小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法及構(gòu)建方法，檢測方法包括以下步驟：（1）對照品溶液的配制；（2）供試品溶液的制備；（3）采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。本發(fā)明能有效表征小兒七星茶制劑的質(zhì)量，有利于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量；具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)；可快速、準(zhǔn)確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
【專利說明】小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥制劑質(zhì)量控制方法，特別是涉及小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法及構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小兒七星茶制劑以中藥材薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹葉、鉤藤、蟬蛻、甘草為原料，經(jīng)水提取后，按常規(guī)的制藥工藝制成。具有開胃消滯，清熱定驚的功效，用于小兒積滯化熱，消化不良，不思飲食，煩躁易驚，夜寐不安，大便不暢，小便短赤。小兒七星茶制劑在中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊中收載有小兒七星茶沖劑(顆粒)、小兒七星茶糖漿，是兒科常用的中藥制劑，深受患者歡迎。現(xiàn)已有小兒七星茶口服液等劑型上市銷售。
[0003]《中華人民共和國藥典》2010年版一部主要采用薄層色譜法鑒別是否含有山楂、甘草，采用高效液相色譜法測定其甘草苷的含量。
[0004]曾常青等在“小兒七星茶沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”，中成藥，2006年03期:報道了采用薄層層析鑒別小兒七星茶沖劑稻芽、山楂、甘草和鉤藤，用反相高效液相測定其鉤藤堿含量的方法。
[0005]肖樹雄等在“小兒七星茶糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究”，中成藥，2008年07期，報道了采用薄層色譜法制定小兒七星茶糖漿鉤藤、甘草的薄層色譜鑒別，用高效液相色譜法測定甘草中甘草酸單銨鹽含量的方法。
[0006]李冬等在“HPLC測定小兒七星茶沖劑中槲皮素含量”，中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2012年06期，報道了采用HPLC法測定小兒七星茶沖劑中槲皮素含量的方法。
[0007]以上方法均是對小兒七星茶制劑中個別成分進(jìn)行鑒別或含量測定，對小兒七星茶制劑質(zhì)量控制方法有待進(jìn)一步完善。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]基于此，有必要針對上述問題，提供一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法及構(gòu)建方法。
[0009]具體的技術(shù)方案如下:
[0010]一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法，采用高效液相色譜進(jìn)行檢測，包括以下步驟:
[0011](I)對照品溶液的配制:
[0012]將甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸對照品各取10mg，分別用體積百分比濃度為28-32%的乙醇溶液溶解并定容至20mL，搖勻；將胱氨酸、酪氨酸各取10mg，分別用0.08-0.12mol/mL鹽酸溶解并定容至20mL，搖勻；得19種氨基酸溶液；
[0013]分別吸取上述氨基酸溶液，分別加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯(PITC)的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得19種氨基酸單一對照品溶液；取等量的上述19種氨基酸單一對照品溶液，構(gòu)成19種氨基酸混合對照品溶液；
[0014](2)供試品溶液的制備:
[0015]取小兒七星茶制劑樣品，上陽離子樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗液；再用氨水洗脫，收集氨洗液；將上述氨洗液減壓濃縮，吸取濃縮液，加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得供試品溶液；所述小兒七星茶制劑樣品為小兒七星茶糖漿、小兒七星茶口服液或用蒸餾水溶解后的小兒七星茶顆粒；
[0016](3)測定:
[0017]分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定。
[0018]在其中一些實(shí)施例中，所述步驟(3)中的高效液相色譜儀的條件為:色譜柱以碳十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料，流動相:0.025mol/L乙酸鈉溶液為流動相A，乙腈為流動相B,采用梯度洗脫方式；流速:lmL/min ;檢測波長:254nm。
[0019]在其中一些實(shí)施例中，所述乙酸鈉溶液用體積百分比濃度為36%的乙酸調(diào)pH值為6。
