一種γ-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種γ-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法，是在NADP+和α-酮戊二酸存在的條件下利用γ-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶的作用，在一系列酶促反應條件下NADPH被定量，從而間接定量GABA含量。應用此法檢測γ-氨基丁酸含量，線性范圍為5.0×10-4-1.0×10-2之間，回收率達到72.8％，相對標準偏差（RSD）小于4％，最低檢出限為0.5mM。本發(fā)明方法具有反應體系小，成本低廉，易于推廣，適合現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點。
【專利說明】一種Y-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種Y-氨基丁酸快速檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]GABA為Y-氨基丁酸，又稱氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有很重要的生理功能，并廣泛應用于食品中。近年來，GABA在食品中的應用研究正在掀起,而食品中GABA快速測定方法的報道尚不多見。關(guān)于GABA的測定近年來國內(nèi)外有氨基酸分析儀測定、酶法、色質(zhì)聯(lián)用法、柱層析熒光測定法、紙電泳比色、毛細管氣相色譜法、放射性受體法、毛細管電泳法，以及高效液相色譜法等，這些方法大多用于醫(yī)學領域，價格昂貴，而且費時，不適用于大量的定量分析。在進行高產(chǎn)GABA乳酸菌株的篩選中，以及菌株發(fā)酵條件優(yōu)化中，都要進行大量的GABA定量分析。顯然需要一種簡便、價廉的定量測定方法，因此本文研究了利用雙酶試劑盒快速定量測定GABA的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種Y -氨基丁酸快速檢測試劑盒，技術(shù)方案如下:
[0004]每200 μ L 反應體系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM 二硫蘇糖醇、
l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸鈉、70-100mM Tris-Hcl。
[0005]優(yōu)選地,每200 μ L反應體系組成如下:Tris_Hcl:80mM> NADP+:1.4mM、二硫蘇糖醇:10mM、a -酮戊二酸:2.0mM、硫酸鈉:750mM、GABase:30 μ g。
[0006]本發(fā)明還提供了一種Y -氨基丁酸快速檢測方法，步驟如下:
[0007]I)每 200 μ L 反應體系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM二硫蘇糖醇、
l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸鈉、70-100mM Tris-Hcl ；
[0008]2)將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，在波長340nm檢測吸光度；
[0009]3)將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據(jù)標準曲線計算得到。
[0010]GABase或GABA酶均為Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶。
[0011]具體而言，檢測GABA含量的方法按以下步驟實現(xiàn):
[0012]I) 200 μ L 反應體系:
[0013]Tris-Hcl:80mM
[0014]NADP+:1.4mM
[0015]二硫蘇糖醇:10mM
[0016]α-酮戊二酸:2.0mM
[0017]硫酸鈉:750mM
[0018]GABase:30 μ g
[0019]樣品溶液:20 μ L
[0020]2)將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，反應溫度為30°C，在波長340nm檢測吸光度；
[0021]3)將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據(jù)標準曲線計算得到。
[0022]對于發(fā)酵酸奶樣品中Y-氨基丁酸的檢測，需要將發(fā)酵酸奶樣品進行前處理，避免酸奶中蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)對于Y-氨基丁酸測定產(chǎn)生影響。具體預處理方法如下:取50g乳酸菌發(fā)酵奶，IOOOOrpm離心20min,取40mL上清液加入IOmLlO %的磺基水楊酸，
0.45um濾膜過濾,4°C冷藏靜置60min, 14500rpm離心15min, 0.45um濾膜過濾,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對樣品濃縮，濃縮液置于4°C備用。
[0023]本發(fā)明提供的檢測方法，準確率高、檢測速度快，整個檢測結(jié)果可以在30min以內(nèi)完成，有利于提聞食品檢驗檢疫機構(gòu)的檢測能力。
【具體實施方式】
[0024]實施例1快速檢測反應體系的建立
[0025]反應體系包括的化學試劑為Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酸半醛脫氫酶、輔酶I1、二硫蘇糖醇、α-酮戊二酸、硫酸鈉、Tris-Hc。其中每200uL反應體系含有25ug GABase、2mMNADP+、15mM 二硫蘇糖醇、ImMa -酮戊二酸、500mM 硫酸鈉、70mM Tris-Hcl。
[0026]將樣品20 μ L加入上述反應體系中進行反應；上述反應體系可檢出最低GABA濃度為0.5mM，低于0.5mM檢測會受到限制。
[0027]實施例2快速檢測反應體系的建立
[0028]反應體系包括的化學試劑為Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酸半醛脫氫酶、輔酶I1、二硫蘇糖醇、α-酮戊二酸、硫酸鈉、Tris-Hc。其中每200uL反應體系含有30ug GABase、3mMNADP+、10mM 二硫蘇糖醇、2mMa -酮戊二酸、750mM 硫酸鈉、80mM Tris-Hcl。
[0029]將樣品20 μ L加入上述反應體系中進行反應；上述反應體系可檢出最低GABA濃度為0.5mM，低于0.5mM檢測會受到限制。
[0030]檢測產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵奶中GABA的含量為:61.7mg/100g，采用液相色譜的方法檢測同一樣品中GABA的含量為58.4mg/100g。
