癌的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：癌的檢測方法，包括在生物體樣品中測定具有與下述抗體通過抗原抗體反應(yīng)而結(jié)合的反應(yīng)性的多肽的表達(dá)，所述抗體是針對具有序列表的序列號2～30的偶數(shù)的序列號所示的任一氨基酸序列的CAPRIN-1的抗體；為了確定以CAPRIN-1為靶的治療藥對癌患者的施與，而確定癌患者樣品中的CAPRIN-1的存在及其量；以及包含抗CAPRIN-1抗體的癌診斷藥、試劑盒。
【專利說明】癌的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以CAPRIN-I作為腫瘤標(biāo)志物的癌的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌是占所有死亡原因的第一位的疾病，現(xiàn)行的治療是以手術(shù)療法為主、組合使用 放療法和化療法的治療。由于迄今為止醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，根據(jù)癌種類，有些已經(jīng)成為如果能 早期發(fā)現(xiàn)，則治愈的可能性高的疾患。因此，要求對癌患者沒有體力的、經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)、能夠簡 便地檢查的癌的檢測方法。
[0003] 最近，測定腫瘤標(biāo)志物等腫瘤產(chǎn)物的方法普及開來。腫瘤產(chǎn)物，是指與腫瘤相關(guān) 的抗原、酶、特定蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、腫瘤基因、腫瘤基因產(chǎn)物和腫瘤抑制基因等，癌胚抗原 CEA、糖蛋白質(zhì)CA19-9、前列腺特異性抗原PSA、作為甲狀腺產(chǎn)生的肽激素的降鈣素等在一 部分癌中作為腫瘤標(biāo)志物而被靈活應(yīng)用于癌診斷。但是，對于大多數(shù)癌種不存在對癌診斷 有用的腫瘤標(biāo)志物。另外，現(xiàn)在已知的腫瘤標(biāo)志物大部分在體液中僅以極微量（pg/mL數(shù)量 級程度）存在，為了檢測它們，需要高靈敏度的測定法和/或特殊的技術(shù)。在這樣的現(xiàn)狀下， 如果可以提供能夠以簡便的操作高靈敏度地檢測各種癌的新的癌檢查手段，則可以期待開 發(fā)針對各種癌的診斷用途。
[0004] 另一方面，近年雖然開發(fā)了新的手術(shù)法、發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但除了一部分癌之 夕卜，對于大多癌并未確立有效的癌診斷技術(shù)。所以現(xiàn)狀是不能早期發(fā)現(xiàn)癌，癌的治療成績并 沒怎么提尚。
[0005] 近年來，由于分子生物學(xué)、癌免疫學(xué)的進(jìn)步，對于與癌特異性地反應(yīng)的抗體、針對 與癌化和/或癌的惡化相關(guān)的癌抗原的分子靶向藥等以癌抗原類為靶的特異性癌治療法 的期待提高。其中，多種以癌細(xì)胞上的抗原蛋白質(zhì)為靶的、用于治療癌的抗體藥物上市，被 用于癌治療?？贵w藥物作為癌特異性治療藥得到了一定的藥效，因而受到人們的矚目，但成 為靶的抗原蛋白質(zhì)大部分在正常細(xì)胞中也表達(dá)，抗體施與的結(jié)果，不僅是癌細(xì)胞，表達(dá)抗原 的正常細(xì)胞也被毒害，其結(jié)果所產(chǎn)生的副作用成為問題。另外，由于根據(jù)癌患者不同而病因 不同，因而癌治療的效果個(gè)體差異極大。例如，在手術(shù)、化療法或者放療法中，根據(jù)癌的進(jìn)行 階段而其治療和預(yù)后受到較大影響。已知由于個(gè)體的多樣性，每個(gè)人對相同癌治療藥有不 同的感受性，對某一患者有效的藥未必對其他患者也有效。
[0006] 因此，預(yù)先測定患者的疾患相關(guān)基因和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)，評價(jià)某一特定藥物對 表達(dá)特定的基因或蛋白質(zhì)的癌患者是否有效，然后確定對該癌患者的治療藥的施與。具體 地，使用測定針對某種癌的疾患相關(guān)基因和/或蛋白質(zhì)的檢測法，在臨床現(xiàn)場檢查源自癌 患者的樣品、例如血清和/或組織中是否存在癌抗原，然后確定癌抗原特異性治療藥的施 與。例如，通過免疫組織化學(xué)染色EGFR檢測法"EGFRpharm(DAKO社）"來評價(jià)大腸癌患者 的癌組織，預(yù)測大腸癌中ERBITAX的有效性，然后確定ERBITAX的施與。另外，通過免疫組 織化學(xué)染色Her2檢測法"Here印Test"來評價(jià)乳癌患者的癌組織，預(yù)測乳癌中赫賽汀的有 效性，確定赫賽汀的應(yīng)用。
[0007] 此外，伴侶動(dòng)物多作為家庭的一員而被飼育，與飼主具有同樣的生活習(xí)慣。因此， 據(jù)說根據(jù)伴侶動(dòng)物罹患癌，可以預(yù)測飼主將來癌發(fā)病的危險(xiǎn)性高。
[0008] 已知作為代表性的伴侶動(dòng)物的狗衰老比人早7倍。現(xiàn)在，據(jù)說狗的飼育數(shù)在日本 約為670萬只，另外在美國約為1764萬只。除了狂犬病預(yù)防接種之外，5種、7種、8種等的混 合疫苗一般普及，犬細(xì)小病毒感染癥、犬瘟熱病毒感染癥、犬副流感（傳染性支氣管炎）、犬 2型腺病毒感染癥（傳染性支氣管炎）、犬傳染性肝炎、犬冠狀病毒感染癥、鉤體病這樣的致 死率高的感染癥減少。因此，狗的平均壽命延長，7歲以上的高齡犬占總飼育數(shù)的35. 5%。 死亡原因也與人同樣地，因癌、高血壓、心臟病等的死亡增加。在美國，1年約400萬只狗被 診斷為癌，據(jù)說在日本也潛在地約160萬只患有某些腫瘤。但是，伴侶動(dòng)物并沒有像人那 樣普及健康診斷，因而大多發(fā)現(xiàn)晚，腫瘤變大飼主才注意到，才來醫(yī)院。在該變大的腫瘤為 惡性的情況下，即使進(jìn)行手術(shù)等外科療法和/或給藥抗癌劑等，基本上也已經(jīng)晚了。因此， 在獸醫(yī)判斷為惡性的情況下，一般不手術(shù)而進(jìn)行抗癌劑治療。即使在進(jìn)行手術(shù)的情況下，也 必須嚴(yán)格實(shí)施確保切緣的大小以及手術(shù)中的血液、細(xì)胞飛散對策這樣的手術(shù)中的對策。期 望手術(shù)后立即開始抗癌劑治療，經(jīng)過觀察也以短的間隔進(jìn)行。因此，對于患癌的伴侶動(dòng)物， 給藥癌治療藥也是必須的，如果存在測定針對某種癌的疾患相關(guān)基因和/或蛋白質(zhì)的檢測 法，則可以進(jìn)行比迄今為止更有效的治療，無論對于飼主來說還是對于獸醫(yī)來說好處都大。
[0009] 細(xì)胞質(zhì)增殖相關(guān)蛋白 I (Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1，CAPRIN-1)是已知在分裂間期的正常細(xì)胞發(fā)生活化和/或細(xì)胞分裂時(shí)表達(dá)，并在細(xì)胞內(nèi) 與RNA形成細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激顆粒而參與mRNA的運(yùn)輸、翻譯的控制等的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。另一方 面，本
【發(fā)明者】們弄清楚了 CAPRIN-I在乳癌細(xì)胞的膜表面高表達(dá)，針對CAPRIN-I的抗體對 乳癌細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)的抗腫瘤效果（專利文獻(xiàn)1)。另外，報(bào)告了通過使用與在細(xì)胞表面表達(dá)的 CAPRIN-I結(jié)合的抗體，測定源自患者的樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)，可以進(jìn)行癌的檢測以及 評價(jià)癌的惡性度（專利文獻(xiàn)2)。即，記載了作為細(xì)胞膜蛋白質(zhì)之一的CAPRIN-I可以成為癌 治療等的靶。另一方面，如上所述，為了根據(jù)癌患者的多樣性而確定以CAPRIN-I為靶的治 療藥、例如抗體的施與，需要預(yù)先驗(yàn)證源自癌患者的樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)。但是，并沒 有關(guān)于用于這樣應(yīng)用特異性治療藥的CAPRIN-I的檢測方法的報(bào)告，另外不存在使用癌患 者樣品的檢測癌的試劑。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn) I :TO2010/016526
[0013] 專利文獻(xiàn) 2 :W02010/016527


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 發(fā)明要解決的課題
[0015] 本發(fā)明的目的是提供對癌的診斷有用的癌的檢測手段。另外，還提供為了確定以 針對癌患者的CAPRIN-I為靶的治療藥的施與，而檢測患者樣品中的CAPRIN-I，確定其表達(dá) 量的癌的檢測方法、癌診斷藥和試劑盒。
[0016] 用于解決課題的方法
[0017] 本
【發(fā)明者】們進(jìn)行了深入研宄，結(jié)果通過使用了源自狗精巢的cDNA文庫和荷癌犬 的血清的SEREX法，獲得了編碼在源自荷癌生物體的血清中存在的抗體所結(jié)合的蛋白質(zhì) 的cDNA。以該cDNA為基礎(chǔ)，制作了具有序列號6、8、10、12和14所示的氨基酸序列的狗 CAPRIN-1。另外，以獲得的基因的人同源性基因?yàn)榛A(chǔ)，制作了具有序列號2和4所示的氨 基酸序列的人CAPRIN-1。然后發(fā)現(xiàn)，編碼CAPRIN-I的基因分別在狗和人的精巢以及惡性 癌細(xì)胞中特異性地表達(dá)（參照后述的實(shí)施例1)，以基于CAPRIN-I的氨基酸序列制作的重 組多肽作為抗原而制作的單克隆抗體與各種癌組織中的CAPRIN-I結(jié)合，以及能夠毒害其 表面具有CAPRIN-I的癌細(xì)胞，其結(jié)果獲得了 CAPRIN-I成為癌治療靶這樣的見解。進(jìn)而發(fā) 現(xiàn)，利用上述的單克隆抗體，可以從源自癌患者的樣品中特異性地檢測CAPRIN-1。即，本發(fā) 明提供對生物體樣品進(jìn)行的癌的檢測方法，包括測定CAPRIN-I的表達(dá)。另外，確立了通過 使用上述單克隆抗體的免疫分析法、即利用源自癌患者的血清的ELISA法和利用癌組織的 免疫組織化學(xué)染色法，來檢測源自癌患者的樣品中的CAPRIN-1，評價(jià)其表達(dá)量的方法。另外 發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)用該方法來評價(jià)源自癌的樣品、其結(jié)果表達(dá)CAPRIN-1、且其量高的患者，能夠應(yīng) 用以CAPRIN-I為靶的治療藥，從而完成了本申請發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明提供癌的檢測方法，是對生物體樣品進(jìn)行的方法，檢測該樣品中的 CAPRIN-1，測定其表達(dá)量。另外，提供診斷方法，通過在對癌患者施與針對CAPRIN-I的治療 藥之前，測定組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量來預(yù)測以CAPRIN-I為靶的治療藥、例如抗體等能 否應(yīng)用于該癌患者，預(yù)測其有效性，從而弄清楚針對CAPRIN-I的治療藥的應(yīng)用性。進(jìn)而，本 發(fā)明提供包含與CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段的癌診斷藥或試劑 盒。
[0019] 具體地，本發(fā)明具有以下特征。