[0020]在其中一些實(shí)施例中，所述步驟(2)中所述氨水洗脫為先用1.8-2.2mol/L氨水洗脫，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脫,收集氨洗液。
[0021]本發(fā)明還提供一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0022]( I)對照品溶液的配制:
[0023]將甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸對照品各取10mg，分別用體積百分比濃度為28-32%的乙醇溶液溶解并定容至20mL，搖勻；將胱氨酸、酪氨酸各取10mg，分別用0.08-0.12mol/mL鹽酸溶解并定容至20mL，搖勻；得19種氨基酸溶液；
[0024]分別吸取上述氨基酸溶液，分別加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯(PITC)的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得19種氨基酸單一對照品溶液；取等量的上述19種氨基酸單一對照品溶液，構(gòu)成19種氨基酸混合對照品溶液；
[0025]( 2 )供試品溶液的制備:
[0026]取小兒七星茶制劑樣品，上陽離子樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗液；再用氨水洗脫，收集氨洗液；將上述氨洗液減壓濃縮，吸取濃縮液，加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得供試品溶液；所述小兒七星茶制劑樣品為小兒七星茶糖漿、小兒七星茶口服液或用蒸餾水溶解后的小兒七星茶顆粒；
[0027](3)測定:
[0028]分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，構(gòu)建指紋圖譜，得到由11個共有特征峰構(gòu)成的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜。[0029]在其中一些實(shí)施例中，所述步驟(3)為:分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，以脯氨酸峰為參照峰，其相對保留時間、相對峰面積為1.0，構(gòu)建得到由11個共有特征峰構(gòu)成的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜。
[0030]在其中一些實(shí)施例中，所述步驟(3)中的高效液相色譜儀的條件為:色譜柱以碳十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料，流動相:0.025mol/L乙酸鈉溶液為流動相A，乙腈為流動相B,采用梯度洗脫方式；流速:lmL/min ;檢測波長:254nm。
[0031]在其中一些實(shí)施例中，所述乙酸鈉溶液用體積百分比濃度為36%的乙酸調(diào)pH值為6。
[0032]在其中一些實(shí)施例中，所述步驟(2)中所述氨水洗脫為先用1.8-2.2mol/L氨水洗脫，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脫,收集氨洗液。
[0033]本發(fā)明相較于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及有益效果為:
[0034]本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)以及長久積累的經(jīng)驗(yàn)，確定了小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法以及構(gòu)建方法，并確定了檢測方法及構(gòu)建方法中對照品溶液配制(如采用加入三乙胺的乙腈溶液、PITC的乙腈溶液進(jìn)行對照品溶液的配制)以及整個檢測過程及構(gòu)建過程的最優(yōu)參數(shù)，有效表征小兒七星茶制劑的質(zhì)量，有利于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量；具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)；可快速、準(zhǔn)確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1為小兒七星茶10批次樣品的原始指紋圖譜，其中Sl-SlO分別為10批小兒七星茶樣品，橫坐標(biāo)為:保留時間，縱坐標(biāo)為:峰高；
[0036]圖2為小兒七星茶樣品的HPLC指紋圖譜，其中，S1-空白溶液圖譜，S2-19種氨基酸混合對照品溶液圖譜，S3-供試品溶液圖譜，橫坐標(biāo)為:保留時間，縱坐標(biāo)為:峰高；
[0037]圖3為小兒七星茶10批次樣品匹配后的指紋圖譜，其中Sl-SlO分別為10批小兒七星茶樣品，R為:小兒七星茶制劑氨基酸的對照指紋圖譜，橫坐標(biāo)為:保留時間，縱坐標(biāo)為:峰聞；
[0038]圖4為小兒七星茶制劑氨基酸的對照指紋圖譜，橫坐標(biāo)為:保留時間，縱坐標(biāo)為:峰高。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0040]實(shí)施例1
[0041]小兒七星茶制劑氨基酸類成分指紋圖譜的構(gòu)建
[0042]I儀器與設(shè)備
[0043]島津LC一20AD高效液相色譜儀(島津公司)；
[0044]Sartorius CP22? 分析天平(d=0.0lmg)(德國 Sartorius 公司)；
