一種快速檢測鹽酸克倫特羅試劑盒的研發(fā)與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】發(fā)明公開了一種對鹽酸克倫特羅具特異性的膠體金免疫吸附分析技術(shù)及其檢測試劑盒，屬于生物化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。以鹽酸克倫特羅和鹵代羧酸酯為起始原料合成半抗原，將半抗原與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)分別合成人工抗原和包被原。以所述抗體或包被原包被聚苯乙烯微孔板，以0.5％明膠封閉微孔表面未被吸附的位點(diǎn)。其特征是由盒體及置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板、對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體或包被原、緩沖液、封閉液(也可事先將所述抗體或包被原包被在微孔板上并封閉后置盒體內(nèi))、鹽酸克倫特羅標(biāo)樣、標(biāo)記物、底物液、顯色劑、終止液和使用說明書組成。運(yùn)用上述對鹽酸克倫特羅其特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析技術(shù)，在盒內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備免疫檢測試劑盒，用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品樣本中殘留鹽酸克倫特羅的快速檢測。
【專利說明】 一種快速檢測鹽酸克倫特羅試劑盒的研發(fā)與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測領(lǐng)域，特別涉及一種對鹽酸克倫特羅特異性快速檢測試劑盒的研發(fā)與應(yīng)用。主要應(yīng)用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品等樣本中殘留鹽酸克倫特羅的快速檢測。
【背景技術(shù)】:
[0002]鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)又名雙氯醇胺，氨哮素，克喘素，是一種人工合成的B2-腎上腺素受體激動劑，用于防治支氣管哮喘、哮喘性慢性支氣管炎及肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾病。在獸醫(yī)臨床上，當(dāng)其應(yīng)用劑量達(dá)到治療量的5?10倍、且應(yīng)用時(shí)間較長時(shí)，能降低動物胴體脂肪沉積、增加肌肉的合成。因此又有“瘦肉精”之稱。鹽酸克倫特羅在動物體內(nèi)吸收快、分布廣、半衰期長、易積累，人在食用了殘留有鹽酸克倫特羅的肉品后可能引起心悸、震顫、頭暈、頭痛等癥狀甚至導(dǎo)致死亡。因此，必須加強(qiáng)飼料、尿液、畜產(chǎn)品等樣本中殘留鹽酸克倫特羅有效的監(jiān)測和快速的檢測。
[0003]目前，檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附分析法。采用儀器分析法需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和訓(xùn)練有素的專門人才，對樣品前處理的要求高、過程復(fù)雜、速度慢、選擇性差，難以適應(yīng)大量樣本和現(xiàn)場快速檢測的要求。本發(fā)明的快速檢測鹽酸克倫特羅試劑盒具有靈敏度高、分析成本低、簡便快捷、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量樣品的快速檢測。但現(xiàn)有的鹽酸克倫特羅免疫吸附檢測試劑盒的研制，由于人工抗原的合成是先將鹽酸克倫特羅苯環(huán)上的氨基重氮化，然后在弱堿性條件下與蛋白質(zhì)上的酪氨酸共價(jià)偶聯(lián)，這樣就造成了鹽酸克倫特羅的特異性部分被蛋白質(zhì)大分子掩蓋，所獲抗體與鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)類似物有比較嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，在實(shí)際檢測過程中經(jīng)常出現(xiàn)假陽性，同時(shí)有一些陽性樣品不能被確認(rèn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是提供一種對鹽酸克倫特羅具有高選擇性、高靈敏度，適合飼料、尿液、畜產(chǎn)品等樣本中殘留鹽酸克倫特羅快速檢測的競爭性膠體金免疫吸附分析技術(shù)。
