一種血清β-羥丁酸試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種血清β-羥丁酸試劑盒及其檢測方法，血清β-羥丁酸試劑盒，它包括R1與R2試劑，R1試劑包含如下組分：磷酸鉀緩沖液100～150mmol/L，PH7～8；輔酶2～5mmol/L；黃遞酶2～5KU/L；氯化硝基四氮唑蘭0.5～1mmol/L；BSA0.5～1g/L；海藻糖2～5g/L；R2試劑包含如下組分：酸鉀緩沖液100～150mmol/L，PH7～8；β-羥丁酸脫氫酶20～50KU/L；BSA2～5g/L。本發(fā)明的試劑盒采用氯化硝基四氮唑蘭作為顯色劑，具有穩(wěn)定性好，線性高，抗干擾能力強和成本低的特點；本發(fā)明的血清β-羥丁酸檢測方法，能有效提高減少非特異性還原物質(zhì)的干擾，消除標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)效應(yīng)和脂濁現(xiàn)象，具有廣泛的市場前景。
【專利說明】一種血清β-羥丁酸試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血清β-羥丁酸的試劑盒及其檢測方法，具體的說是一種酶比色法檢測血清β -羥丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟生成酮體，肝外組織能利用酮體作為能量來源，在正常情況下血中僅含少量酮體；但在某些情況下，如饑餓、糖尿病、高脂低糖膳食等由于脂肪動員增強，肝臟生成酮體量超過肝外組織利用酮體的能力，引起血中酮體的堆積，可導(dǎo)致酮癥酸中毒，特別在糖尿病病人中酮癥酸中毒非常常見。
[0003]對酮癥酸中毒的診斷與療效觀察常需測定血液中酮體的濃度，酮體是脂肪酸分解代謝的產(chǎn)物，包括三種成分:β_羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中β_羥丁酸是主要的成分，約占酮體總量的70%，因此一般以檢測血清β -羥丁酸的濃度反映體內(nèi)酮體的水平。
[0004]血清β -羥丁酸檢測方法有氣相色譜法、分光光度法和酶法，酶法測定血清β -羥丁酸因具有準(zhǔn)確、簡便、快速、靈敏和特異的特點，受到臨床的重視?，F(xiàn)有常用β_羥丁酸試劑盒所用的顯色劑均為ΙΝΤ，即:碘硝基氯化四氮唑藍(lán)；使用INT作為顯色劑存在抗干擾效果不好的特點，因此，如何改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，為廣大患者造福，是亟待解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種血清β_羥丁酸試劑盒及其檢測方法，采用氯化硝基四氮唑蘭作為顯色劑，具有穩(wěn)定性好，線性高，抗干擾能力強和成本低的特點；同時檢測方法解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，有效提高了檢測的準(zhǔn)確度。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，提供一種血清β_羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，所述Rl試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，100?150 mmol/L, PH7?8 ;
輔酶，2 ?5mmol/L ；
黃遞酶，2?5KU/L ；
氯化硝基四氮唑蘭，0.5?lmmol/L ；
BSA,0.5 ?lg/L ；
海藻糖，2?5g/L ；
所述R2試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，100?150 mmol/L, PH7?8 ;
β -羥丁酸脫氫酶，20?50KU/L ；
BSA,2 ?5g/L。
[0007]上述的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟: 第一步，預(yù)備:
提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清β -羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)；
第二步，初步混勻:
取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑240?280ul混勻，置30_45°C孵育3?5分鐘；
第三步，二次混勻:
取R2試劑40?70ul與上述混合液混勻，孵育180?240秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長500?600nm，副波長650?750nm ；第四步，計算:
根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度:
血清β -羥丁酸(mmol/L) = ΔΑ測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ Λ A標(biāo)準(zhǔn)。
[0008]上述的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法,第一步,預(yù)備:
血清β -羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:40?50: 8?12:1o
[0009]上述的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法,第一步,預(yù)備:
標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)，所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為:
用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.15um?0.30um濾膜的過濾器過濾后，添加0.05%?0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點及有益技術(shù)效果:
本發(fā)明的血清β-羥丁酸試劑盒設(shè)計成雙試劑，Rl內(nèi)含β-羥丁酸進(jìn)行反應(yīng)的主要成分，采用磷酸鉀緩沖液，ΡΗ7?8，此PH下有利于氯化硝基四氮唑蘭和其他反應(yīng)物的穩(wěn)定和保存。R2的ΡΗ7?8有利于酶的穩(wěn)定也為反應(yīng)提供適宜的環(huán)境。
[0011]本發(fā)明的血清β-羥丁酸試劑盒檢測血清β-羥丁酸的檢測方法，能有效提高減少非特異性還原物質(zhì)的干擾，消除標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)效應(yīng)和脂濁現(xiàn)象，解決氯化硝基四氮唑蘭在貯存中的析出問題，具有廣泛的市場前景。
