包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法
【專利摘要】一種包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法,其步驟如下:處理液制備:取0.01moL/LpH7.2磷酸鹽緩沖溶液1L,加熱至沸騰并保持3分鐘;然后冷卻至室溫;然后依次加入牛血清蛋白10~40g、卵清蛋白(OVA)10~40g,攪拌混合均勻;再加入疊氮鈉0.010~0.040g、硫柳汞鈉鹽0.1~0.60g,攪拌混合均勻,即制得處理液處理包被有免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條。經(jīng)處理液處理的酶標(biāo)條,其制備成本低,且保存期限長。
【專利說明】包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)藥免疫檢測技術(shù),尤其是應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域中,對于農(nóng)藥殘留成分檢測。在通過酶聯(lián)免疫檢測農(nóng)藥殘留時,酶聯(lián)免疫檢測時的包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條需要保持活性。本發(fā)明具體涉及的是包被免疫球蛋白酶標(biāo)條的保存處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]ELISA檢測技術(shù)是近幾十年發(fā)展起來的新技術(shù),其核心是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。在直接競爭法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)過程中,需要將特異性抗體(IgG, Immunoglobulin,免疫球蛋白)包被在酶標(biāo)條上,然后進行相關(guān)的實驗。由于免疫球蛋白屬于活性蛋白,包被在酶標(biāo)條上后如果不進行適當(dāng)?shù)募夹g(shù)處理,很快就會因為細菌等污染而變質(zhì),失去活性,導(dǎo)致酶標(biāo)條失效。目前,生產(chǎn)包被免疫球蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒的公司在試劑盒組分上大都申請專利公開技術(shù)進行保護,但是對于酶標(biāo)條的保存處理技術(shù),作為核心技術(shù),在文獻中都沒有公開。
[0003] 申請人:作為出入境檢驗單位,需要經(jīng)常對各種食品的農(nóng)藥殘留進行檢測。目前采用農(nóng)藥免疫檢測技術(shù)進行檢測。首先要將農(nóng)藥分子與載體蛋白質(zhì)連接起來,人工合成農(nóng)藥-載體蛋白質(zhì)結(jié)合物免疫原,然后以此免疫動物制備特異性抗血清。在直接競爭ELISA法的實驗中,要將特異性抗血清的IgG分離出來并人工合成酶標(biāo)半抗原,進而建立免疫學(xué)檢測方法。農(nóng)藥免疫學(xué)檢測方法與傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析方法相比,具有不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備,操作簡便,樣品前處理簡單,檢測快速,檢測容量大,成本低廉等特點,因此具有潛在的廣泛的應(yīng)用價值。目前農(nóng)藥免疫檢測技術(shù)中酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留檢測。由于經(jīng)常需要應(yīng)用到包被免疫球蛋白的酶標(biāo)條,由于外購成本高昂,因此需要自制,但是自制的酶標(biāo)條如果當(dāng)下不使用,則無法保存,因此在每次檢驗測試前都需制備酶標(biāo)條,造成檢測時間比較長。因此如何保持自制的酶標(biāo)條的長期內(nèi)保持活性,成了難題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種包被免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條的保存處理方法,該保存處理方法簡單,能夠保證自制的酶標(biāo)條活性達4個月之久。