[0020] (1)癌的檢測方法，包括：使用與具有序列號63所示的氨基酸序列的多肽具有免 疫反應(yīng)性的抗體，通過抗原抗體反應(yīng)，來測定生物體樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)量。
[0021] (2)根據(jù)上述（1)所述的癌的檢測方法，要測定的所述CAPRIN-I是
[0022] (a)具有序列表的序列號2?30中偶數(shù)的序列號所示的任一氨基酸序列的多肽， 或者
[0023] (b)與該CAPRIN-I具有85%以上的序列同一性的多肽。
[0024] (3)根據(jù)上述⑴或⑵所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自人、狗或貓。
[0025] (4)根據(jù)上述⑴?⑶的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自狗， 要測定的所述CAPRIN-I具有序列號6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
[0026] (5)根據(jù)上述⑴?⑶的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自人， 要測定的所述CAPRIN-I具有序列號2或4所示的氨基酸序列。
[0027] (6)根據(jù)上述⑴?（5)的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，在測定出的CAPRIN-I表 達(dá)量與健常個(gè)體相比有意義地高的情況下，顯示成為作為癌治療藥的所述抗體的靶的癌存 在。
[0028] (7)根據(jù)上述⑴?（6)的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述CAPRIN-I的表達(dá)量 的測定利用免疫分析法。
[0029] (8)根據(jù)上述（7)所述的癌的檢測方法，所述免疫分析法是ELISA和/或免疫組織 化學(xué)染色法。
[0030] (9)根據(jù)上述⑴?⑶的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品是體液、 組織或細(xì)胞。
[0031] (10)根據(jù)上述⑴?（9)的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述癌是選自乳癌、腦 瘤、食道癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、脾癌、胰癌、大腸癌、皮膚癌、卵巢癌、子宮癌、 前列腺癌、膀胱癌、精巢癌、骨肉瘤和纖維肉瘤中的至少1種癌。
[0032] (11)根據(jù)上述⑴?（10)的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述抗體或其抗原結(jié)合 片段是具有包含序列號70所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含序列號71所示的氨基酸 序列的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0033] (12)癌診斷藥或試劑盒，其特征在于，包含與具有序列號63所示的氨基酸序列的 多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0034] (13)根據(jù)上述（12)所述的癌診斷藥或試劑盒，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是具 有包含序列號70所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含序列號71所示的氨基酸序列的輕 鏈可變區(qū)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0035] (14)區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的選擇方法，使用與具有序列號63所示的氨基酸序列 的多肽具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段來測定生物體樣品中的CAPRIN-I的表達(dá) 量，在該表達(dá)量與健常個(gè)體相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義地高的情況下，確定選擇CAPRIN-I靶向 藥作為適合對該生物體樣品所源自的個(gè)體進(jìn)行施與的癌治療藥。
[0036] (15)根據(jù)上述（14)所述的區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的選擇方法，其特征在于，所述 CAPRIN-I靶向藥是與CAPRIN-I具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0037] 本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的日本專利申請2012-160751號 的說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0038] 發(fā)明的效果
[0039] 通過本發(fā)明，提供能夠測定從癌患者分離的樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)量的新 的癌的檢測方法。如后述的實(shí)施例中具體顯示的那樣，以基于CAPRIN-I(或者也稱為 Caprin-I)的氨基酸序列制作的重組多肽作為抗原而制作的抗體，與癌患者的血清和/或 組織中的CAPRIN-I特異性地反應(yīng)。另外，如下述實(shí)施例所記載的那樣，由于在各種癌組織 中CAPRIN-I自身特異性地高表達(dá)，因而能夠通過檢測從癌患者分離的樣品中的CAPRIN-1， 測定其表達(dá)量，來進(jìn)行癌的檢測。另外，通過預(yù)先判斷對以CAPRIN-I為靶的治療藥、例如抗 體藥物是否有感受性，可以篩選能夠應(yīng)用本治療劑的患者。即，通過將本發(fā)明應(yīng)用于癌患 者，預(yù)先檢測CAPRIN-1，測定其表達(dá)量，能夠提供使用抗CAPRIN-I抗體的更有效的治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1是顯示編碼CAPRIN-I的基因在正常組織和腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)圖譜的圖。參 照號1顯示編碼CAPRIN-I蛋白的基因的表達(dá)圖譜，參照號2顯示GAPDH基因的表達(dá)圖譜。 最上欄的面板顯示對于狗正常組織的結(jié)果，中欄左側(cè)的面板顯示對于狗乳癌組織的結(jié)果， 中欄右側(cè)的面板顯示對于人乳癌細(xì)胞株的結(jié)果，最下欄的面板顯示對于各種人癌細(xì)胞株的 結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 在本發(fā)明的癌的檢測方法中，檢測生物體樣品中的CAPRIN-I，測定其表達(dá)量。作為 測定癌患者樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)量的方法，例如，可以通過使用抗CAPRIN-I抗體的免 疫分析法來分析。這樣的方法大多在該【技術(shù)領(lǐng)域】公知，例如，能夠應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析、 蛋白質(zhì)印跡分析、免疫沉降、分子結(jié)合分析、ELISA、生物化學(xué)的酶活性分析等、使用抗體的 免疫分析法。此外，本說明書中的"表達(dá)量"包含細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的蓄積量和存在量。
[0042] 樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)可以通過分類成實(shí)施例中所示的得分值來區(qū)分。該得 分值越高，則顯示癌患者的癌組織和/或癌血清包含越多的成為測定對象的CAPRIN-1。此 夕卜，本發(fā)明中，"測定"這樣的術(shù)語包含檢測、定性、定量和半定量的任一者。
[0043] 序列號6、8、10、12或14所示的氨基酸序列是狗的CAPRIN-I的氨基酸序列。具有 該氨基酸序列的狗CAPRIN-1，是通過使用源自狗精巢的cDNA文庫和源自荷癌犬的血清的 SEREX法，作為與在源自荷癌犬的血清中特異性地存在的抗體結(jié)合的多肽而鑒定出的（參 照實(shí)施例1)。通過上述的方法測定作為狗的組織中的抗原的序列號6、8、10、12或14的 CAPRIN-I自身，能夠診斷患者對以CAPRIN-I為靶的治療藥有無感受性的有無（參照實(shí)施 例）。此外，本說明書中使用的"具有氨基酸序列"，是氨基酸殘基以這樣的順序排成序列這 樣的含義。因此，例如，"具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽"，是指序列號2所示的Met Pro Ser Ala…（中略）一Gln Gln Val Asn的氨基酸序列以該順序連接而成的、709個(gè)氨基 酸殘基的大小的多肽。在本說明書中，有時(shí)將"具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽"簡 記為"序列號2的多肽"。對于"具有堿基序列"這樣的表達(dá)也是同樣的。此時(shí)，"具有"這 樣的術(shù)語可以用"包含"這樣的表達(dá)替換。
[0044] 另外，本說明書中使用的"多肽"是指多個(gè)氨基酸通過肽鍵而形成的分子，不僅包 含構(gòu)成的氨基酸數(shù)多的多肽分子，還包含氨基酸數(shù)少的低分子量的分子（寡肽）、全長蛋白 質(zhì)。本發(fā)明中，具有序列號2?30中偶數(shù)的序列號所示的氨基酸序列的CAPRIN-I的全長 蛋白質(zhì)也包含在多肽中。
[0045] 在本發(fā)明的方法中，除了序列號6、8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I以外的其 他哺乳動(dòng)物的CAPRIN-I也成為測定對象。在本說明書中，以下，有時(shí)將其他哺乳動(dòng)物的 CAPRIN-I稱為狗CAPRIN-I的"同源因子"（或"同源物")。另外，單提到"CAPRIN-1"的情況 下，不僅包含源自狗的CAPRIN-I，還包含源自其他哺乳動(dòng)物的CAPRIN-I。作為在本發(fā)明的 方法中成為測定對象的其他哺乳動(dòng)物的CAPRIN-1，可列舉例如，人CAPRIN-1、貓CAPRIN-I 等，但不限于這些。如下述實(shí)施例所具體記載的那樣，編碼人CAPRIN-I的mRNA與序列號6、 8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I同樣地，在人的精巢和癌細(xì)胞中有意義地高表達(dá)，但在健 常人體內(nèi)檢測不到該抗人CAPRIN-I抗體。另外，抗貓CAPRIN-I抗體在健常貓?bào)w內(nèi)檢測不 到，僅在荷癌貓中檢測到。因此，在測定除狗以外的哺乳動(dòng)物中的CAPRIN-I的表達(dá)量的情 況下，也能夠判定以CAPRIN-I為靶的治療藥是否適合該哺乳動(dòng)物。
[0046] 此外，編碼人CAPRIN-I的堿基序列及其氨基酸序列分別如序列表的序列號1和3、 以及2和4所示。人CAPRIN-I相對于狗CAPRIN-I的序列同一性為堿基序列94%、氨基酸 序列98%。因?yàn)榧词瓜窆放c人這樣遺傳上為遠(yuǎn)緣的哺乳動(dòng)物之間，各自的CAPRIN-I的氨基 酸序列的序列同一性也達(dá)到非常高的98%，所以認(rèn)為在除人以外的哺乳動(dòng)物的CAPRIN-I 與狗CAPRIN-I之間也具有85 %左右以上的高序列同一性。即，對在本發(fā)明的方法中成為測 定對象的CAPRIN-I不特別限定，可以與序列號6、8、10、12或14所示的狗CAPRIN-I的氨基 酸序列具有優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選95%以上的序列同一性。