[0012]本發(fā)明的血清β -羥丁酸試劑盒檢測血清β -羥丁酸的檢測方法還提供了一種人血清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法，解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，提聞檢測的準(zhǔn)確度。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，Rl和R2均以水為溶劑。
[0014]Rl試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，150 mmol/L，PH7-8 ；
輔酶，5mmol/L ；
黃遞酶，5KU/L ；
氯化硝基四氮唑蘭，lmmol/L ；
BSA，lg/L ；
海藻糖，5g/L ； R2試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，150mmol/L，PH7-8 ；
β -輕丁酸脫氫酶，50KU/L ；
BSA,5g/L。
[0015]本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟:
第一步，預(yù)備:
提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；血清β-羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:40: 8:1。
[0016]其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)；所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為:
用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.15um濾膜的過濾器過濾后，添加0.05%生物防腐劑，混勻，待用。用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
[0017]第二步，初步混勻:
取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑240ul混勻，置30_45°C孵育3分鐘；
第三步，二次混勻:
取R2試劑60ul與上述混合液混勻，孵育210秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長540nm，副波長700nm;AA= A2- Al。
[0018]第四步，計算:
根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度:
血清β -羥丁酸(mmol/L) = ΔΑ測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ Λ A標(biāo)準(zhǔn)。
[0019]實施例2
本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，Rl和R2均以水為溶劑。
[0020]Rl試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，IOOmmo I/L，ΡΗ7-8 ；
輔酶，2mmol/L ；
黃遞酶，2KU/L ；
氯化硝基四氮唑蘭，0.5mmol/L ；
BSA,0.5g/L ；
海藻糖，2g/L ；
R2試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，IOOmmo I/L，PH7-8 ；
β -羥丁酸脫氫酶，20KU/L ；
BSA,2g/L。
[0021]本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟:
第一步，預(yù)備:
提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；血清β-羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:50: 12:1。
[0022]其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)；所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為:
用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.30um濾膜的過濾器過濾后，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
[0023]第二步，初步混勻:
取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑280ul混勻，置30_45°C孵育5分鐘；
第三步，二次混勻:
取R2試劑70ul與上述混合液混勻，孵育240秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長600nm，副波長750nm;AA= A2- Al。
[0024]第四步，計算:
根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度:
血清β -羥丁酸(mmol/L) = ΔΑ測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ Λ A標(biāo)準(zhǔn)。
[0025]實施例3
本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，Rl和R2均以水為溶劑。
[0026]Rl試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，120mmol/L，PH7-8 ；
輔酶，3mmol/L ；
黃遞酶，3KU/L ；
氯化硝基四氮唑蘭，0.6mmol/L ；
BSA,0.7g/L ；
海藻糖，3g/L ；
R2試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，120mmol/L，PH7-8 ；
β -羥丁酸脫氫酶，30KU/L ；
BSA,3g/L。
[0027]本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟:
第一步，預(yù)備:
提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；血清β-羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:45: 10:1。
[0028]其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)；所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為:
用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.20um濾膜的過濾器過濾后，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
[0029]第二步，初步混勻:
取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑265ul混勻，置30_45°C孵育5分鐘；