[0045]Ratavapor R-1I旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司)；
[0046]SHZ-D (III)循環(huán)水式正空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；
[0047]RTHW電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；
[0048]SK-1快速混勻機(jī)(江蘇金壇市佳美儀器廠);[0049]2材料與試劑
[0050]小兒七星茶顆粒樣品(由廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司提供)；
[0051]19種氨基酸對照品:甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸、胱氨酸、酪氨酸(中國藥品生物制品檢定所);
[0052]苯異硫氰酸酯(PITC)(色譜純，SIGMA公司)；
[0053]乙腈(色譜純，Merk公司)；
[0054]三乙胺(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；
[0055]正己烷(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；
[0056]氨水(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；
[0057]36%乙酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；
[0058]無水乙酸鈉(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；
[0059]乙醇(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；
[0060]鹽酸(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；
[0061]蒸餾水。
[0062]3 方法
[0063]3.1衍生試劑的配制
[0064]3.1.1PITC的乙腈溶液的配制:PITC (苯異硫氰酸酯)54μ L與乙腈3mL混勻，得體積百分比濃度為1.8%的苯異硫氰酸酯(PITC)的乙腈溶液；
[0065]3.1.2三乙胺的乙腈溶液的配制:三乙胺417 μ L與乙腈2.583mL混勻，得體積百分比濃度為16%的三乙胺的乙腈溶液。
[0066]3.2對照品溶液的配制
[0067]將甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸對照品各取10mg，精密稱定，分別用少量體積百分比濃度為30%的乙醇溶液溶解于20mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻；將胱氨酸、酪氨酸各取10mg，精密稱定，分別用少量0.1mol/mL鹽酸溶解于20mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，即得；得19種氨基酸溶液；
[0068]分別精密吸取上述氨基酸溶液各lmL，分別精密加入ImL體積百分比濃度為16%的三乙胺的乙腈溶液、ImL體積百分比濃度為1.8%的PITC的乙腈溶液，渦旋混勻lmin，室溫放置lh，加入正己烷3mL萃取，取下層溶液，微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，即得19種氨基酸單一對照品溶液；取上述19種氨基酸單一對照品溶液各100 μ L，構(gòu)成19種氨基酸混合對照品溶液。
[0069]3.3ΧΖ-2陽離子樹脂的預(yù)處理
[0070]ΧΖ-2陽離子樹脂先用10% (質(zhì)量百分比)食鹽水浸泡一天，再用蒸餾水洗至清液，然后用7% (體積百分比)鹽酸浸泡一天，用蒸餾水洗至中性，即得。
[0071]3.4供試品溶液的制備
[0072]取小兒七星茶樣品顆粒4g，用少量蒸餾水溶解(蒸餾水的用量為足以溶解小兒七星茶樣品顆粒即可)，上XZ-2陽離子樹脂，先用IOOmL蒸餾水洗脫，棄去水洗液；再用2mol/L氨水600mL洗脫，收集氨洗液；最后用lmol/L氨水IOOmL洗脫，收集氨洗液；將上述氨洗液減壓濃縮至12.5mL。精密吸取濃縮液lmL，精密加入ImL體積百分比濃度為16%的三乙胺的乙腈溶液、ImL體積百分比濃度為1.8%的PITC的乙腈溶液，渦旋混勻lmin，室溫放置lh，加入正己烷3mL萃取，取下層溶液，微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，即得小兒七星茶供試品溶液。
[0073]3.5色譜條件
[0074]色譜儀:島津LC一20AD高效液相色譜儀；
[0075]色譜柱:SymmetryShiedTM PR18柱(3.9_X 2mm, 5 μ m),以碳十八烷基娃烷基鍵合硅膠為填料；
[0076]流動相:0.025mol/L乙酸鈉(36% (體積百分比)乙酸調(diào)為pH6)溶液㈧一乙腈(B)梯度洗脫:
[0077]表1流動相的梯度洗脫
[0078]
【權(quán)利要求】
