一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，使用光化學(xué)聚合方法或電化學(xué)聚合方法進(jìn)行分子印跡膜合成，提高結(jié)合容量、降低延遲時間并增強(qiáng)特異性吸附能力；同時，使用Lamb波壓電薄膜作為傳感器的效應(yīng)器，提高傳感器靈敏度、增加穩(wěn)定性并降低成本。從而增強(qiáng)傳感器性能，實現(xiàn)了對微囊藻毒素的痕量檢測，建立了高靈敏度、快速、低成本、低操作要求的微囊藻毒素檢測手段。
【專利說明】一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微囊藻毒素傳感器領(lǐng)域，具體為一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]長江中下游地區(qū)是我國淡水湖泊集中分布的地區(qū)之一，在過去的幾十年里，人類活動對本地區(qū)的湖泊生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了極大的影響，最突出的是城郊湖泊的日益富營養(yǎng)化。湖泊、水庫和河流中接納過多的氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)，使水體的生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，導(dǎo)致藻類特別是藍(lán)藻的異常繁殖生長而出現(xiàn)藍(lán)藻水華現(xiàn)象。隨著水體富營養(yǎng)化的加劇而引起的有害藻類水華的頻繁發(fā)生已成為普遍關(guān)注的環(huán)境問題。當(dāng)藍(lán)藻水華嚴(yán)重時，不僅影響人的感官、破壞健康平衡的水生生態(tài)系統(tǒng)，而且藻細(xì)胞破裂后釋放出的多種藻毒素對人和動物的飲用水安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。在已發(fā)現(xiàn)的各種藻毒素中，微囊藻毒素是目前已知的一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素，因此對微囊藻毒素的檢測十分必要。
[0003]目前對微囊藻毒素的檢測方法主要是化學(xué)分析法和免疫學(xué)檢測法。在化學(xué)檢測方法中使用較多的是高效液相色譜(HPLC)技術(shù)。HPLC技術(shù)一般采用正相或反相色譜對毒素進(jìn)行分離，然后進(jìn)行紫外(UV)、熒光(FL)或化學(xué)發(fā)光(CL)檢測，可廣泛用于微囊藻毒素的分離、鑒定和定量檢測。將被測毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素的滯留時間進(jìn)行比較可對被測毒素進(jìn)行鑒定，將兩者的峰面積進(jìn)行比較可對其進(jìn)行精確定量。但HPLC方法技術(shù)含量高，價格昂貴；另外必須備有標(biāo)準(zhǔn)純毒素或某毒素在相同實驗條件下的保留值。由于當(dāng)前世界塑料制品中塑料添加劑的廣泛應(yīng)用，采集水樣的塑料容器中某些塑料添加劑會干擾HPLC對微囊藻毒素的檢測。免疫學(xué)檢測法主要是酶聯(lián)免疫分析(ELISA)，應(yīng)用此類分析方法篩選毒素的優(yōu)點是靈敏度高、在處理大批樣品時分析速度快、工作原理簡單。在具備微囊藻毒素單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)純毒素和有關(guān)試劑的前提下，尤其是使用商品化的試劑盒時，ELISA方法是一種非常簡便、高效、快速的方法。缺點是不能很好鑒別毒素，會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因此，目前缺少一種更好的微囊藻毒素檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，以解決現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的問題。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:包括硅基底及依次設(shè)置在硅基底上的兩層Lamb波薄膜，硅基底底部通過光聚合和電化學(xué)聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜，由兩層Lamb波薄膜、硅基底、微囊藻毒素分子印跡膜及叉指電極構(gòu)成微囊毒素檢測傳感器芯片，所述微囊毒素檢測傳感器芯片封裝后構(gòu)成微囊藻毒素快速檢測傳感器。
[0006]所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素分子印跡膜通過光聚合方法修飾在硅基底上時，使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液滴加到正硅酸乙酯修飾的硅基底上后，再使用365± 10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)，最后使用乙酸乙醇等體積比的混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，形成具有微孔的微囊藻毒素分子印跡膜，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
[0007]所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素分子印跡膜通過電化學(xué)聚合方法修飾在硅基底上時，使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，濺射了金層的硅基底3作為工作電極，鉬電極作為負(fù)電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、3-APBA和氯化鈉按照1:10:10左右的摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液作為反應(yīng)溶液，以20mV/s變化且范圍在-0.1V到+1.4V之間的電壓循環(huán)進(jìn)行電化學(xué)聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，形成具有微孔的微囊藻毒素分子印跡膜，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
[0008]所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可以制作其它毒素的檢測傳感器。