[0047] 通常，蛋白質(zhì)等這樣的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的分子量大的抗原物質(zhì)，分子上存在結(jié)構(gòu)不 同的多個(gè)表位。因此，在生物體內(nèi)，針對這樣的抗原物質(zhì)，產(chǎn)生分別識別結(jié)合多個(gè)表位的多 個(gè)種類的抗體。即，在生物體內(nèi)針對蛋白質(zhì)等的抗原物質(zhì)而產(chǎn)生的抗體，是作為多個(gè)種類的 抗體的混合物的多克隆抗體。由本申請
【發(fā)明者】們發(fā)現(xiàn)的、在源自罹患癌的生物體的血清中 特異性地存在、且與重組CAPRIN-I通過抗原抗體反應(yīng)而特異性地結(jié)合的抗體也還是多克 隆抗體。此外，本發(fā)明中提到"多克隆抗體"時(shí)，是指在源自體內(nèi)包含抗原物質(zhì)的生物體的 血清中存在、并且在該生物體內(nèi)針對該抗原物質(zhì)而誘導(dǎo)的抗體。
[0048] 作為用作抗原的肽的優(yōu)選具體例，可列舉序列號2?30中偶數(shù)的序列號的多肽或 其片段。
[0049] 此外，編碼包含序列號2?30中偶數(shù)的序列號（S卩，序列號2,4,6......28,30)的 氨基酸序列的多肽的多核苷酸的堿基序列分別在序列號1?29中奇數(shù)的序列號（S卩，序列 號 1，3,5......27,29)中顯示。
[0050] -般地，在蛋白質(zhì)抗原中，即使在構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中替換、缺失、添加 或插入了少數(shù)的氨基酸殘基的情況下，有時(shí)也具有與原蛋白質(zhì)基本相同的抗原性，這是本 領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的。因此，具有在CAPRIN-I的氨基酸序列中替換、缺失和/或插入 了少數(shù)的（優(yōu)選1個(gè)或數(shù)個(gè)）氨基酸殘基的序列，與原序列具有80%以上、85%以上、優(yōu)選 90%以上、更優(yōu)選95%以上、進(jìn)一步優(yōu)選98%以上的序列同一性，且與針對CAPRIN-I的多 克隆抗體通過抗原抗體反應(yīng)而特異性地結(jié)合的多肽（以下，有時(shí)也方便地稱為"特異反應(yīng) 性修飾多肽")，也與包含上述序列號2?30中偶數(shù)的序列號的氨基酸序列的多肽同樣地可 以在癌的檢測中使用。優(yōu)選的特異反應(yīng)性修飾多肽具有在CAPRIN-I的氨基酸序列中替換、 缺失、添加和/或插入了 1個(gè)或數(shù)個(gè)的氨基酸殘基的氨基酸序列。本說明書中的"數(shù)個(gè)"表 示2?10的整數(shù)、優(yōu)選2?6的整數(shù)、進(jìn)一步優(yōu)選2?4的整數(shù)。
[0051] 本說明書中使用的氨基酸序列的"序列同一性"，是以應(yīng)比較的2個(gè)氨基酸序列的 氨基酸殘基盡量多地一致的方式，將兩個(gè)氨基酸序列對齊，將用一致的氨基酸殘基數(shù)除以 總氨基酸殘基數(shù)的結(jié)果用百分率表示而得的值。上述對齊時(shí)，根據(jù)需要在所比較的2個(gè)序 列的一方或雙方插入適當(dāng)間隙。這樣的序列的對齊可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTAL W 等公知的程序來進(jìn)行（Karlin 和 Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.，87 :2264_2268， 1993 ;Altschul 等，Nucleic Acids Res.，25 :3389_3402,1997)。
[0052] 此外，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸，可以分組成如具有低極性側(cè)鏈的中性氨基 酸（Gly，lie，Val，Leu，Ala，Met，Pro)、具有親水性側(cè)鏈的中性氨基酸（Asn，Gln，Thr，Ser， 丁71'，〇78)、酸性氨基酸（48口，6111)、堿基性氨基酸（4找，1^8，!^8)、芳香族氨基酸（?116，丁71·， Trp，His)那樣具有類似的性質(zhì)的組，已知如果是它們之間的替換、即保守性替換，則多肽的 性質(zhì)大多不變化。因此，在替換CAPRIN-I的氨基酸殘基時(shí)，通過在這些各組之間替換，能夠 維持與對應(yīng)抗體的結(jié)合性的可能性變高。但是，在本發(fā)明中，上述改變體只要具有與未改變 體同等或基本同等的免疫誘導(dǎo)活性，則也可以具有非保守性替換。
[0053] 本發(fā)明中使用的上述多肽可以按照例如Fmoc法（芴基甲基氧基羰基法）、tBoc 法（叔丁基氧基羰基法）等化學(xué)合成法進(jìn)行合成（日本生化學(xué)會編、生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、 夕>，夕質(zhì)ω化學(xué)（蛋白質(zhì)的化學(xué)）ιν、化學(xué)修飾卜''合成（化學(xué)修飾和肽合成）、 東京化學(xué)同人（日本）、1981年）。另外，也可以利用各種市售的肽合成儀通過常規(guī)方法進(jìn) 行合成?；蛘撸梢允褂霉幕蚬こ虒W(xué)方法（Sambrook等，Molecular Cloning，第2 版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology，第 3 版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons^) 容易地制備。例如，可以由從表達(dá)編碼序列號2的人CAPRIN-I或其同源因子的基因的組織 提取出的RNA，通過RT-PCR來制備該基因的cDNA，將該cDNA的全長或所期望的一部分插 入表達(dá)載體中，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而獲得目的多肽。編碼序列號6、8、10、12和14的狗 CAPRIN-I的cDNA的堿基序列分別示于序列號5、7、9、11和13,并且，編碼作為其人同源因 子的序列號2和4的人CAPRIN-I的cDNA的堿基序列分別示于序列號1和3,因而RT-PCR 中使用的引物可以參照這些堿基序列容易地設(shè)計(jì)。另外，如后述那樣，編碼除人以外的哺乳 動(dòng)物的CAPRIN-I的基因可以通過參照序列號5?29中奇數(shù)的序列號的堿基序列而設(shè)計(jì)的 引物來擴(kuò)增，因此例如編碼貓CAPRIN-I的cDNA也可以通過與上述同樣的手法而容易地制 備。RNA的提取、RT-PCR、cDNA向載體的插入、載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可以如以下所記 載的那樣，通過公知的方法來進(jìn)行。另外，使用載體、宿主細(xì)胞也是公知的，有各種產(chǎn)品市 售。
[0054] 作為上述宿主細(xì)胞，只要是可表達(dá)上述多肽的細(xì)胞，就可以是任意的細(xì)胞，作為原 核細(xì)胞的例子可以列舉大腸桿菌等，作為真核細(xì)胞的例子可以列舉猴腎臟細(xì)胞C0S1、中國 倉鼠卵巢細(xì)胞CH0、人胎兒腎臟細(xì)胞株HEK293、小鼠胚胎皮膚細(xì)胞株NIH3T3等哺乳動(dòng)物培 養(yǎng)細(xì)胞、芽殖酵母、裂殖酵母、蠶細(xì)胞、爪蟾卵細(xì)胞等。
[0055] 當(dāng)使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，使用具有能在原核細(xì)胞中復(fù)制 的起點(diǎn)、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合部位、多克隆位點(diǎn)、終止子、抗藥性基因、營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因 等的表達(dá)載體。作為大腸桿菌用表達(dá)載體，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表達(dá)系統(tǒng)、 PGEX表達(dá)系統(tǒng)等。如果將編碼上述多肽的DNA插入到這樣的表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化原 核宿主細(xì)胞后，培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)由上述DNA編碼的多肽。 此時(shí)，也可以使該多肽作為與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)來表達(dá)。此外，編碼上述多肽的DNA 例如可以如上述那樣通過RT-PCR來制備cDNA而獲得，另外還可以如后述那樣使用市售的 核酸合成儀通過常規(guī)方法來合成。此外，編碼序列號2和4的CAPRIN-I的基因的cDNA的 堿基序列分別示于序列表的序列號1和3。
[0056] 當(dāng)使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，使用具有啟動(dòng)子、剪接區(qū)、多聚 (A)添加部位等的真核細(xì)胞用表達(dá)載體。作為這樣的表達(dá)載體，可以例示pKAl、pCDM8、 pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pYES2 等。與上述同樣地，如 果將編碼本發(fā)明中使用的多肽的DNA插入到這樣的表達(dá)載體中，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì) 胞后，培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)由上述DNA編碼的多肽。當(dāng)使用 pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl 等作為表達(dá)載體時(shí)，可以作為附加了 His 標(biāo)簽（例如（His) 6?（His) 1Q)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GFP等各種標(biāo)簽的融合蛋白 質(zhì)而表達(dá)上述多肽。
[0057] 表達(dá)載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚 糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過性肽的結(jié)合等公知的方法。
[0058] 為了從宿主細(xì)胞中分離純化目的多肽，可以將公知的分離操作組合來進(jìn)行。可列 舉例如，利用了脲等的變性劑和/或表面活性劑的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析和/或溶 劑分別沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電點(diǎn)電泳、離子交換層析、疏 水層析、親和層析、反相層析等。