[0005]本發(fā)明的又一個目的是提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、廉價(jià)高效，適合飼料、尿液、畜產(chǎn)品等樣本中殘留鹽酸克倫特羅現(xiàn)場快速檢測的競爭性膠體金免疫吸附檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案一:對鹽酸克倫特羅具有特異性的膠體金免疫吸附分析技術(shù)及其檢測試劑盒，其特征是以鹽酸克倫特羅與鹵代羧酸酯為起始原料。
[0007]所述半抗原是以鹽酸克倫特羅與鹵代羧酸酯為起始原料反應(yīng)生成的衍生物。
[0008]所述人工抗原是采用活性酯法或混合酸酐法將所述半抗原與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)而成。
[0009]以所述抗體或包被原包被聚苯乙烯微孔板，以0.5%明膠封閉微孔表面未被吸附的位點(diǎn)。[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案二:對鹽酸克倫特羅具特異性的膠體金免疫吸附分析檢測試劑盒，其特征是由盒體及置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板、對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體或包被原、緩沖液、封閉液(也可事先將所述抗體或包被原包被在微孔板上并封閉后置盒體內(nèi))、鹽酸克倫特羅標(biāo)樣、標(biāo)記物、底物液、顯色劑、終止液和使用說明書組成。
[0011]運(yùn)用上述對鹽酸克倫特羅其特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析技術(shù)，在盒內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備免疫檢測試劑盒，用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品樣本中殘留鹽酸克倫特羅的快速檢測。試劑盒檢測鹽酸克倫特羅的線性濃度范圍是10?’ IOo Vg/mL，檢鋇4限< 0.1ng/mL0
[0012]本發(fā)明的科學(xué)性強(qiáng)、技術(shù)先進(jìn)，成本低，應(yīng)用方法簡便?；疽罁?jù)是小分子化合物免疫分析化學(xué)原理和技術(shù)。分子量小于5000道爾頓的化合物一般不具備免疫原性，將突出鹽酸克倫特羅分子結(jié)構(gòu)特征的半抗原與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)制備人工抗原和包被原，以人工抗原免疫動物產(chǎn)生對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體。小分子化合物雖然不具備免疫原性但具有反應(yīng)原性，能與相應(yīng)抗體在離體條件下發(fā)生免疫結(jié)合并符合質(zhì)量作用定律。運(yùn)用該技術(shù)，在盒體內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備免疫檢測試劑盒，用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品等樣本中殘留鹽酸克倫特羅的現(xiàn)場快速檢測。通過參看說明書，一般工作人員也可以進(jìn)行現(xiàn)場檢測分析，便于推廣使用和運(yùn)用。
【具體實(shí)施方式】:
[0013]一、對克倫特羅具特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析技術(shù)實(shí)施例
[0014]1、將鹽酸克倫特羅與Y —溴代丁酸酯反應(yīng)生成衍生物共價(jià)偶聯(lián)合成人工抗原和包被原。
[0015]2、用所述抗體包被聚苯乙烯微孔板，以0.59' ο明膠封閉微孔表面未吸附抗體的位點(diǎn)。
[0016]3、在包被好抗體的微孔板的孔中加入待測樣品(或鹽酸克倫特羅標(biāo)樣)與膠體金半抗原的混合液，鹽酸克倫特羅、膠體金半抗原與包被在微孔表面的抗體發(fā)生競爭性結(jié)合，洗滌去除游離物，加入膠體金的底物和顯色劑，膠體金顯色反應(yīng)的強(qiáng)度與結(jié)合在抗體上的膠體金半抗原量成正比，與樣品(或標(biāo)樣)中鹽酸克倫特羅的含量成反比，據(jù)此建立對鹽酸克倫特羅具特異性的固相直接競爭膠體金免疫吸附分析技術(shù)，對待測樣品中的殘留鹽酸克倫特羅進(jìn)行定性定量快速檢測。
[0017]二、對克倫特羅具特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析試劑盒制備實(shí)施例
