一種桔霉素免疫親和柱及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種桔霉素免疫親和柱及其制備方法，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。該免疫親和純化柱利用蛋白G偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠載體上，然后用抗桔霉素的抗體與瓊脂糖上的蛋白G偶聯(lián)。然后再利用交聯(lián)劑對桔霉素抗體—蛋白G-瓊脂糖凝膠載體進(jìn)行交聯(lián)后裝填親和柱。該免疫親和柱主要用于對于食品、飼料、調(diào)味品、酒和飲料以及其他多種樣本中的桔霉素的純化。
【專利說明】一種桔霉素免疫親和柱及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種桔霉素的免疫親和柱及其制備方法，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]紅曲霉在食物中的應(yīng)用已有千年的歷史，近年來，由于它能夠生成多種生理活性物質(zhì)而備受各國的關(guān)注。然而，目前發(fā)現(xiàn)多種長期應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的紅曲霉在產(chǎn)生色素和生理活性物質(zhì)的同時，還能分泌一種真菌毒素-桔霉素(Citrinin)。桔霉素分子式為C13H14O5，分子量250。在無水乙醇或苯一環(huán)己烷中呈檸檬黃針狀結(jié)晶，溶點為175°C。溶于熱酒精、乙酸乙酯、苯、丙酮、氯仿，在二乙醚和乙醇中微溶，不溶于水桔霉素主要作用的靶器官是腎臟，它能夠破壞腎臟的近曲小管，且可以致畸、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而且可以誘發(fā)突變。這些研究結(jié)果都表明桔霉素在食物中存在是不安全的。
[0003]目前桔霉素常用的檢測方法有薄層層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)等。
[0004]薄層色譜測定法(TLC)是最早建立的一種檢測方法，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、對設(shè)備和檢驗人員要求不高等特點，是我國國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法之一。但由于TLC法的精確度低，操作過程復(fù)雜，分析結(jié)果的可重復(fù)性和再現(xiàn)性差，一般作為桔霉素HPLC的前處理方法，且只能對桔霉素進(jìn)行半定量檢測。
[0005]酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)又稱之為免疫測定法，是以免疫抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測技術(shù)，是一類快速、靈敏且操作簡單的分析方法，在毒素和有毒化合物等小分子化合物的檢測中應(yīng)用已十分廣泛，目前已經(jīng)有檢測桔霉素的ELISA方法和產(chǎn)品。但目前檢測桔霉素的ELISA方法的假陽性率偏高。
[0006]高效液相色譜方法(HPLC)高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，是定量分析桔霉素最常用的方法。但使用高效液相色譜檢測桔霉素時，需要先將桔霉素樣品進(jìn)行凈化處理，否則容易受到雜質(zhì)干擾，影響檢測效果。目前常用的凈化處理方法就是固相萃取法，也叫柱層析法。是目前真菌毒素凈化使用最廣泛的方法。其中，免疫親和柱方法的分析速度快，靈敏度高，分離效率和回收率高，安全可靠，因而成為最常用的方法。
[0007]用于目前制備免疫親和純化柱的方法大概有:溴化氰活化直接偶聯(lián)法、環(huán)氧氯丙烷法、過碘酸鈉法等。這些方法的基本原理都是將載體基質(zhì)進(jìn)行化學(xué)活化后，將抗體偶聯(lián)到載體上。但是由于偶聯(lián)是非特異性的，抗體的任何部位都有可能和載體偶聯(lián)，方向性是不可控制的。勢必影響親和純化柱純化桔霉素的效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些缺點，提供一種桔霉素免疫親和柱及其制備方法和用途，從而對樣品特異純化，過柱凈化后的樣品液可直接用于色譜或ELISA等方法對待測物中桔霉素的含量進(jìn)行檢測。
[0009]本發(fā)明的目的在于為了達(dá)到上述目的，在本發(fā)明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細(xì)胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fe部位相結(jié)合。并且具有很高的親和力。我們克隆了蛋白G的基因序列，并且對其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化、重組后，在大腸桿菌中表達(dá)出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。將基因重組的蛋白G偶聯(lián)到載體上后，再將桔霉素抗體偶聯(lián)到蛋白G上，制備出了桔霉素一蛋白G—載體，再用交聯(lián)劑將載體進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)后的載體裝柱后就形成了高親和力的桔霉素免疫親和柱。該親和柱操作簡便，純化桔霉素效率高。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的桔霉素。用于高效液相色譜等的檢測。