[0009]所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:微囊毒素檢測傳感器芯片封裝時，采用PMMA制作下底及蓋合在下底上的上蓋，微囊毒素檢測傳感器芯片封裝在下底中，在上蓋上設(shè)置進(jìn)樣管道、出樣管道，上蓋和進(jìn)樣管道、出樣管道使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行粘合，下底和上蓋使用環(huán)氧樹脂粘合。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(I)采用了分子印跡技術(shù)作為傳感器的敏感層，增強(qiáng)了對微囊藻毒素的特異性識別、吸附效率，提高了檢測手段的特異性以及縮短了檢測時間。
[0011](2)采用光聚合方法和電化學(xué)聚合方法合成分子印跡膜，降低了延遲時間、提高了吸附容量、增強(qiáng)了特異性識別能力，提高了傳感器的性能。
[0012](3)使用了 Lamb波壓電薄膜作為傳感器的效應(yīng)器，降低了成本、提高了靈敏度，提高了傳感器的性能。
[0013](4)整個傳感器操作簡單、快速，對操作人員要求低，為實現(xiàn)對微囊藻毒素的實時監(jiān)測提供了有力幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖，其中:
圖1a為整體結(jié)構(gòu)示意圖，圖1b為微囊藻毒素分子印跡膜的微觀結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2為本發(fā)明封裝結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖3為本發(fā)明應(yīng)用測試系統(tǒng)示意圖。
[0017]圖4為本發(fā)明應(yīng)用便攜小型化測試儀器示意圖。
【具體實施方式】
[0018]如圖1所示。一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，包括硅基底3及依次設(shè)置在硅基底3上的兩層Lamb波薄膜1、2，硅基底3底部通過光聚合和電化學(xué)聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜4，由硅基底3、兩層Lamb波薄膜I和2、微囊藻毒素分子印跡膜4、叉指電極7構(gòu)成微囊毒素檢測傳感器芯片8，微囊毒素檢測傳感器芯片8封裝后構(gòu)成微囊藻毒素快速檢測傳感器。
[0019]微囊藻毒素分子印跡膜4通過光聚合方法修飾在硅基底3上時，使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5摩爾比制得的乙醇混合溶液滴加到正硅酸乙酯修飾的硅基底上后，再使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)，最后使用乙酸乙醇等體積比的混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子6，形成具有微孔5的微囊藻毒素分子印跡膜4，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
[0020]微囊藻毒素分子印跡膜4通過電化學(xué)聚合方法修飾在硅基底3上時，使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，濺射了金層的硅基底3作為工作電極，鉬電極作為負(fù)電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、3-APBA和氯化鈉按照1:10:10摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液作為電化學(xué)反應(yīng)溶液，以20mV/s變化且范圍在-0.1V到+1.4V之間的電壓循環(huán)進(jìn)行電化學(xué)聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子6，形成具有微孔5的微囊藻毒素分子印跡膜4，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
[0021]通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可以制作其它毒素的檢測傳感器。
[0022]微囊毒素檢測傳感器芯片8封裝時，采用PMMA制作下底9及蓋合在下底9上的上蓋10，微囊毒素檢測傳感器芯片8封裝在下底9中，在上蓋10上設(shè)置進(jìn)樣管道11、出樣管道12，上蓋10和進(jìn)樣管道11、出樣管道12使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行粘合，下底9和上蓋10使用環(huán)氧樹脂粘合。
[0023]本發(fā)明中，針對傳感器檢測對特異性、檢測速度的需要，提出使用分子印跡技術(shù)作為傳感器的敏感層，分子印跡技術(shù)的原理是模板分子與功能單體在分散介質(zhì)中，依靠相互作用力以及空間位阻效應(yīng)等，形成可逆結(jié)合的復(fù)合物，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑引發(fā)聚合形成多孔功能材料，并且將模板分子有規(guī)律地包在其中，合成后用特定方法把模板分子去除，從而獲得能與模板分子互補(bǔ)、并具有特異識別功能的三維孔穴，從而快速、高特異性的結(jié)合模版分子。
[0024]本發(fā)明在傳感器上修飾分子印跡膜的傳統(tǒng)方法主要是涂布方法，首先制備毫米級或納米級的分子印跡聚合物顆粒，再將聚合物顆粒包埋于凝膠或膜內(nèi)，采用旋轉(zhuǎn)涂布或噴霧涂布制得識別層，這種方法帶來的問題是傳感器響應(yīng)時間延長、對目標(biāo)分子產(chǎn)生非特異性吸附和結(jié)合容量低。
[0025]本發(fā)明提出使用原位聚合方法在傳感器上修飾分子印跡膜，根據(jù)不同情況采用光聚合和電化學(xué)聚合。光聚合是把聚合體系混合液涂布在傳感器上，在惰性氣體的保護(hù)下，紫外光引發(fā)聚合，除去模板分子后，制得分子印跡膜；電化學(xué)方法是在電化學(xué)反應(yīng)池中，在一定的電勢下提供電子，引發(fā)聚合，制得識別層。這兩種方法可以直接在原位制得識別層，避免了傳統(tǒng)方法的弊端，而且重復(fù)性好、環(huán)境友好。