1.一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，采用高效液相色譜進(jìn)行檢測，包括以下步驟: (1)對照品溶液的配制: 將甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸對照品各取10mg，分別用體積百分比濃度為28-32%的乙醇溶液溶解并定容至20mL，搖勻；將胱氨酸、酪氨酸各取10mg，分別用0.08-0.12mol/mL鹽酸溶解并定容至20mL，搖勻；得19種氨基酸溶液； 分別吸取上述氨基酸溶液，分別加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得19種氨基酸單一對照品溶液；取等量的上述19種氨基酸單一對照品溶液，構(gòu)成19種氨基酸混合對照品溶液； (2)供試品溶液的制備: 取小兒七星茶制劑樣品，上陽離子樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗液；再用氨水洗脫，收集氨洗液；將上述氨洗液減壓濃縮，吸取濃縮液，加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得供試品溶液；所述小兒七星茶制劑樣品為小兒七星茶糖漿、小兒七星茶口服液或用蒸餾水溶解后的小兒七星茶顆粒； (3)測定: 分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品`溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的高效液相色譜儀`的條件為:色譜柱以碳十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料，流動相:0.025mol/L乙酸鈉溶液為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫方式；流速:lmL/min ;檢測波長:254nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述乙酸鈉溶液用體積百分比濃度為36%的乙酸調(diào)pH值為6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述氨水洗脫為先用1.8-2.2mol/L氨水洗脫，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脫,收集氨洗液。
5.一種小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)對照品溶液的配制: 將甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸對照品各取10mg，分別用體積百分比濃度為28-32%的乙醇溶液溶解并定容至20mL，搖勻；將胱氨酸、酪氨酸各取10mg，分別用0.08-0.12mol/mL鹽酸溶解并定容至20mL，搖勻；得19種氨基酸溶液； 分別吸取上述氨基酸溶液，分別加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置`0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得19種氨基酸單一對照品溶液；取等量的上述19種氨基酸單一對照品溶液，構(gòu)成19種氨基酸混合對照品溶液；(2)供試品溶液的制備: 取小兒七星茶制劑樣品，上陽離子樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗液；再用氨水洗脫，收集氨洗液；將上述氨洗液減壓濃縮，吸取濃縮液，加入體積百分比濃度為15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、體積百分比濃度為1.75-1.85%的苯異硫氰酸酯的乙腈溶液，渦旋混勻，室溫放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下層溶液，微孔濾膜濾過，得供試品溶液；所述小兒七星茶制劑樣 品為小兒七星茶糖漿、小兒七星茶口服液或用蒸餾水溶解后的小兒七星茶顆粒； (3)測定: 分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，構(gòu)建指紋圖譜，得到由11個共有特征峰構(gòu)成的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(3)為:分別進(jìn)樣所述19種氨基酸混合對照品溶液、供試品溶液，注入高效液相色譜儀測定，以脯氨酸峰為參照峰，其相對保留時間、相對峰面積為1.0，構(gòu)建得到由11個共有特征峰構(gòu)成的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(3)中的高效液相色譜儀的條件為:色譜柱以碳十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料，流動相:0.025mol/L乙酸鈉溶液為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫方式；流速:lmL/min ;檢測波長:254nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述乙酸鈉溶液用體積百分比濃度為36%的乙酸調(diào)pH值為6。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的小兒七星茶制劑氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述氨水洗脫為先用1.8-2.2mol/L氨水洗脫，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脫,收集氨洗液。
【文檔編號】G01N30/88GK103698453SQ201310695252
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】方廣宏, 鄭榮波, 蘇子仁, 黃曉丹, 彭紹忠 申請人:廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司