[0059] 通過以上的方法獲得的多肽中還包含處于與其他任意蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形 態(tài)的多肽?？衫纠?，與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)、His標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)等。進(jìn)而，在 轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的多肽有時(shí)在翻譯后在細(xì)胞內(nèi)受到各種修飾。這樣的經(jīng)翻譯后修飾的多肽 只要具有與針對CAPRIN-I的多克隆抗體的結(jié)合性就可以使用。作為這樣的翻譯修飾，可以 例示N末端甲硫氨酸的脫離、N末端乙酰化、糖鏈添加、細(xì)胞內(nèi)蛋白酶造成的限制性分解、肉 豆蔻?；?、異戊二烯化、磷酸化等。
[0060] 在本發(fā)明的方法中，測定生物體樣品中可能含有的CAPRIN-I。如上所述，判斷癌細(xì) 胞中作為抗原的CAPRIN-I的表達(dá)量有意義地高。顯示通過測定癌細(xì)胞和/或癌組織中的 CAPRIN-I自身，對CAPRIN-I的表達(dá)量高的患者，能夠應(yīng)用以CAPRIN-I為靶的治療藥，這如 下述實(shí)施例中具體記載的那樣。
[0061] 樣品中的多肽的測定可以使用公知的免疫分析法容易地進(jìn)行。具體地，例如，制作 與CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段，使用該抗體或其抗原結(jié)合片段 進(jìn)行免疫測定，從而能夠測定樣品中可能存在的CAPRIN-1。另外，由于抗體有交叉反應(yīng)性， 因而例如，使用與序列號6的狗CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合片段，不 僅能夠測定序列號6的狗CAPRIN-1，還能夠測定其他哺乳動(dòng)物中的其同源因子、例如序列 號2或4的人CAPRIN-I或貓CAPRIN-I等。
[0062] 免疫測定方法自身如上所述是公知的常規(guī)方法。識別CAPRIN-的抗體，可以通過 利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法的免疫組織化學(xué)，由外科手術(shù)期間從患者得到的組織、由 接種了自然或轉(zhuǎn)染后表達(dá)CAPRIN-I的細(xì)胞系的異種移植組織的擔(dān)持動(dòng)物得到的組織等組 織，制作低聚甲醛或丙酮固定后的冷凍切片或低聚甲醛固定石蠟包埋的組織切片，使用上 述切片，關(guān)于與CAPRIN-I的反應(yīng)性進(jìn)行試驗(yàn)。
[0063] 進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后，樣品中的CAPRIN-I的表達(dá)量的定量化，可以通過估算 反映染色狀態(tài)的得分值而進(jìn)行數(shù)值化。得分值的設(shè)定優(yōu)選為2階段以上，在最優(yōu)選的方式 下是4階段的分類。例如，將在癌細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的CAPRIN-I通過通常的免疫組織化 學(xué)染色法進(jìn)行染色，將反映其染色狀態(tài)的得分值分類成4階段的情況，各得分如以下那樣 設(shè)定。
[0064] ?得分0 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0065] ?得分1 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0066] ?得分2 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0067] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0068] 這樣的得分值的設(shè)定是在美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology)規(guī)定的，在日本國內(nèi)由日本病理學(xué)會認(rèn)定。另外，也在定量作為癌抗原之一的 Her2在患者樣品中的存在量的"Here印Test"中應(yīng)用，關(guān)于Her2的定量，在ASCO/CAP Her2 檢查指南中規(guī)定。在日本國內(nèi)也由卜7^7''病理部會制定了包含本得分的設(shè)定的Her2 檢查指南。
[0069] 對于各得分值中記載的、免疫組織化學(xué)染色后的癌細(xì)胞被染色的比例，可以將光 學(xué)顯微鏡的靈敏度提高到4倍、10倍或20倍，將進(jìn)入視野的細(xì)胞數(shù)出最低500,計(jì)測各得分 值所記載的細(xì)胞膜上顯示染色像的細(xì)胞，利用以下式估算。
[0070] 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)（約500左右）X 100
[0071] 為了免疫組織化學(xué)染色，可以使對CAPRIN-I有反應(yīng)性的抗體通過各種方法染色。 例如，可以通過與辣根過氧化物酶復(fù)合山羊抗小鼠抗體、山羊抗雞抗體反應(yīng)而可視化。
[0072] 在對CAPRIN-I自身進(jìn)行免疫測定時(shí)使用的、與CAPRIN-I進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的抗 體或其抗原結(jié)合片段，也可以作為癌診斷藥或試劑盒提供。此時(shí)的癌診斷藥或試劑盒也可 以僅由上述抗體或抗原結(jié)合片段組成，還可以包含對該抗體或抗原結(jié)合片段的穩(wěn)定化等有 用的各種添加劑等。另外，該抗體或抗原結(jié)合片段也可以結(jié)合錳、鐵等金屬。如果將這樣的 金屬結(jié)合抗體或抗原結(jié)合片段施與體內(nèi)，則因?yàn)樵摽贵w或抗原結(jié)合片段在存在抗原蛋白質(zhì) 的部位更多地富集，所以如果通過MRI等測定金屬，則能夠檢測產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞 的存在。
[0073] 此外，判明了 CAPRIN-I是在癌細(xì)胞的表面表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白。由于癌患者的體 內(nèi)包含大量的蛋白質(zhì)分解酶，因而CAPRIN-I序列中的癌細(xì)胞的細(xì)胞外區(qū)域受到分解而從 癌細(xì)胞分離，所以比CAPRIN-I序列中的癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域更多地在血液中存在。因此， 如果作為本測定中使用的抗CAPRIN-I抗體或其抗原結(jié)合片段，使用與CAPRIN-I的細(xì)胞外 區(qū)域更強(qiáng)地結(jié)合的抗CAPRIN-I抗體或其抗原結(jié)合片段，則不僅能夠檢測固定于載玻片的 癌組織，還能夠檢測癌患者的血清中存在的CAPRIN-I。另外，本方法是使用與CAPRIN-I的 細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的抗體的檢測，因而能夠正確地特定能夠通過施與以CAPRIN-I為靶的治 療藥、特別是抗CAPRIN-I抗體藥物而期待治療效果的癌患者，從而能夠提供更有效的癌治 療。因此、在本發(fā)明中，優(yōu)選使用與CAPRIN-I中的、癌細(xì)胞的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的抗體。作為 包含這樣的抗體所識別的表位的CAPRIN-I蛋白質(zhì)的部分肽，可列舉序列表的序列號2?30 中除了序列號6和序列號18之外的偶數(shù)號所示的氨基酸序列中相當(dāng)于細(xì)胞外區(qū)域的肽。具 體地，可列舉包含序列號2中50位?98位或233位?344位的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個(gè)以上的 氨基酸序列的肽，或包含序列號4?30中除了序列號6和序列號18之外的偶數(shù)號所示的 氨基酸序列中與上述氨基酸位置同源的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個(gè)以上的氨基酸序列的肽。更具體 地，可列舉例如，序列號43或序列號61所示的氨基酸序列、優(yōu)選序列號61所示的氨基酸序 列中的序列號62所示的氨基酸序列、或與該氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更 優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上的序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明中使用的抗體包 含與這些肽結(jié)合的全部抗體。具體地，可列舉與序列號63結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段、 具有序列號70和71的氨基酸序列的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的氨基酸序列的單克隆 抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0074] 本說明書中中使用的"抗原結(jié)合片段"是指抗體分子中所含的Fab片段、F(ab'）2 片段這樣的具有與抗原的結(jié)合能力的抗體片段?？贵w可以是多克隆抗體也可以是單克隆 抗體，為了進(jìn)行免疫測定等，優(yōu)選再現(xiàn)性高的單克隆抗體。以肽作為免疫原的多克隆抗體 和單克隆抗體的制備方法是公知的，可以通過常規(guī)方法容易地進(jìn)行。例如，可以通過以使 CAPRIN-I與鑰孔戚血藍(lán)蛋白（KLH)、酪蛋白、血清白蛋白等載體蛋白質(zhì)結(jié)合而得的融合蛋 白質(zhì)作為免疫原，與佐劑一起免疫動(dòng)物，從而誘導(dǎo)針對CAPRIN-I的抗體。可以使從免疫后 的動(dòng)物采取的脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞這樣的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而制作雜交瘤， 然后選擇產(chǎn)生與CAPRIN-I結(jié)合的抗體的雜交瘤，使其增殖，從培養(yǎng)上清獲得以CAPRIN-I作 為對應(yīng)抗原的單克隆抗體。此外，上述方法是公知的常規(guī)方法。
[0075] 作為成為本發(fā)明的對象的癌，是過表達(dá)CAPRIN-I的癌，可列舉乳癌、腦瘤、食道 癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、脾癌、胰癌、大腸癌、皮膚癌、卵巢癌、子宮癌（子宮頸 癌和子宮體癌）、前列腺癌、膀胱癌、精巢癌、骨肉瘤。此外，還可列舉頭、頸的扁平上皮癌、 黑素瘤、各種腺癌、肝細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌樣牙齦腫、口腔內(nèi)腫瘤、肛周腺癌、肛 囊腫瘤、肛囊頂泌腺癌、支持細(xì)胞瘤、陰道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺 癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、支氣管腺癌、腺管癌、乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、 乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管周皮瘤、軟骨肉瘤、軟部組織肉瘤、組織球肉瘤、粘液肉 瘤、未分化肉瘤、肥大細(xì)胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹腔內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、淋巴瘤、慢性型淋 巴細(xì)胞性白血病、消化管型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小?中細(xì)胞型淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)腫 瘤、顆粒膜細(xì)胞瘤、褐色細(xì)胞瘤等等，但不限于這些。
