一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種家畜血液中糖皮質(zhì)激素的檢測方法。是一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法。先將色譜甲醇中加入純度為100％的布地奈德異構(gòu)體和白術(shù)內(nèi)酯III，均勻混合后成對照品，布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052～10.4μg/mL，S(-)為0.047～9.4μg/mL，白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度為8～12μg/mL。然后在干燥帶塞離心管中加入作為內(nèi)標(biāo)物的白術(shù)內(nèi)酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中，白術(shù)內(nèi)酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度。用測定的結(jié)果可根據(jù)公式計算出血清中布地奈德含量。本發(fā)明可為人類的健康起到保障作用。
【專利說明】一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種家畜血液中糖皮質(zhì)激素一布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]布地奈德(Budesonide)為一種糖皮質(zhì)激素類藥物，臨床研究發(fā)現(xiàn)布地奈德主要應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，效果確切。布地奈德跟硫酸特布他林聯(lián)合治療毛細(xì)支氣管炎療效顯著；同時布地奈德與沙丁胺醇聯(lián)合應(yīng)用霧化吸入治療慢性阻塞性肺病(COPD)較單一用藥療效確切，可明顯提高患者生活質(zhì)量。布地奈德與西替利嗪、氟美松可以早期干預(yù)支原體肺炎咳嗽癥狀。布地奈德霧化吸入對兒童咳嗽變異性哮喘具有明顯的療效。 [0003]糖皮質(zhì)激素類藥物也是目前獸醫(yī)臨床中應(yīng)用最廣泛的藥物之一，為獸醫(yī)臨床上最有效的抗炎藥物。不少基層獸醫(yī)在日常的診療工作中積累了豐富的經(jīng)驗，形成了各自的用藥體系。然而，由于各種原因，糖皮質(zhì)激素藥物正出現(xiàn)嚴(yán)重濫用的現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計我國剛進(jìn)入21世紀(jì)時糖皮質(zhì)激素藥物原料生產(chǎn)總量為150噸左右，其中地塞米松產(chǎn)量不到20噸，超過50 %用于出口。之后每年以超過前一年10 %的速度遞增，至2007年受全國范圍暴發(fā)高致病性藍(lán)耳病的影響，全年產(chǎn)量一度達(dá)到300噸，其中以地塞米松產(chǎn)量增長最快，然而據(jù)我國農(nóng)業(yè)部2008年公告，每年獸用地塞米松有很大一部分是不合理的濫用。盲目濫用此類藥物引起藥物殘留，不僅對畜禽機體造成很大的傷害，還可以通過環(huán)境或食物鏈遷移，最終可能損害人類的自身健康。
[0004]糖皮質(zhì)激素外用可降低毛細(xì)血管的通透性，減少滲出和細(xì)胞浸潤，具有抗炎、抗過敏、抗休克、免疫抑制等多種作用，臨床應(yīng)用廣泛。但長期接觸糖皮質(zhì)激素易導(dǎo)致皮膚變薄、發(fā)紅、發(fā)癢，出現(xiàn)血糖升高、高血壓、骨質(zhì)疏松、胎兒畸形、免疫功能下降等副作用。短時間使用含糖皮質(zhì)激素的化妝品可抑制皮膚發(fā)炎，恢復(fù)皮膚彈性，減少皺紋或治療粉刺，促進(jìn)毛發(fā)生長；但長期使用含有糖皮質(zhì)激素的化妝品就可導(dǎo)致各種副作用，產(chǎn)生激素依賴性，甚至可導(dǎo)致癌癥。近年來糖皮質(zhì)激素藥物濫用的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，引起的公共衛(wèi)生事件使人們越來越意識到糖皮質(zhì)激素藥物濫用的危害性。濫用糖皮質(zhì)激素藥物不僅嚴(yán)重影響我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也對人類自身健康構(gòu)成了威脅。因此我們應(yīng)該采取有效措施減少糖皮質(zhì)激素藥物在我國畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上的濫用，保證我國養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，提高生產(chǎn)經(jīng)濟效益，維護人類自身的生命安全。
[0005]現(xiàn)有的檢測布地奈德的方法------高效液相色譜法，其具有測試結(jié)果準(zhǔn)確的特
點；可是其存在著以下不足之處:
[0006]1.檢測基質(zhì)(原料藥或制劑基質(zhì))較干凈，雜質(zhì)少，易于分離；而本研究為生物樣品——動物血液中布地奈德檢測,基質(zhì)復(fù)雜。
[0007]2.流動相選用較復(fù)雜，酸性較強，對色譜柱不利。
[0008]3.大多采用外標(biāo)法定量，難以保證檢測方法的準(zhǔn)確性；而本研究內(nèi)標(biāo)物選擇較適中。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，采用該方法檢測布地奈德異構(gòu)體具有準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。
[0010]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)、在色譜甲醇中加入純度為100%的布地奈德異構(gòu)體和白術(shù)內(nèi)酯III，均勻混合后成對照品；布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052?10.4μ g/mL，S(-)為0.047?9.4 μ g/mL,白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度為8?12 μ g/mL ；
[0012]2)、在干燥帶塞離心管中加入作為內(nèi)標(biāo)物的白術(shù)內(nèi)酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，然后將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中；白術(shù)內(nèi)酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度；
[0013]3)、在上述步驟2)所得的離心管中加入4.5?5.5mL的提取試劑；
[0014]4)、將步驟3)所得的離心管振蕩混勻后以4000?10000r/min進(jìn)行離心，獲取全部有機相；并對所獲取的有機相進(jìn)行干燥處理；
[0015]5)、將上述干燥處理后的有機相溶解于體積比=40:60的乙腈與水組成的0.2mL流動相中，15000?30000r/min離心后,獲取液體層；