第三步，二次混勻:
取R2試劑40ul與上述混合液混勻，孵育180秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長500nm，副波長650nm;AA= A2- Al。
[0030]第四步，計算:
根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度:
血清β -羥丁酸(mmol/L) = ΔΑ測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ Λ A標(biāo)準(zhǔn)。[0031]實施例4
本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，Rl和R2均以水為溶劑。
[0032]Rl試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，135mmol/L，PH7-8 ；
輔酶，4mmol/L ；
黃遞酶，4KU/L ；
氯化硝基四氮唑蘭，0.8mmol/L ；
BSA,0.9g/L ；
海藻糖，4g/L ；
R2試劑包含如下組分:
磷酸鉀緩沖液，135mmol/L，PH7-8 ；
β -羥丁酸脫氫酶，40KU/L ；
BSA,4g/L。
[0033]本實施例的血清β -羥丁酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟:
第一步，預(yù)備:
提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；血清β-羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:40: 8:1。
[0034]其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)；所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為:
用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.25um濾膜的過濾器過濾后，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級甚至一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
[0035]第二步，初步混勻:
取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑275ul混勻，置30_45°C孵育4分鐘；
第三步，二次混勻:
取R2試劑50ul與上述混合液混勻，孵育200秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長560nm，副波長720nm;AA= A2- Al。
[0036]第四步，計算:
根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度:
血清β -羥丁酸(mmol/L) = ΔΑ測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ Δ A標(biāo)準(zhǔn)。
[0037]根據(jù)上述實施例1-4的技術(shù)方案得到的實驗測試結(jié)果:
1.本發(fā)明血清中β_羥丁酸測定方法達(dá)到的幾項技術(shù)指標(biāo):
a.測定參考值范圍:0.03~0.3mmol/L
b.線性范圍:0~7mmol/L，判定依據(jù)r2≥0.999 C.精密度:n=30 批內(nèi)=0.12 CV=0.9%
批間=0.123 CV=L 3%
d.準(zhǔn)確度相對偏差≤ ±1%
2.Rl試劑在保存條件下的穩(wěn)定性
將Rl試劑分別置于24~26°C、2~8°C環(huán)境下，一年后復(fù)測以下指標(biāo):
表1 Rl試劑在不同貯存條件下的穩(wěn)定性
【權(quán)利要求】
1.一種血清β-羥丁酸試劑盒，它包括Rl與R2試劑，其特征在于: 所述Rl試劑包含如下組分: 磷酸鉀緩沖液，100?150 mmol/L, PH7?8 ; 輔酶，2 ?5mmol/L ； 黃遞酶，2?5KU/L ； 氯化硝基四氮唑蘭，0.5?lmmol/L ； BSA,0.5 ?lg/L ； 海藻糖，2?5g/L ； 所述R2試劑包含如下組分: 磷酸鉀緩沖液，100?150mmol/L，PH7?8 ; β -羥丁酸脫氫酶，20?50KU/L ； BSA,2 ?5g/L。
2.權(quán)利要求1所述的血清羥丁酸試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，預(yù)備: 提供標(biāo)準(zhǔn)液、血清β -羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑以及待測標(biāo)本；其中，標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)； 第二步，初步混勻: 取6ul待測標(biāo)本和Rl試劑240?280ul混勻，置30_45°C孵育3?5分鐘； 第三步，二次混勻: 取R2試劑40?70ul與上述混合液混勻，孵育180?240秒后，空白管調(diào)零，讀取吸光度Al，90秒后讀吸光度A2，其中，測區(qū)吸光度的主波長500?600nm，副波長650?750nm ；第四步，計算: 根據(jù)如下公式計算得出血清羥丁酸濃度: 血清羥丁酸(mmol/L)= Λ A測定X標(biāo)準(zhǔn)濃度/ΛΑ標(biāo)準(zhǔn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血清β-羥丁酸試劑盒的檢測方法，其特征在于: 第一步，預(yù)備: 血清β -羥丁酸測定試劑盒Rl與R2試劑與待測標(biāo)本的比例為:40?50: 8?12:1o
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血清β-羥丁酸試劑盒的檢測方法，其特征在于: 第一步，預(yù)備: 標(biāo)準(zhǔn)液采用健康人血清為基質(zhì)，所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為: 用健康人血清混合，反復(fù)凍融數(shù)次至上層澄清，取澄清的上層液經(jīng)0.15um?0.30um濾膜的過濾器過濾后，添加0.05%?0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用；用做標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)，經(jīng)二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值。
【文檔編號】G01N21/31GK103528977SQ201310493809
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】李濤, 溫云飛, 牛慶慧 申請人:青島貝美生物技術(shù)有限公司