[0010]本發(fā)明最大的優(yōu)勢就是利用了蛋白G與Ig抗體特異性結(jié)合的特點，IgG抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，抗體分為Fab區(qū)和Fe區(qū)，其中，F(xiàn)ab區(qū)是抗原結(jié)合的區(qū)域。
[0011]蛋白G是鏈球菌細(xì)胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fe區(qū)域有特異性的結(jié)合能力。蛋白G與抗體結(jié)合后，抗體的Fab區(qū)域游離在外，不影響抗體的抗原結(jié)合能力。經(jīng)過我們基因優(yōu)化重組后的蛋白G，I個分子的蛋白G可以結(jié)合3個分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。并且只有抗體能與蛋白G結(jié)合，其余蛋白均不能與蛋白G結(jié)合，特異性很高。以此蛋白G為基礎(chǔ)制備的免疫親和柱具有特異性好，桔霉素結(jié)合量大，純化效率高的特點。
[0012]桔霉素免疫親和柱及其制備方法說明如下:
1.載體活化
選擇瓊脂糖載體，sepharose4B,以環(huán)氧氯丙燒活化法進(jìn)行活化。
[0013]取2%的預(yù)溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4B,用20倍體積的蒸懼水充分沖洗,洗去殘存的乙醇，用漏斗過濾掉水分。
[0014]稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的環(huán)氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉NaBH4，5毫升，在25°C下?lián)u床反應(yīng)8小時。
[0015]反應(yīng)后，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。
[0016]2.將蛋白G與活化載體sepharose4B的偶聯(lián)
將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液(0.1M的NaHCO3,0.8M NaCl，PH8.9)洗滌3次。每克活化的sepharose4B加入30_200nmol的蛋白G，室溫偶聯(lián)2小時，或者4°C偶聯(lián)過夜。偶聯(lián)產(chǎn)物用IM Tris.HCl PH 8.0室溫反應(yīng)2小時。
[0017]將偶聯(lián)好的瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次。偶聯(lián)有蛋白G的瓊脂糖載體sepharose命名為蛋白G_sepharose。
[0018]3.抗桔霉素抗體與蛋白G-sepharose載體上的蛋白G連接
蛋白G與抗體具有特異性的親和力，在一定的反應(yīng)條件下，將偶聯(lián)有蛋白G的瓊脂糖凝膠與抗體進(jìn)行連接，將抗體連接于瓊脂糖上。由于蛋白G與抗體的結(jié)合部位是抗體的Fe區(qū)域，抗體的抗原結(jié)合區(qū)不受影響，充分保證了抗體的抗原結(jié)合能力。
[0019]將桔霉素抗體溶解在20mM PH7.4的PBS中，每克蛋白G_s印harose加入200nmol-l.2umol抗體，室溫反應(yīng)30分鐘。
[0020]結(jié)合后的載體用PBS洗漆。連接有抗體的載體命名為抗體一蛋白G—sepharose ο
[0021]4.載體交聯(lián)
將抗體一蛋白G— s印harose用20mM PBS PH7.4洗滌3次。然后加入終濃度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3，室溫反應(yīng)I小時。
[0022]加入20mM，PH9.0的乙醇胺終止反應(yīng)，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗漆桔霉素抗體一蛋白G —sepharose載體。
[0023]5.裝柱
將交聯(lián)后的抗體一瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，放于4°C保存可根據(jù)需要制備不同容量的桔霉素親和純化柱。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
I)充分的利用了蛋白G與IgG抗體特異性結(jié)合的特性，使抗體通過蛋白G偶聯(lián)到載體上。并且IgG抗體的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了桔霉素的捕捉能力，桔霉素的純化效率也得到有效提高。
[0025]2)本發(fā)明使用了基因改造后的蛋白G，通過對密碼子的優(yōu)化和IgG結(jié)合域基因的優(yōu)化。使蛋白G的抗體結(jié)合能力大幅度提聞，進(jìn)而提聞了結(jié)霉素的純化效率。
[0026]3)使用本發(fā)明純化桔霉素操作簡便，幾步就可以得到純度較高的桔霉素，更方便操作者使用。
[0027]4)使用本發(fā)明得到的桔霉素純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測，節(jié)省了操作者的時間和費用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:桔霉素免疫親和柱結(jié)構(gòu)示意圖
A:進(jìn)樣口 ； B:柱體；C:篩板；D:桔霉素抗體-蛋白G-sepharose填料 E:篩板；F:出樣口
【具體實施方式】:桔霉素免疫親和純化柱的制備
本發(fā)明制備桔霉素免疫親和純化柱的一個優(yōu)選的實施方案如下:
1.瓊脂糖凝膠活化
取2%的瓊脂糖凝膠s印harose4B，用20倍體積的蒸餾水充分沖洗，洗去殘存的乙醇。用漏斗過濾掉水分。稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的環(huán)氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉NaBH4，5毫升，在25°C下?lián)u床反應(yīng)8小時。