[0005]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法,其步驟如下:1)處理液制備:取0.01moL/L pH7.2磷酸鹽緩沖溶液1L,加熱至沸騰并保持3分鐘;然后冷卻至室溫;然后依次加入牛血清蛋白10?40g、卵清蛋白(OVA)IO?40g,攪拌混合均勻;再加入疊氮鈉0.010?0.040g、硫柳汞鈉鹽0.1?0.60g,攪拌混合均勻,即制得處理液備用;
2)利用步驟2)制備的所述處理液處理包被有特異性抗體免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條,在所述酶標(biāo)條每孔中加入所述處理液400 μ L,于37°C條件下水浴Ih ;將所述酶標(biāo)條甩干,拍干殘余的水分;裝進鋁箔袋充入氮氣在4°C保存。[0006]所述酶標(biāo)條制備方法為,首先將免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸鹽緩沖液按照1:100稀釋比進行稀釋獲得免疫球蛋白IgG稀釋使用液;在酶標(biāo)條每孔中加入IOOul包被緩沖液,然后用免疫球蛋白IgG稀釋使用液從酶標(biāo)條第I孔開始橫向倍比稀釋,5°C包被過夜,次日倒掉包被緩沖液,每孔加250ul磷酸鹽緩沖溶液0.01moL/L pH7.2洗滌三次,每次間隔三分鐘,制得所述酶標(biāo)條。碳酸鹽緩沖液配制:0.10.lmol/L的碳酸鈉1.1mL,加入8.9mL0.lmol/L碳酸鈉中,混合后加水定容至100mL。
[0007]本發(fā)明的包被有免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條通過處理液處理進行保存,通過實驗測試可知,處理過的酶標(biāo)條在2?8°C條件下至少可以保存4個月之久。本發(fā)明的處理液處理的酶標(biāo)條,通常用于進行食品中農(nóng)藥殘留檢測。
[0008]對于經(jīng)本發(fā)明的處理液處理過的包被免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條的活性檢測應(yīng)用的ELISA直接競爭法。其檢測原理,以農(nóng)藥甲霜靈的檢測為例。首先制備甲霜靈免疫原,然后進行動物免疫制備特異性抗體免疫球蛋白IgG,然后進行在在酶標(biāo)條上包被免疫球蛋白IgG,在包被的酶標(biāo)條中加入待測標(biāo)本和酶標(biāo)記的半抗原中進行競爭反應(yīng)結(jié)合,加入酶底物顯色液、終止液,利用酶標(biāo)儀讀取吸光光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。進行處理過的酶標(biāo)條活性測試時,將待測標(biāo)本替換為濃度已知的甲霜靈抗原標(biāo)本,與測試結(jié)果的濃度對比可知酶標(biāo)條的活性保持程度。
【具體實施方式】
[0013]現(xiàn)結(jié)合實例對本發(fā)明的包被免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條保存處理方法進行具體說明。本發(fā)明涉及的試劑均為分析純。
[0014]特異性抗體免疫球蛋白IgG制備為本領(lǐng)域公知技術(shù)。通過免疫原(完全抗原)對動物進行免疫得到特異性抗血清,通過血清分離提純獲得特異性抗體免疫球蛋白IgG,并在-20°C下保存用于后續(xù)試驗試用。在本實施例中以農(nóng)藥甲霜靈為例。甲霜靈由于是小分子,其需要和載體蛋白結(jié)合成為免疫原,載體蛋白一般選擇牛血清蛋白或卵清蛋白。利用制備的免疫原對家兔免疫,免疫四次,持續(xù)時間約4個月,獲得特異性血清,對特異性血清分離,獲得甲霜靈多克隆抗體,即特異性抗體免疫球蛋白IgG,于-20°C下保存。
[0015]由于本發(fā)明對包被有免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條保存處理方法,因此,首先需要制備免疫球蛋白IgG酶標(biāo)條的包被,在本實施例中酶標(biāo)條。
[0016]首先取-20°C保存的免疫球蛋白IgG50yL,加入PH9.1碳酸鹽緩沖液450yL,稀釋成1: 10的儲備液,然后再用碳酸鹽緩沖液稀釋至1: 100的使用液。在酶標(biāo)條每孔中加入100 μ L碳酸鹽緩沖液,然后用1: 100免疫球蛋白IgG的使用液在酶標(biāo)條上從第I孔開始橫向倍比稀釋,共8個稀釋度,每孔100 μ L,5°C包被過夜。次日用0.01moL/L pH7.2的PBS溶液,即磷酸鹽緩沖液進行清洗,清洗3次,每次每孔加250 μ L,每次間隔3分鐘,清洗完畢后等待進一步技術(shù)處理。碳酸鹽緩沖液配制:0.10.lmol/L的碳酸鈉1.1mL,加入8.9mL0.lmol/L碳酸鈉中,混合后加水定容至100mL。