[0031]實施例3快速檢測反應體系的建立
[0032]反應體系包括的化學試劑為Y-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酸半醛脫氫酶、輔酶I1、二硫蘇糖醇、α-酮戊二酸、硫酸鈉、Tris-Hc。其中每200uL反應體系含有40ug GABase、2mMNADP+、5mM 二硫蘇糖醇、4mMa -酮戊二酸、800mM 硫酸鈉、IOOmM Tris-Hcl。
[0033]將樣品20 μ L加入上述反應體系中進行反應；上述反應體系可檢出最低GABA濃度為 0.5mM,
[0034]低于0.5mM檢測會受到限制。
[0035]檢測產(chǎn)Y-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵奶中GABA的含量為:60.9mg/100g，采用液相色譜的方法檢測同一樣品中GABA的含量為58.4mg/100g。
[0036]實施例4GABA標準曲線的建立
[0037]在GABA標準溶液濃度為0.5-10mM范圍內(nèi)建立標準曲線，縱坐標y代表吸光值，橫坐標X代表GABA濃度，得到線性方程，y=0.285x_0.21，相關(guān)系數(shù)R2=0.9966，(n=6)。
[0038]實施例5發(fā)酵奶中GABA含量的檢測[0039]對發(fā)酵奶中GABA含量的快速檢測按以下步驟實現(xiàn):
[0040]第一步:將含有Y-氨基丁酸的發(fā)酵酸奶樣品進行樣品前處理，標準品不經(jīng)樣品前處理。所采用的前處理方法為磺基水楊酸法，將處理好的樣品加入到配制好的混合反應體系中。
[0041]第二步:將反應體系放于分光光度計的樣品池中，樣品池選用的是微量樣品池，反應溫度為30°C，波長為340nm。
[0042]第三步:將所得的數(shù)據(jù)通過標準曲線進行轉(zhuǎn)化，采用實施例1方法檢測得到產(chǎn)Y -氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵奶中GABA的含量為:61.3mg/100g。
[0043]為了驗證方法的準確性，我們對實驗進行了精密度和回收率實驗。在檢測結(jié)果線性范圍為5.0X 10_4-1.0X 10_2之間，回收率達到72.8%，相對標準偏差(RSD)小于4%。
[0044]另外，對同一批次樣品經(jīng)過樣品前處理用高效液相色譜方法進行檢測，檢測同一樣品中GABA的含量為58.4mg/100g。
[0045]所述GABA產(chǎn)Y -氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵奶的制備方法見中國發(fā)明專利:一種富含GABA酸奶的制備方法。
【權(quán)利要求】
1.一種Y-氨基丁酸快速檢測試劑盒，其特征在于，每200μ L反應體系含有:25-40ygGABase、2_3mM NADP+、5_15mM二硫蘇糖醇、l_4mM α -酮戊二酸、500-800mM硫酸鈉、70_100mMTris-Hclο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，每200μ L反應體系組成如下:TriS-Hcl:80mM、NADP+:1.4mM、二硫蘇糖醇:IOmM, α -酮戊二酸:2.0mM,硫酸鈉:750mM、GABase:30 μ g0
3.一種Y-氨基丁酸快速檢測方法，其特征在于，步驟如下: 1)每200 μ L 反應體系含有:25-40 μ g GABase、2_3mM NADP+、5_15mM 二硫蘇糖醇、l-4mMa -酮戊二酸、500-800mM 硫酸鈉、70-100mM Tris-Hcl ； 2)將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，在波長340nm檢測吸光度； 3)將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據(jù)標準曲線計算得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，樣品加入反應體系后反應溫度為30°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，樣品加入反應體系后反應時間為60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述200μ L反應體系組成如下:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM
二硫蘇糖醇:10mM
a -酮戊二酸:2.0mM`
硫酸鈉:750mM
GABA 酶:30 μ g
樣品溶液:20μ?。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)200 μ L反應體系:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM 二硫蘇糖醇:10mM a -酮戊二酸:2.0mM 硫酸鈉:750mM GABA 酶:30 μ g 樣品溶液JOyL 2)將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，反應溫度為30°C，在波長340nm檢測吸光度； 3)將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據(jù)標準曲線計算得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下: I)對于發(fā)酵酸奶中Y -氨基丁酸的檢測，需將發(fā)酵酸奶樣品進行前處理，前處理方法如下:取50g乳酸菌發(fā)酵奶，1000Orpm離心20min,取40mL上清液加入IOmLlO %的磺基水楊酸，0.45um濾膜過濾，4°C冷藏靜置60min, 14500rpm離心15min,0.45um濾膜過濾,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對樣品濃縮，濃縮液置于4°C備用； 2)200 μ L反應體系:
Tris-Hcl:80mM
NADP+:1.4mM 二硫蘇糖醇:10mM α -酮戊二酸:2.0mM 硫酸鈉:750mM GABA 酶:30 μ g 樣品溶液JOyL 3)將預處理后的樣品加入上述反應體系反應，反應溫度為30°C，在波長340nm檢測吸光度； 4)將配置好的不同濃度梯度的GABA標準樣品添加到反應體系中，建立標準曲線，未知樣品中GABA含量的根據(jù)標準曲線計算得到。
【文檔編號】G01N21/31GK103487389SQ201310287428
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】姜毓君, 滿朝新, 閆天文 申請人:黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心