[0076] 另外，成為本發(fā)明的方法的對象的生物體樣品源自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選源自人、狗、貓。
[0077] 作為供于本發(fā)明的方法的樣品，可列舉體液、組織或細(xì)胞。本說明書中"體液"是指 液體狀的生物體樣品。可列舉例如，血液（包含血清、血漿和間質(zhì)液）、淋巴液、腹水、胸水、 腦脊液、痰、淚液、鼻涕、唾液、尿、陰道液、精液等。還可以包含使用生理鹽水的腹腔洗滌液 等。優(yōu)選血清、血漿、腹水、或胸水。
[0078] 在本發(fā)明的方法中，在測定的生物體樣品中的CAPRIN-I表達(dá)量與健常個(gè)體相比 較高（優(yōu)選統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義地高）的情況下，顯示該生物體樣品所源自的生物體（個(gè)體） 中存在在該測定中使用的抗CAPRIN-I抗體能夠特異性地結(jié)合的癌（即，作為癌治療藥的 該抗體的靶）。利用這一點(diǎn)，可以對于源自癌患者的生物體樣品，通過本發(fā)明的方法來測定 CAPRIN-I的表達(dá)量，通過將該表達(dá)量與健常個(gè)體比較，可以判定患者的癌是否是能夠應(yīng)用 針對CAPRIN-I的治療藥的（例如，成為作為癌治療藥的該抗體的靶的）癌。
[0079] 因此基于本發(fā)明，能夠特定通過以以CAPRIN-I為靶的抗體為代表的治療藥的施 與而能夠期待治療效果的癌患者，能夠提供更有效的癌治療。
[0080] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的選擇方法，包括：使用對具有 序列號63所示的氨基酸序列的多肽有免疫反應(yīng)性的抗體，測定生物體樣品中的CAPRIN-I 的表達(dá)量，在該表達(dá)量與健常個(gè)體相比較高的情況（優(yōu)選統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義地高的情況）下， 選擇CAPRIN-I靶向藥優(yōu)選作為適合將對CAPRIN-I有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段 施與該生物體樣品所源自的個(gè)體的CAPRIN-I靶向癌治療藥。通過區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的 選擇，可以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用對患者個(gè)人最適合的癌治療法的所謂定制醫(yī)療。
[0081] 本說明書中所謂"統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義"，是指將二者之間的量的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 時(shí)有顯著性差異。具體地，可列舉例如，危險(xiǎn)率（顯著性水平）小于5%、1%或0.1%的情 況。檢驗(yàn)方法只要是能判斷顯著性的有無的公知的方法，就不特別限定。例如，可以使用學(xué) 生t檢驗(yàn)法、多重比較檢驗(yàn)法。
[0082] 實(shí)施例
[0083] 以下基于實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例例限制。
[0084] <實(shí)施例1各組織中的CAPRIN-I表達(dá)分析>
[0085] 按照W02010/016526的實(shí)施例1 (4)通過RT-PCR法來檢查CAPRIN-I基因在狗和人 的正常組織、以及各種癌組織或癌細(xì)胞株中的表達(dá)。其結(jié)果示于圖1。對于健常的狗組織，在 精巢中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)，另外在狗乳癌中發(fā)現(xiàn)表達(dá)。進(jìn)而，同時(shí)確認(rèn)了在人組織中的表達(dá)，結(jié)果 與狗CAPRIN-I基因同樣地，在正常組織中能確認(rèn)表達(dá)的僅為精巢，但對于癌細(xì)胞，在人乳 癌細(xì)胞株 8 種（ZR75-l、MCF7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-157、BT-20、MDA-MB-231V、MRK-nu-l)、 以及腦瘤細(xì)胞株4種、源自白血病的細(xì)胞株3種、肺癌細(xì)胞株1種、食道癌細(xì)胞株2種等多 種癌細(xì)胞株中檢測出表達(dá)。由該結(jié)果確認(rèn)了，CAPRIN-I在除精巢以外的正常組織中看不到 表達(dá)，另一方面，在以乳癌細(xì)胞株為代表的多種癌細(xì)胞株中表達(dá)。
[0086] <實(shí)施例2 :抗CAPRIN-I抗體的制作>
[0087] (1)小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體的制作
[0088] 將W02010/016526的實(shí)施例3中制備的具有序列號2的氨基酸序列的人 CAPRIN-1100 μ g與等量的MPL+TDM佐劑（シクY社制）混合，將所得的混合物作為每1只 小鼠的抗原溶液。將所述抗原溶液施與至6周齡的Balb/cc小鼠（日本SLC社制）的腹腔 內(nèi)后，每1周施與，再施與3次。將從最后的免疫起3天后摘出的脾臟夾在滅菌后的2片載 玻片中磨碎，將使用PBS (-)(日水社制）洗滌、然后以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘并除去上 清的操作重復(fù)3次，從而得到脾臟細(xì)胞。將所得的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (從 ATCC購入）以10:1的比率混和，在其中加入將加溫至37°C的包含10% FBS的RPMI1640培 養(yǎng)基200 μ L和PEG1500 ( <-卩 > 力'一社制）800 μ L混合而制備的PEG溶液，并靜置5分 鐘，從而進(jìn)行細(xì)胞融合。以1700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，除去上清，然后用加入了 2%當(dāng)量的 芊7'' 3社制的HAT溶液的含15% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基（HAT選擇培養(yǎng)基）150mL懸浮細(xì) 胞，以96孔板（^ >夕社制）的每1孔各100 μ 1接種于15塊板中。以7天、37°C、5% CO2 的條件培養(yǎng)，從而得到脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的雜交瘤。
[0089] 對于制作的雜交瘤，以由該雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和 性為指標(biāo)進(jìn)行篩選。將上述CAPRIN-I溶液1 μ g/mL在96孔板每1孔中添加100 μ L，在4°C 靜置18小時(shí)。將各孔用PBS-T洗滌3次后，在每1孔中添加0. 5%牛血清白蛋白（BSA)溶 液（シ夕Y社制）400 μ L，在室溫靜置3小時(shí)。除去溶液，對每1孔用400 μ L的PBS-T洗滌 孔3次后，在每1孔中添加上述所得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清100 μ L，在室溫靜置2小時(shí)。用 PBS-T洗滌各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀釋至5000倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG (H+L) 抗體（life technologies社制）100 μ L，在室溫靜置1小時(shí)。用I3BS-T洗滌孔3次后，在每 1孔中添加TMB底物溶液（Thermo社制）100 μ 1，并靜置15?30分鐘，從而進(jìn)行顯色反應(yīng)。 顯色后，在每1孔中添加IN硫酸100 μ 1使反應(yīng)停止，使用吸光度計(jì)測定450nm和595nm的 吸光度值。其結(jié)果是，篩選出了多個(gè)產(chǎn)生吸光度值高的抗體的雜交瘤作為目的雜交瘤的候 選株。
[0090] 將篩選出的雜交瘤以96孔板每1孔0. 5個(gè)的方式添加到板中進(jìn)行培養(yǎng)。1周后， 觀察到在孔中形成單個(gè)集落的雜交瘤。將這些孔的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，以由克隆化的雜 交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I蛋白的結(jié)合親和性為指標(biāo)，通過與上述同樣的方法進(jìn)行篩選， 獲得多個(gè)產(chǎn)生對CAPRIN-I蛋白顯示反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤株。將雜交瘤的培養(yǎng)上 清使用蛋白G擔(dān)載體進(jìn)行純化，獲得與CAPRIN-I結(jié)合的單克隆抗體150個(gè)
[0091] 接著從上述單克隆抗體篩選對表達(dá)CAPRIN-I的乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表面顯示反應(yīng) 性的單克隆抗體。具體地，在1.5mL容量的微量離心管中離心分離106個(gè)人乳癌細(xì)胞株 MDA-MB-231V，在其中添加上述各雜交瘤的培養(yǎng)上清lOOyL，在冰上靜置1小時(shí)。用PBS 洗滌后，添加用含0. 1 %胎牛血清的PBS稀釋至500倍的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG抗體 (Invitrogen社制），在冰上靜置1小時(shí)。用PBS洗滌后，用< 夕卜4 7 ? > y >株式 會社的FACSCalibur測定熒光強(qiáng)度。另一方面，對添加了培養(yǎng)基代替抗體的樣品進(jìn)行與上 述同樣的操作，作為對照。其結(jié)果是，得到了 10個(gè)與對照相比熒光強(qiáng)度強(qiáng)、即與乳癌細(xì)胞的 細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體（#1?#10)。這些單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的各 個(gè)氨基酸序列示于序列號44?60。上述單克隆抗體#1包含序列號44的重鏈可變區(qū)和序 列號45的輕鏈可變區(qū)，#2包含序列號44的重鏈可變區(qū)和序列號46的輕鏈可變區(qū)，#3包含 序列號44的重鏈可變區(qū)和序列號47的輕鏈可變區(qū)，#4包含序列號44的重鏈可變區(qū)和序 列號48的輕鏈可變區(qū)，#5包含序列號49的重鏈可變區(qū)和序列號50的輕鏈可變區(qū)，#6包含 序列號51的重鏈可變區(qū)和序列號52的輕鏈可變區(qū)，#7包含序列號53的重鏈可變區(qū)和序 列號54的輕鏈可變區(qū)，#8包含序列號55的重鏈可變區(qū)和序列號56的輕鏈可變區(qū)，#9包含 序列號57的重鏈可變區(qū)和序列號58的輕鏈可變區(qū)，#10包含序列號59的重鏈可變區(qū)和序 列號60的輕鏈可變區(qū)。