[0029]反應(yīng)后，用50毫升蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。
[0030]2.蛋白G與活化的瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)
取I克活化后的瓊脂糖凝膠，用偶聯(lián)緩沖液(0.1M的NaHCO3,0.8M NaCl,PH8.9)洗滌3次。加入2mg/ml的蛋白G20ml,室溫偶聯(lián)4小時。
[0031 ] 將偶聯(lián)好的瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次。偶聯(lián)有蛋白G的瓊脂糖載體sepharose命名為蛋白G-sepharose。
[0032]3.抗桔霉素IgG單抗與蛋白G-sepharose結(jié)合
將抗桔霉素抗體溶于20mM、PH7.4的PBS中，終濃度2mg/ml，總體積10ml。
[0033]將蛋白G-S印harose用20mM PH7.4的PBS緩沖液洗滌三次，每次30ml。將溶解于PBS中的桔霉素抗體加入洗滌過的蛋白G-s印harose中。室溫結(jié)合30分鐘。
[0034]結(jié)合后的載體用20mM PH7.4的PBS洗滌三次，每次30ml。連接有抗體的載體命名為抗體一蛋白G—sepharose ο
[0035]4.結(jié)合IgG的瓊脂糖sepharose交聯(lián)將抗體一蛋白G— s印harose用0.1M PH9.0的硼酸緩沖液洗滌3次，每次30ml。
[0036]將濕凝膠固體，加入0.1M PH9.0的硼酸緩沖液20ml，在緩沖液中加入交聯(lián)劑庚二亞氨酸二甲酯(DMP)至終濃度20mM。室溫交聯(lián)I小時。
[0037]加入100mM，PH9.0的乙醇胺20ml終止反應(yīng)。并用50mM的乙醇胺20ml封閉10分鐘。
[0038]交聯(lián)后的抗體一蛋白G—sepharose載體用20mM, PH7.4的PBS洗漆3次，每次30ml。
[0039]5.裝柱
將交聯(lián)后的s印harose用10毫升20mM PBS PH7.4重懸，然后裝入空的親和純化柱柱體中。
【權(quán)利要求】
1.一種桔霉素免疫親和柱，其特征在于包含有載體、蛋白G和桔霉素抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于蛋白G通過化學(xué)鍵偶聯(lián)在載體上，桔霉素抗體與蛋白G結(jié)合后用交聯(lián)劑交聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于蛋白G是基因重組表達(dá)的蛋白G。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBank CAA27638.1序列表達(dá)的蛋白G，以及進(jìn)過序列優(yōu)化后表達(dá)的蛋白G。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于所述的序列優(yōu)化的蛋白G，包括針對大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行的蛋白G密碼子進(jìn)行優(yōu)化、對蛋白G進(jìn)行抗體結(jié)合區(qū)域進(jìn)行序列改變以增加親和力以及增加蛋白G基因序列中抗體結(jié)合區(qū)域數(shù)量以提高抗體親和能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于所述的載體是瓊脂糖凝膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠包括有溴化氰活化的瓊脂糖凝膠、交聯(lián)的瓊脂糖凝膠、聚丙烯酸瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠以及纖維素。
8.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的桔霉素免疫親和柱，其特征在于所述的抗桔霉素抗體包括單克隆IgG抗體和多克隆抗體。
9.一種桔霉素免疫親和柱的制備方法，其特征在于: 1)瓊脂糖sepharose4B,加入0.8M的NaOH, 30%的環(huán)氧氯丙燒,2mg/ml的硼氫化鈉NaBH4,在25 °C下?lián)u床反應(yīng)8小時進(jìn)行活化； 2)每克活化的sepharose4B 加入 30_200nmol 的蛋白 G，在 0.1M NaHC03，0.5M NaClPH8.8的緩沖液中，室溫偶聯(lián)2小時，或者4°C偶聯(lián)過夜； 3)偶聯(lián)產(chǎn)物用IMTris.HCl PH 8.0室溫反應(yīng)2小時； 4)偶連好的s印harose-蛋白G，用20mMPH7.4的PBS洗滌； 5)將桔霉素抗體溶解在20mMPH7.4的PBS中，每克蛋白G_s印harose加入200nmol-l.2umol抗體，室溫反應(yīng)30分鐘； 6)將桔霉素抗體一蛋白G—s印harose載體用20mM PBS PH7.4洗滌，然后加入終濃度.0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3，室溫反應(yīng)I小時； 7)用20mMPH7.4的乙醇胺終止反應(yīng)，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌桔霉素抗體一蛋白G —sepharose載體,裝柱,放于4°C保存。
【文檔編號】G01N1/34GK104415572SQ201310401979
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】柳家鵬 申請人:北京華安麥科生物技術(shù)有限公司