[0026]針對傳感器對高靈敏度、低成本、簡便的需要，本發(fā)明提出使用Lamb波感應(yīng)器作為傳感器的效應(yīng)器，這些低成本、高靈敏度的壓電感應(yīng)器件能夠快速靈敏的檢測到傳感器表面低至IOng的質(zhì)量變化，而且器件穩(wěn)定，抗干擾能力強(qiáng)。通過在效應(yīng)器表面修飾的分子印跡膜結(jié)合微囊藻毒素引起表面質(zhì)量的改變，從而引起效應(yīng)器信號發(fā)生改變，利用信號采集系統(tǒng)采集記錄信號變化，就能夠檢測出樣品中的微囊藻毒素。
[0027]針對檢測對快捷使用的需求，本發(fā)明提出利用該傳感器體積小、功耗低的優(yōu)勢，進(jìn)行封裝、集成，制成小型化、便攜的檢測設(shè)備；并且利用低成本的優(yōu)勢，傳感器芯片可以一次性使用，降低了對使用人員的要求，方便使用。
[0028]針對微囊藻毒素分子印跡膜4的合成，本發(fā)明采用了光聚合合成方法，Lamb波底板使用氧氣等離子體清洗器清洗硅基底2-4分鐘，取過量100-1000 mM正硅酸乙酯的乙醇溶液覆蓋在硅基底表面12小時以上，乙醇沖洗，氮氣吹干；取0.1-200 umol微囊藻毒素和1-2000 umol甲基丙烯酸于1_2 mL乙醇溶液混合靜置3小時以上，加入2-2000 umol 二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.016-16 mg 二苯甲酮，氮氣處理10分鐘以上；向傳感器基底表面滴加100 uL配置好的混合溶液，在氮氣保護(hù)環(huán)境中使用365±10 nm紫外光照射進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)，待表面微干后繼續(xù)滴加反應(yīng)溶液，重復(fù)10次以上，再使用乙醇和乙酸等體積比混合溶液流動沖洗12小時以上,完成后乙醇沖洗除去表面洗脫液,氮氣吹干。
[0029]針對微囊藻毒素分子印跡膜4的合成，本發(fā)明還采用了電化學(xué)聚合合成方法，Lamb波傳感器在硅基底上濺射金層，使用氧氣等離子體清洗器清洗2-4分鐘；配置1-100mmol/L 3_APBA、0.01_1 mg/mL微囊藻毒素和100 mmol氯化鈉混合溶液，氮氣處理10分鐘以上，室溫靜置2小時以上；金層作為工作電極，鉬電極作為負(fù)電極，Ag/AgCl做參比電極，以上一步配置好的混合溶液為電化學(xué)反應(yīng)溶液，電化學(xué)工作站按20mV/s從-0.1V到+1.4V循環(huán)5次。使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液流動沖洗基底24小時以上，完成后乙醇沖洗除去表面洗脫液，氮氣吹干。
[0030]如圖2所示。針對微囊毒素檢測傳感器芯片8的封裝，使用了 PMMA制作下底9、上蓋10，進(jìn)樣管道11、出樣管道12，上蓋9和進(jìn)樣管道11、出樣管道12使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行粘合，下底9和上蓋10使用環(huán)氧樹脂粘合。
[0031]如圖3所示。針對系統(tǒng)測試，使用蠕動泵13作為進(jìn)樣系統(tǒng)，傳感器14接入信號分析儀器15進(jìn)行測試。
[0032]如圖4所示。針對便攜小型化的要求，將傳感器16、信號分析模塊17、顯示模塊18集成封裝。
【權(quán)利要求】
1.一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:包括硅基底及依次設(shè)置在硅基底上的兩層Lamb波薄膜,娃基底底部通過光聚合和電化學(xué)聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜，由兩層Lamb波薄膜、硅基底、微囊藻毒素分子印跡膜及叉指電極構(gòu)成微囊毒素檢測傳感器芯片，所述微囊毒素檢測傳感器芯片封裝后構(gòu)成微囊藻毒素快速檢測傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素分子印跡膜通過光聚合方法修飾在硅基底上時，使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液滴加到正硅酸乙酯修飾的硅基底上后，再使用365± 10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進(jìn)行光交聯(lián)反應(yīng)，最后使用乙酸乙醇等體積比的混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，形成具有微孔的微囊藻毒素分子印跡膜，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素分子印跡膜通過電化學(xué)聚合方法修飾在硅基底上時，使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，濺射了金層的硅基底3作為工作電極，鉬電極作為負(fù)電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、3-APBA和氯化鈉按照1:10:10左右摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液作為反應(yīng)溶液，以20mV/s變化且范圍在-0.1V到+1.4V之間的電壓循環(huán)進(jìn)行電化學(xué)聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，形成具有微孔的微囊藻毒素分子印跡膜，微囊藻毒素分子印跡膜上微孔均勻分布且對微囊藻毒素特異性識別。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可以制作其它毒素的檢測傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微囊藻毒素的快速檢測傳感器，其特征在于:微囊毒素檢測傳感器芯片封裝時，采用PMMA制作下底及蓋合在下底上的上蓋，微囊毒素檢測傳感器芯片封裝在下底中，在上蓋上設(shè)置進(jìn)樣管道、出樣管道，上蓋和進(jìn)樣管道、出樣管道使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行粘合，下底和上蓋使用環(huán)氧樹脂粘合。
【文檔編號】G01N5/02GK103698242SQ201310712994
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月21日
【發(fā)明者】周連群, 何皓, 黎海文, 董文飛, 吳一輝, 王弼陡 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所