[0092] (2)與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面反應(yīng)的小鼠抗人CAPRIN-I抗體所結(jié)合的CAPRIN-I中的 肽的鑒定
[0093] 使用上述獲得的、與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面反應(yīng)的#1?#10的小鼠抗人CAPRIN-I單 克隆抗體，進(jìn)行由這些抗體所識別的CAPRIN-I中的部分序列的鑒定。
[0094] 首先，在用PBS溶解至1 μ g/ μ L的濃度的重組CAPRIN-I溶液100 μ L中，添加 DTT (Fluka社制）至終濃度為10mM，在95 °C反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行CAPRIN-I內(nèi)的二硫鍵的還 原，接著添加終濃度20mM的碘乙酰胺（和光純藥社制），在37°C、遮光條件下進(jìn)行30分鐘 硫醇基的烷基化反應(yīng)。在所得的還原烷基化CAPRIN-140 μ g中添加 #1?#10的小鼠抗人 CAPRIN-I單克隆抗體各50 μ g，用20mM磷酸緩沖液（pH7. 0)定容至lmL，一邊攪拌混合一邊 在4°C反應(yīng)一夜。
[0095] 接著，添加胰蛋白酶（7° 口 7力'社制）至終濃度0· 2 μ g，在37°C反應(yīng)1小時(shí)、2小 時(shí)、4小時(shí)和12小時(shí)后，在預(yù)先用含1 % BSA (シ夕Y社制）的PBS封閉、用PBS洗滌后的蛋 白A-玻璃珠（GE社制）和ImM碳酸鈣、NP-40緩沖液（20mM磷酸緩沖液（pH7. 4)、5mM EDTA、 150mM NaCl、l% NP-40)中混合，分別反應(yīng)30分鐘。
[0096] 將反應(yīng)液用25mM碳酸銨緩沖液（pH8. 0)洗滌后，使用0. 1 %甲酸100 μ L使抗原 抗體復(fù)合體溶出，對于溶出液使用Q-TOF Premier (Waters-MicroMass社制）進(jìn)行LC-MS分 析。分析按照儀器所附帶的方案進(jìn)行。
[0097] 其結(jié)果是，作為#1?#10的全部小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體所識別的 CAPRIN-I的部分氨基酸序列，鑒定了序列號61的多肽。進(jìn)而，作為單克隆抗體#1?#4、 # 5?#7和#9所識別的上述序列號61的多肽中的部分序列，鑒定了序列號62的肽，進(jìn)而判 定了單克隆抗體#10識別序列號63的肽。
[0098] (3)雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體的制作
[0099] 將W02010/016526的實(shí)施例3中制備的具有序列號2的氨基酸序列的人 CAPRIN-1300 μ g與等量的弗氏完全佐劑混合，將該混合物作為1只雞的抗原溶液。將抗原 溶液施與7周齡的雞的腹腔內(nèi)，每4周施與，施與7次，完成免疫。從最后免疫起4天后分 別取出脾臟，然后將其在兩片滅菌后的載玻片之間磨碎，將用PBS(-)(日水社制）洗滌并以 1500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘除去上清液的操作重復(fù)3次，獲得脾臟細(xì)胞。將獲得的脾臟細(xì) 胞與使用鳥類網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒通過轉(zhuǎn)化法由雞建立的缺少輕鏈的雞骨髓瘤細(xì)胞 以5:1的比例混合，向其中添加通過使加熱至37°C的含10% FBS的MDM培養(yǎng)基200 μ L與 PEG1500 ( <-卩 > 力'一社制）800 μ L混合而制備的PEG溶液，靜置5分鐘進(jìn)行細(xì)胞融合。 以1700轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，除去上清液后，將細(xì)胞用300mL添加了 2%當(dāng)量的Gibco社 制的HAT溶液的含10% FBS的MDM培養(yǎng)基（HAT選擇培養(yǎng)基）懸浮，并且以96孔板的每1 孔各100 μ L接種于30塊板（^ >夕社制）中。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)7天，獲得 由脾臟細(xì)胞與雞骨髓瘤細(xì)胞的融合而成的雜交瘤。
[0100] 以由制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I的結(jié)合親和力作為指標(biāo)來篩選雜交 瘤。在96孔板的每1孔中添加CAPRIN-I溶液（1 μ g/mL) 100 μ L，在4°C靜置18小時(shí)。將 各孔用PBS-T洗滌3次后，在每1孔中添加0. 5 %牛血清白蛋白（BSA)溶液（シ夕Y社 制）400 μ L，在室溫靜置3小時(shí)。除去溶液，用每1孔400 μ L的PBS-T洗滌各孔3次后，在 每1孔中添加添加上述獲得的雜交瘤的各培養(yǎng)上清液100 μ L，在室溫靜置2小時(shí)。用PBS-T 洗滌各孔3次，然后在每1孔中添加用PBS稀釋至5000倍的HRP標(biāo)記抗雞IgY抗體（SIGMA 社制），并且在室溫靜置1小時(shí)。用PBS-T洗滌孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液 (Thermo社制）100 μ L，靜置15?30分鐘，進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色后，在每1孔中添加IN硫 酸100 μ L使反應(yīng)停止，使用吸光度計(jì)測定450nm和595nm的吸光度值。其結(jié)果是，篩選出 了數(shù)個(gè)產(chǎn)生吸光度值高的抗體的雜交瘤作為目的雜交瘤的候選株。
[0101] 將篩選出的雜交瘤以96孔板每1孔0. 5個(gè)的方式添加到板中進(jìn)行培養(yǎng)。1周后， 觀察到在孔中形成單個(gè)集落的雜交瘤。將這些孔的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，以由克隆化的雜 交瘤產(chǎn)生的抗體對CAPRIN-I的結(jié)合親和性為指標(biāo)，通過與上述同樣的方法進(jìn)行篩選，獲得 了多個(gè)產(chǎn)生與CAPRIN-I蛋白顯示反應(yīng)性的單克隆抗體的雜交瘤株。
[0102] 接著篩選這些單克隆抗體中對表達(dá)CAPRIN-I的乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表面顯示反應(yīng) 性的單克隆抗體。具體地，在I. 5mL容量的微量離心管中離心分離5X IO5個(gè)人乳癌細(xì)胞 株MDA-MB-231V，向其中添加上述各雜交瘤的培養(yǎng)上清液100 μ 1，在冰上靜置1小時(shí)。在 用PBS洗滌后，添加用含0. 1 % FBS的PBS稀釋30倍的FITC標(biāo)記山羊抗雞IgG (H+L)抗體 (SouthernBiotech社制），在冰上靜置1小時(shí)。在用PBS洗滌后，使用< 夕卜> 7 ? > >株式會社的FACSCalibur測定熒光強(qiáng)度。另一方面，使用雜交瘤培養(yǎng)用培養(yǎng)基進(jìn)行與 上述同樣的操作，制備對照的樣品。其結(jié)果是，篩選出了 1個(gè)與對照相比熒光強(qiáng)度強(qiáng)、即與 表達(dá)CAPRIN-I的乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體（雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體 #11) 〇
[0103] (4)小鼠-雞嵌合重組抗體的制作
[0104] 將上述⑶中得到的、序列號64所示的雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的重鏈 可變區(qū)的基因擴(kuò)增片段的兩端進(jìn)行限制性酶處理后純化，按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了 源自雞抗體的前導(dǎo)序列和小鼠 IgGl的H鏈恒定區(qū)的pcDNA4/myc_His (life technologies 社制）載體中。另外，將序列號65所示的雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的輕鏈可變區(qū)的 基因擴(kuò)增片段的兩端進(jìn)行限制性酶處理后純化，按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了源自雞抗 體的前導(dǎo)序列和小鼠 IgGl的L鏈恒定區(qū)的pcDNA3. 1/myc-His (life technologies社制） 載體中。
[0105] 接著，將插入了雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的重鏈可變區(qū)的上述重組載體、 和插入了雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的輕鏈可變區(qū)的上述重組載體導(dǎo)入CHO-Kl細(xì)胞 (從理研七夕獲得）中。具體地，將在12孔培養(yǎng)板的每1孔中用ImL含有10% FBS 的 Ham'sF12 培養(yǎng)基（Iifetechnologies 社制）培養(yǎng)的 2 X IO5個(gè) CHO-Kl 細(xì)胞用 PBS (-)洗 滌后，在每1孔中重新加入含有10% FBS的Ham' s F12培養(yǎng)基lmL，在加入后的孔中添加 溶解在30 yL的OptiMEM (life technologies社制）中的上述各載體250ng與Polyfect transfection reagent (QIAGEN社制）30 μ L混合而成的混合物。將導(dǎo)入了上述重組載體 的 CH0-K1 細(xì)胞在添加了 200 μ g/mL Zeocin (life technologies 社制）以及 200 μ g/mL Geneticin (口シI社制）的含10% FBS的Ham' s F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，以96孔板的每I 孔中0. 5個(gè)的方式接種導(dǎo)入了上述重組載體的CH0-K1細(xì)胞，從而制作穩(wěn)定地產(chǎn)生具有雞單 克隆抗體#11的可變區(qū)和小鼠IgGl的恒定區(qū)的小鼠-雞嵌合抗人CAPRIN-I單克隆抗體 #12。將制作的細(xì)胞株使用150cm 2燒瓶，以5X 10 5個(gè)/mL使用不含血清的OptiCHO培養(yǎng)基 (Life technologies社制）30mL培養(yǎng)5天，得到含#12的培養(yǎng)上清。
[0106] (5)小鼠-雞嵌合抗人CAPRIN-I單克隆抗體#12所識別的CAPRIN-I表位的鑒定
[0107] 使用⑷中獲得的、與癌細(xì)胞的細(xì)胞表面反應(yīng)的小鼠-雞嵌合抗人CAPRIN-I單克 隆抗體#12,進(jìn)行所識別的CAPRIN-I表位區(qū)域的鑒定。將CAPRIN-I重組蛋白質(zhì)100 μ g溶 解在不含蛋白質(zhì)抑制劑的溶解緩沖液中，使其與單克隆抗體#12反應(yīng)。在該溶液中加入胰 蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化酶，在適當(dāng)溫度下進(jìn)行消化反應(yīng)。反應(yīng)后加入蛋白G-Sepharose 擔(dān)載體使其反應(yīng)，通過離心操作使擔(dān)載體沉淀。除去上清后，用溶解緩沖液和PBS洗滌并使 其溶解在0.1%的甲酸中，回收其上清。將回收的上清樣品加入反相柱（HLB Extraction Cartridge(C)ASIS社）），獲得除去了抗體的樣品溶液。將所得的樣品使用反相液相層析 (層析納米系統(tǒng)（KYA社））回收僅含肽的溶液，導(dǎo)入串聯(lián)型質(zhì)譜儀quadrupole-TOF mass spectrometer (Waters-Micromass社）中進(jìn)行MS/MS分析，檢測樣品內(nèi)所含的肽。其結(jié)果 是，作為小鼠-雞嵌合抗人CAPRIN-I單克隆抗體#12所識別的CAPRIN-I的部分序列，鑒定 出了包含序列號66的氨基酸序列的肽。另外，意味著該肽也是構(gòu)成抗體#12的可變區(qū)的雞 抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11所識別的CAPRIN-I的部分序列。