[0017]制備處理液:取0.01moL/L pH7.2的PBS溶液1L,在電加熱板上加熱至沸騰,并保持3分鐘。蓋上無菌的表面皿冷卻至室溫。依次加入牛血清蛋白(BSA) 10?40g、卵清蛋白(OVA) 10?40g,蓋上無菌的表面皿,然后在磁力攪拌器上攪拌10分鐘。然后再加入疊氮鈉0.010 ~ 0.040g、硫柳汞鈉0.1?0.60g,攪拌10分鐘,備用。[0018]向上述包被有免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條每孔中加入制備的處理液400 μ L,于37°C烘箱中水浴lh。將酶標(biāo)條甩干,并將其在預(yù)先滅菌過的卷紙上拍干殘余的水分。裝進鋁箔袋充入一定量的氮氣4°C保存。
[0019]處理液制備中,維持無菌的環(huán)境很重要,首要對磷酸鹽緩沖液進行滅菌,在處理液中加入牛血清蛋白及卵清蛋白,可以封閉酶標(biāo)條上包被的免疫球蛋白IgG的自由基,同時利用疊氮鈉和硫柳汞鈉鹽作為防腐劑進行進一步處理。
[0020]經(jīng)處理液處理的包被有免疫球蛋白IgG酶標(biāo)條的活性檢測實例
為了保持實驗的準(zhǔn)確性,采用的酶標(biāo)半抗原為_20°C甘油保存確保它的原始活性,而且有關(guān)酶標(biāo)條的綜合實驗都采用直接競爭ELISA法,標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶,底物溶液為商用的TMB商用的TMB (3,3’,5,5’ -四甲基聯(lián)苯胺),終止液為2moL/L硫酸,測定其活性變化。
[0021]經(jīng)處理液處理的免疫球蛋白IgG包被的酶標(biāo)條在37°C時的保存期限
免疫球蛋白IgG包被過的酶標(biāo)條必須經(jīng)過處理液適當(dāng)?shù)奶幚?才能在2-8°C條件下放置4個月左右。不經(jīng)過處理的酶標(biāo)條在37°C的環(huán)境中不超過24小時就會喪失全部的活性。大量的實驗表明,處理后的酶標(biāo)條在37°C的環(huán)境中72小時后,仍然能保持良好的活性。實驗結(jié)果見表一。表一為經(jīng)處理液處理的包被免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條在37°C條件下保存期限測試的吸光光度值。檢測標(biāo)準(zhǔn)品為8瓶甲霜靈系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,標(biāo)準(zhǔn)溶液甲霜靈濃度為 25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、l.5625ng/ml、0.7812ng/ml、0.3906ng/ml、Ong/mlo
[0022]表一
【權(quán)利要求】
1.一種包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法,其步驟如下:1)處理液制備:取0.0lmoL/L pH7.2磷酸鹽緩沖溶液I L,加熱至沸騰并保持3分鐘;然后冷卻至室溫;然后依次加入牛血清蛋白10?40g、卵清蛋白(OVA) 10?40g,攪拌混合均勻;再加入疊氮鈉0.010?0.040 g、硫柳汞鈉鹽0.1?0.60 g,攪拌混合均勻,即制得處理液備用; 2)利用步驟2)制備的所述處理液處理包被有特異性抗體免疫球蛋白IgG的酶標(biāo)條,在所述酶標(biāo)條每孔中加入所述處理液400 μ L,于37°C條件下水浴I h ;將所述酶標(biāo)條甩干,拍干殘余的水分;裝進鋁箔袋充入氮氣在4°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包被免疫球蛋白(IgG)酶標(biāo)條的保存處理方法,其特征在于所述酶標(biāo)條制備方法為,首先將免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸鹽緩沖液按照1:100稀釋比進行稀釋獲得免疫球蛋白IgG稀釋使用液;在酶標(biāo)條每孔中加入IOOul包被緩沖液,然后用免疫球蛋白IgG稀釋使用液從酶標(biāo)條第I孔開始橫向倍比稀釋,5°C包被過夜,次日倒掉包被緩沖液,每孔加250ul磷酸鹽緩沖溶液0.01moL/L pH7.2洗滌三次,每次間隔三分鐘,制得所述酶標(biāo)條。
【文檔編號】G01N33/68GK103698532SQ201310631105
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】周洪斌 申請人:鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心