬冰, 何建安, 徐華, 劉春曉 申請(qǐng)人:深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心