[0108] (6)人-雞嵌合抗人CAPRIN-I抗體的制作
[0109] 將上述（3)中得到的、序列號64所示的雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的重鏈可 變區(qū)的基因擴(kuò)增片段的兩端進(jìn)行限制性酶處理后純化，按照常規(guī)方法插入到已經(jīng)插入了包 含序列號67的源自雞抗體的前導(dǎo)序列和包含序列號68的人IgGl的H鏈恒定區(qū)的pcDNA4/ myc-His (life technologies社制）載體中。另外，將序列號65所示的雞抗人CAPRIN-I單 克隆抗體#11的輕鏈可變區(qū)的基因擴(kuò)增片段的兩端進(jìn)行限制性酶處理后純化，按照常規(guī)方 法插入到已經(jīng)插入了包含序列號68的源自雞抗體的前導(dǎo)序列和包含序列號69的人IgGl 的 L 鏈恒定區(qū)的 pcDNA3. 1/myc-His (life technologies 社制）載體中。
[0110] 接著，將插入了上述抗體#11的重鏈可變區(qū)的上述重組載體、和插入了上述抗 體#11的輕鏈可變區(qū)的上述重組載體導(dǎo)入到CHO-Kl細(xì)胞（由理研七夕獲得）中。 具體地，將在12孔培養(yǎng)板的每1孔中用ImL含有10% FBS的Ham' s F12培養(yǎng)基（life technologies社制）培養(yǎng)的2 X IO5個(gè)CHO-Kl細(xì)胞用PBS (-)洗滌后，在每1孔中重新加入 含10% FBS的Ham's F12培養(yǎng)基lmL，在加入后的孔中添加溶解在30 yL的OptiMEM(life technologies 社制）中的上述各載體 250ng 與 Polyfect transfection reagent (QIAGEN 社制）30 μ L混合而成的混合物。將導(dǎo)入了上述重組載體的CH0-K1細(xì)胞在添加了 200 μ g/ mL Zeocin (life technologies 社制）以及 200 μ g/mL 的 Geneticin (口 シ i 社制）的含 10% FBS的Ham's F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，向96孔板中以每1孔0. 5個(gè)的方式接種導(dǎo)入了上 述重組載體的CH0-K1細(xì)胞，制作穩(wěn)定地產(chǎn)生具有雞抗人CAPRIN-I單克隆抗體#11的可變 區(qū)和人IgGl的恒定區(qū)的人-雞嵌合抗人CAPRIN-I抗體#13的細(xì)胞株。將制作的細(xì)胞株使 用150cm 2燒瓶、以5X 10 5個(gè)/mL使用不含血清的OptiCHO培養(yǎng)基（Life technologies社 制）30mL培養(yǎng)5天，得到包含上述抗體#13的培養(yǎng)上清。
[0111] ⑵小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#14的制作
[0112] 通過與（1)同樣的方法，以（2)中鑒定的序列號63的氨基酸序列與載體蛋白質(zhì) KLH(Keyhole limpet haemocyanin)的融合蛋白質(zhì)作為免疫原，與等量的佐劑劑TiterMax Gold(注冊商標(biāo)）（CytRx社）混合，每隔7天在小鼠的皮下施與，每1次施與20 μ g。合計(jì) 進(jìn)行4次施與后，從最終免疫開始3天后的小鼠獲得脾臟細(xì)胞，通過與上述（1)同樣的方 法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合而制作雜交瘤。然后，以制作的雜交瘤的培養(yǎng)上清中所含的各抗 體與W02010/016526的實(shí)施例3中制備的CAPRIN-I溶液1 μ g/mL或作為免疫原使用的序 列號63的氨基酸序列與載體蛋白質(zhì)KLH的融合蛋白質(zhì)的反應(yīng)性作為指標(biāo)，篩選抗體。將 W02010/016526的實(shí)施例3中制備的CAPRIN-I溶液1 μ g/mL、和序列號63的氨基酸序列與 載體蛋白質(zhì)的BSA的融合蛋白質(zhì)30 μ g/mL分別在96孔板的每1孔種添加100 μ L，在4°C 靜置18小時(shí)。將各孔用PBS-T洗滌后，在每1孔中添加Block Ace(DS 7 才夕尹 4力;14土）溶液400 μ L，在室溫靜置3小時(shí)。除去溶液，用PBS-T洗滌孔后，在每1孔中添 加上述得到的雜交瘤的各培養(yǎng)上清100 μ L，在室溫靜置2小時(shí)。用PBS-T洗滌各孔后，在每 1孔中添加用PBS稀釋至5000倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG (H+L)抗體（life technologies社 制）100 μ L，在室溫靜置1小時(shí)。用PBS-T洗滌孔后，在每1孔中添加TMB底物溶液（Thermo 社制）100 μ L，靜置5?30分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色后，在每1孔中添加IN硫酸100 μ L， 使反應(yīng)停止，使用吸光度計(jì)測定450nm和595nm的吸光度值。其結(jié)果篩選出了產(chǎn)生吸光度 值高的抗體的雜交瘤。
[0113] 將篩選出的雜交瘤以96孔板的每1孔中0.3個(gè)的方式添加到板中進(jìn)行培養(yǎng)。1周 后，觀察到在孔中形成單一集落的雜交瘤。將這些孔的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，以克隆的雜交瘤所 產(chǎn)生的抗體對作為CAPRIN-I的部分序列的序列號63的氨基酸序列的結(jié)合親和性為指標(biāo)， 使用與上述同樣的方法，獲得產(chǎn)生針對序列號63的氨基酸的抗體的雜交瘤。
[0114] 篩選得到的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體內(nèi)與表達(dá)CAPRIN-I的乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表 面顯示反應(yīng)性的抗體。具體地，將106個(gè)人乳癌細(xì)胞株MDA-MB-231V在I. 5mL容量的微量 離心管中進(jìn)行離心分離，在其中添加上述各雜交瘤的培養(yǎng)上清100 μ L，在冰上靜置1小時(shí)。 用PBS洗滌后，添加用含0. 1% FBS的PBS稀釋至500倍的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體 (life technologies社制），在冰上靜置1小時(shí)。用PBS洗滌后，用< 夕卜7 ? V >株式會社的FACS Calibur測定熒光強(qiáng)度。另一方面，對于使用將未進(jìn)行任何處理的6周 齡Balb/c小鼠的血清用雜交瘤培養(yǎng)用培養(yǎng)基稀釋500倍代替抗體而得的樣品、以及僅與二 抗反應(yīng)而得的樣品，進(jìn)行與上述同樣的操作，作為陰性對照。其結(jié)果獲得了與陰性對照相比 熒光強(qiáng)度強(qiáng)、即與乳癌細(xì)胞的細(xì)胞表面反應(yīng)的小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#14。上述抗 體#14包含序列號70的重鏈可變區(qū)和序列號71的輕鏈可變區(qū)。
[0115] 調(diào)查得到的小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#14與作為免疫原的CAPRIN-I的部分 序列即序列號63的氨基酸序列的特異性反應(yīng)。將用0. IM的碳酸鈉水溶液調(diào)制成30 μ g/ mL的包含序列號63的氨基酸序列的溶液和不包含序列號63的氨基酸序列的CAPRIN-I的 部分序列，分別在ELISA用96孔板Immobilizer Amino ( ^ >夕社）中添加各100 μ g/mL， 在4°C使其反應(yīng)一晝夜，使肽與孔結(jié)合。在結(jié)合了肽的孔中添加包含IOmM乙醇胺的0. IM碳 酸鈉水溶液，在室溫靜置1小時(shí)。除去孔內(nèi)的溶液后，用PBS-T洗滌，然后在每1孔中添加 Block Ace溶液400 μ L，在室溫靜置3小時(shí)。除去孔內(nèi)的溶液，用PBS-T洗滌后，在每1孔 中添加包含小鼠單克隆抗體#14的培養(yǎng)上清50 μ L，在室溫使其反應(yīng)1小時(shí)。然后用PBS-T 洗滌，在每1孔中添加用Block Ace溶液稀釋至5000倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(H+L)抗體 (life technologies社制）50 μ L，在室溫靜置1小時(shí)。用PBS-T將孔充分洗滌后，在每1 孔中添加TMB底物溶液（Thermo社制）100 μ L，靜置5?30分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色后， 在每1孔中添加IN硫酸100 μ L使反應(yīng)停止，使用吸光度計(jì)測定450nm和595nm的吸光度 值，結(jié)果小鼠單克隆抗體#14與不含序列號63的氨基酸序列的CAPRIN-I的部分序列完全 不反應(yīng)，僅與序列號63的氨基酸序列特異性地反應(yīng)。因此確認(rèn)，序列號63的多肽包含抗 CAPRIN-I抗體#14的表位區(qū)域。
[0116] <實(shí)施例3 :最適合CAPRIN-I檢測的抗體的篩選>
[0117] (1)使用人乳癌組織的抗體的篩選