[0018]1、微孔板的包被將抗體用稀釋20倍的緩沖液溶解成適當(dāng)濃度，加入微孔板的孔中，100VL/孔，4°C吸附過夜。去除孔中的溶液，拍干，加入封閉液150VL/孔，4°C封閉過夜或37°C時(shí)閉2小時(shí)。去除多余的封閉液，拍干，用稀釋20信的緩沖液洗3次，拍干，4°C條件下自然干燥，加干燥劑密封包裝，4°C以下保存?zhèn)溆谩Ｒ部蓪⒖贵w、緩沖液、封閉液分別裝入指定容器，置試劑盒內(nèi)，由用戶在使用前按使用說明自行包被。
[0019]2、標(biāo)樣溶液的配制準(zhǔn)確稱取鹽酸克倫特羅標(biāo)樣0.0lOOg，溶于IOOmL甲醇，4°C保存。
[0020]3、緩沖液的配制 0.2rriol/L NaH2P04 280mL 加 0.2mol/L Na2HP04 720mL、NaN。0.5g溶解混勻，4°C保存。
[0021]4、封閉液的配制5.0g明膠、0.5g NaN3溶于0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液并定容至1L，4°C保存。
[0022]5、底物液的配制0.6g過氧化脲溶于IL檸檬酸一磷酸鹽緩沖液(5.2g檸檬酸、18.4g磷酸H二鈉溶于蒸餾水并定容至IL)，4°C保存。
[0023]6、顯色劑的配制0.44g TMB溶于3.2mL無水乙醇，用檸檬酸一磷酸鹽緩沖液定容至1L，充N2或減壓脫氣，4°C保存。
[0024]7、終止液的配制IOOmL濃硫酸在攪拌下慢慢加入800mL蒸餾水中，冷卻。
[0025]8、試劑分裝各種試劑按要求配制，測定合格后無菌分裝，試劑盒組裝分別將可拆卸微孔板I塊，對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體、鹽酸克倫特羅標(biāo)樣溶液、膠體金半抗原、緩沖液、封閉液、底物液、顯色劑、終止液等各種溶液按不同的劑量綜合融合，研制成一種對鹽酸克倫特羅特異性快速檢測的試劑盒，把使用說明書I份放置在試劑盒內(nèi)指定位置。也可事先將抗體包被在微孔板上并封閉，置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，保存。
【權(quán)利要求】
1.發(fā)明公開了一種對鹽酸克倫特羅具特異性的膠體金免疫吸附分析技術(shù)及其檢測試劑盒，屬于生物化學(xué)分析【技術(shù)領(lǐng)域】。以鹽酸克倫特羅和鹵代羧酸酯為起始原料合成半抗原，將半抗原與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)分別合成人工抗原和包被原。以所述抗體或包被原包被聚苯乙烯微孔板，以0.5%明膠封閉微孔表面未被吸附的位點(diǎn)。其特征是由盒體及置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板、對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體或包被原、緩沖液、封閉液(也可事先將所述抗體或包被原包被在微孔板上并封閉后置盒體內(nèi))、鹽酸克倫特羅標(biāo)樣、標(biāo)記物、底物液、顯色劑、終止液和使用說明書組成。運(yùn)用上述對鹽酸克倫特羅其特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析技術(shù)，在盒內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備免疫檢測試劑盒，用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品樣本中殘留鹽酸克倫特羅的快速檢測。
2.如權(quán)利要求1所述以鹽酸克倫特羅和鹵代羧酸酯為起始原料合成半抗原，半抗原是以鹽酸克倫特羅與鹵代羧酸酯為起始原料反應(yīng)生成的衍生物。
3.如權(quán)利要求1所述將半抗原與不同蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)分別合成人工抗原和包被原。
4.如權(quán)利要求1所述將抗體或包被原包被聚苯乙烯微孔板，以0.5%明膠封閉微孔表面未被吸附的位點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1所述其特征是由盒體及置于盒體內(nèi)的可拆卸式聚苯乙烯微孔板、對鹽酸克倫特羅具特異性親合力的抗體或包被原、緩沖液、封閉液(也可事先將所述抗體或包被原包被在微孔板上并封閉后置盒體內(nèi))、鹽酸克倫特羅標(biāo)樣、標(biāo)記物、底物液、顯色劑、終止液和使用說明書組成。
6.如權(quán)利要求1所述運(yùn)用上述對鹽酸克倫特羅其特異性的競爭性膠體金免疫吸附分析技木，在盒內(nèi)設(shè)置相關(guān)試劑與材料，制備免疫檢測試劑盒，用于飼料、尿液、畜產(chǎn)品樣本中殘留鹽酸克倫特羅的快速檢測。
【文檔編號】G01N33/545GK103439494SQ201310360312
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】陳潔 申請人:常州泰晶生物科技有限公司