[0016]6)、將步驟I)所得的對照品和步驟5)所得的液體層分別進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測條件如下:以體積比=40:60的乙腈與水作為流動相,流速0.5?1.0mL/min、進(jìn)樣量10?20 μ L、檢測波長為240nm、色譜柱溫度為30攝氏度；分別獲得對照品以及液體層中布地奈德異構(gòu)體與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比；
[0017]7)、根據(jù)以下計算公式獲得待測動物血清中布地奈德異構(gòu)體的含量:
[0018]待測動物血清中布地奈德R(+)的含量=液體層中布地奈德R(+)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比X布地奈德R(+)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德R(+)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比。
[0019]待測動物血清中布地奈德S(_)的含量=液體層中布地奈德S(_)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比X布地奈德s(-)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德s(-)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比。
[0020]作為本發(fā)明的動物血清中布地奈德異構(gòu)體的同時定量檢測方法的改進(jìn):步驟3)中的提取試劑為乙酸乙酯。
[0021]作為本發(fā)明的動物血清中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法的進(jìn)一步改進(jìn):步驟2)中于40?50°C水浴中氮氣流吹干離心管。
[0022]作為本發(fā)明的動物血清中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法的進(jìn)一步改進(jìn):步驟4)中離心后，去除液體層；然后于40?50°C水浴中氮氣流吹干離心管，得干燥處理后的有機相。
[0023]作為本發(fā)明的動物血清中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法的進(jìn)一步改進(jìn):步驟I)中白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度為10μ g/mL，步驟3)中加入5mL的乙酸乙酯。
[0024]當(dāng)待檢動物血清時，采用本發(fā)明的方法能得知每mL待檢血清中含有多少Ug的布地奈德異構(gòu)體。本發(fā)明的動物血清中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，采用了高效液相色譜(HPLC)方法，因此能使檢測限達(dá)到微克級，完全能夠滿足動物血液中的激素的檢測要求。而且高效液相色譜(HPLC)方法具有分離和分析定量的功能，能夠?qū)⒀逯屑に厣V峰和雜質(zhì)干擾峰分離開，進(jìn)行定量分析，能避免了血清中的雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，從而確保了檢測結(jié)果的正確性。
[0025]為了證明本發(fā)明方法的正確性，發(fā)明人做了如下的對比實驗:
[0026]選用一種已經(jīng)確定不含布地奈德的動物血清，其色譜圖如圖2所示(色譜分析檢測條件同本發(fā)明)。在該種化妝品中加入不同重量的布地奈德異構(gòu)體，從而形成含有不同濃度布地奈德的待測樣品。對上述待測樣品分別用本發(fā)明的方法和分光光度計方法進(jìn)行檢測；結(jié)果如表1所述:
[0027]表1
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，其特征在于:在檢測時，首先在色譜甲醇中加入純度為100%的布地奈德異構(gòu)體和白術(shù)內(nèi)酯III，均勻混合后成對照品；布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052?10.4μ g/mL，S(_)為0.047?9.4μ g/mL，白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度為8?12 μ g/mL，然后在干燥帶塞離心管中加入作為內(nèi)標(biāo)物的白術(shù)內(nèi)酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，然后將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中；白術(shù)內(nèi)酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術(shù)內(nèi)酯III在對照品中的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，其特征在于:所說的離心管中加入4.5?5.5mL的提取試劑，對所得的離心管振蕩混勻后以4000?10000r/min進(jìn)行離心，獲取全部有機相，并對所獲取的有機相進(jìn)行干燥處理。
3.權(quán)利如要求2所述的一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，其特征在于:將干燥處理后的有機相溶解于體積比=40:60的乙腈與水組成的0.2mL流動相中，15000?30000r/min離心后，獲取液體層。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，其特征在于:將獲取的液體層和對照品的液體分別進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測條件如下:以體積比=40:60的乙腈與水作為流動相，流速0.5?1.0mL/min、進(jìn)樣量10?20 μ L、檢測波長為240nm、色譜柱溫度為30攝氏度，分別獲得對照品以及液體層中布地奈德異構(gòu)體與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比。
5.如權(quán)利要求1所述的一種家畜血液中布地奈德異構(gòu)體的定量檢測方法，其特征在于:根據(jù)以下計算公式獲得待測動物血清中布地奈德異構(gòu)體的含量，待測動物血清中布地奈德R(+)的含量=液體層中布地奈德R(+)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比X布地奈德R(+)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德R(+)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比，待測動物血清中布地奈德S(-)的含量=液體層中布地奈德S(-)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比X布地奈德S(-)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德S(-)與白術(shù)內(nèi)酯III的吸收峰面積比。
【文檔編號】G01N30/02GK103616442SQ201310524887
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】徐愛春, 張雪梅, 葛建 申請人:中國計量學(xué)院