[0118] 使用石蠟包埋的人乳癌組織陣列（MBL社制）的乳癌組織31個(gè)樣本進(jìn)行免疫組織 化學(xué)染色。將人乳癌組織陣列在60°C處理3小時(shí)后，裝入充滿了二甲苯的染色瓶中，將每隔 5分鐘替換二甲苯的操作進(jìn)行3次。接下來，使用乙醇和PBS-T進(jìn)行與所述二甲苯同樣的操 作。將人乳癌組織陣列裝入充滿了包含〇. 05% Tween20的IOmM檸檬酸緩沖液（pH6. 0)的 染色瓶中，在125°C處理5分鐘后，在室溫靜置40分鐘以上。將切片周圍的多于水分用無塵 紙擦去，用DAK0PEN(DAK0社制）包圍，滴加適量的Peroxidase Block(DAKC)社制）。在室 溫靜置5分鐘后，裝入充滿PBS-T的染色瓶中，將每隔5分鐘替換PBS-T的操作進(jìn)行3次。 作為封閉液，裝載包含10% FBS的PBS-T溶液，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接著裝載將 實(shí)施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#8或#14分別用含5% FBS的PBS-T溶 液調(diào)制為10 μ g/mL而得的溶液，在濕室內(nèi)在4°C靜置一夜。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分 鐘的洗絳后，滴加適量Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAK0社制），在濕室內(nèi) 在室溫靜置30分鐘。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，裝載DAB顯色液（DAK0社 制），在室溫靜置10分鐘左右后，丟棄顯色液，用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌。用 蒸餾水沖洗后，依次放入70%、80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分鐘，最后在二 甲苯中靜置一夜。取出載玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制）封入后，進(jìn)行觀 察。組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量按照以下基準(zhǔn)判定。選擇顯示陽性觀察結(jié)果的載玻片，確 認(rèn)CAPRIN-I染色像。首先，使用光學(xué)顯微鏡的4倍物鏡，觀察組織內(nèi)的癌細(xì)胞的CAPRIN-I 染色像、陽性染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率。接著，將物鏡切換為10倍或20倍，探索陽性觀察結(jié) 果定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。通過以上的方法判定檢測結(jié)果，分類為得分〇?3。得分的詳 細(xì)如下。
[0119] ?得分0(無 CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0120] ?得分1 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0121] ?得分2(有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0122] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0123] 檢測結(jié)果為得分2和3的情況下，判定為CAPRIN-I陽性的癌組織。
[0124] 其結(jié)果是，使用任一抗體都能夠在乳癌組織中確認(rèn)CAPRIN-I的表達(dá)。在使用抗體 #8的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果中，得分2為14個(gè)樣本，得分3為1個(gè)樣本，CAPRIN-I陽性 的樣本數(shù)為15個(gè)樣本，與此相對，在使用抗體#14的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果中，得分2為 12個(gè)樣本，得分3為8個(gè)樣本，CAPRIN-I陽性的樣本數(shù)為20個(gè)樣本。因此，在使用人癌組 織的CAPRIN-I的檢測中，選擇靈敏度更高的抗體#14。
[0125] (2)通過使用抗體#14的免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行的人各種正常組織上的 CAPRIN-I的檢測
[0126] 使用人正常組織陣列（BIOMAX社制）（包含腦、甲狀腺、肺、脾臟、腎臟、食道、胃、 大腸、胰臟、肌肉、皮膚、唾液腺、卵巢、子宮、乳腺、胎盤、骨髓、精巢、前列腺子宮、前列腺的 組織），進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將切片周圍多余水分用無塵紙擦去，用DAKOPEN (DAKO社 制）包圍，滴加適量的Peroxidase Block(DAKC)社制）。在室溫靜置5分鐘后，裝入充滿了 PBS-T的染色瓶中，將每隔5分鐘替換PBS-T的操作進(jìn)行3次。作為封閉液，裝載含10% FBS的PBS-T溶液，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接著，裝載將實(shí)施例2中制作的小鼠抗人 CAPRIN-I單克隆抗體#14用含5% FBS的PBS-T溶液調(diào)制成10 μ g/mL而得的溶液，在濕 室內(nèi)在4°C靜置一夜。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，滴加適量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAK0社制），在濕室內(nèi)室溫靜置30分鐘。用PBS-T進(jìn)行3 次、每次10分鐘的洗滌后，裝載DAB顯色液（DAK0社制），在室溫靜置10分鐘左右后，丟棄 顯色液，用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌。用蒸餾水沖洗后，依次放入70%、80%、 90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分鐘，最后在二甲苯中靜置一夜。取出載玻片，用 Glycergel Mounting Medium(DAKC)社制）封入后，進(jìn)行觀察。
[0127] 組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量按照以下基準(zhǔn)判定。選擇顯示陽性觀察結(jié)果的載 玻片，確認(rèn)CAPRIN-I染色像。首先，使用光學(xué)顯微鏡的4倍物鏡，觀察組織內(nèi)的癌細(xì)胞的 CAPRIN-I染色像、陽性染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率。接著，將物鏡切換為10倍或20倍，探索陽 性觀察結(jié)果定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。通過以上的方法判定檢測結(jié)果，分類為得分0?3。 得分的詳細(xì)如下。
[0128] ?得分0 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0129] ?得分1 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0130] ?得分2 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0131] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0132] 在檢測結(jié)果為得分2和3的情況下，判定為CAPRIN-I陽性的癌組織。
[0133] 子宮和前列腺得分1，除此以外的組織全部得分0。因此，人正常組織中沒有發(fā)現(xiàn) CAPRIN-I的表達(dá)。
[0134] (3)通過使用小鼠抗人CAPRIN-I抗體#14的免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行的人各種癌 組織上的CAPRIN-I的檢測
[0135] 使用石蠟包埋的人癌組織陣列（BIOMAX社制）的各種癌組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué) 染色。將人癌組織陣列在60°C處理3小時(shí)后，裝入充滿了二甲苯的染色瓶中，將每隔5分 鐘替換二甲苯的操作進(jìn)行3次。接下來，用乙醇和PBS-T進(jìn)行與所述二甲苯同樣的操作。 將人癌組織陣列裝入充滿了包含0. 05% Tween20的IOmM檸檬酸緩沖液（pH6. 0)的染色瓶 中，在125°C處理5分鐘后，在室溫靜置40分鐘以上。將切片周圍多余水分用無塵紙擦去， 用DAKOPEN(DAKO社制）包圍，滴加適量的Peroxidase Block(DAKC)社制）。在室溫靜置5 分鐘后，裝入充滿了 PBS-T的染色瓶中，將每隔5分鐘替換PBS-T的操作進(jìn)行3次。作為 封閉液，裝載含10% FBS的PBS-T溶液，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接著，裝載將實(shí)施例 2中制作的單克隆抗體#14用含5% FBS的PBS-T溶液調(diào)制成10 μ g/mL而得的溶液，在濕 室內(nèi)在4°C靜置一夜。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，滴加適量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated (DAK0社制），在濕室內(nèi)室溫靜置30分鐘。用PBS-T進(jìn)行 3次、每次10分鐘的洗滌后，裝載DAB顯色液（DAK0社制），在室溫靜置10分鐘左右后，丟 棄顯色液，用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌。用蒸餾水沖洗，然后依次放入70%、 80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分鐘，最后在二甲苯中靜置一夜。取出載玻片， 用 Glycergel Mounting Medium(DAKC)社制）封入后，進(jìn)行觀察。
[0136] 組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量按照以下基準(zhǔn)判定。選擇顯示陽性觀察結(jié)果的載 玻片，確認(rèn)CAPRIN-I染色像。首先，使用光學(xué)顯微鏡的4倍物鏡，觀察組織內(nèi)的癌細(xì)胞的 CAPRIN-I染色像、陽性染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率。接著，將物鏡切換為10倍或20倍，探索陽 性觀察結(jié)果定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。通過以上的方法判定檢測結(jié)果，分類為得分0?3。 得分的詳細(xì)如下。
[0137] ?得分0 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0138] ?得分1 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0139] ?得分2 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0140] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0141] 在檢測結(jié)果為得分2和3的情況下，判定為CAPRIN-I陽性的癌組織。
[0142] 其結(jié)果確認(rèn)了，CAPRIN-I在腦瘤組織22個(gè)樣本內(nèi)的16個(gè)樣本（64% )、肺癌組織 32個(gè)樣本內(nèi)的19個(gè)樣本（59% )、子宮癌組織21個(gè)樣本內(nèi)的18個(gè)樣本（86% )、食道癌組 織16個(gè)樣本內(nèi)的10個(gè)樣本（63% )、腎癌組織30個(gè)樣本內(nèi)的27個(gè)樣本（90% )、肝癌組織 17個(gè)樣本內(nèi)的14個(gè)樣本（82% )、甲狀腺癌組織15個(gè)樣本內(nèi)的11個(gè)樣本（73% )、胃癌組 織14個(gè)樣本內(nèi)的10個(gè)樣本（71% )、胰癌組織19個(gè)樣本內(nèi)的17個(gè)樣本（89% )、前列腺癌 組織13個(gè)樣本中13個(gè)樣本（100% )、膀胱癌組織14個(gè)樣本中12個(gè)樣本（86% )、大腸癌 組織14個(gè)樣本內(nèi)的11個(gè)樣本（79% )、皮膚癌組織30個(gè)樣本內(nèi)的24個(gè)樣本（80% )和乳 癌組織21個(gè)樣本內(nèi)的16個(gè)樣本（76% )中，分別為陽性。
[0143] (4)通過使用小鼠抗人CAPRIN-I抗體#14的免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行的狗乳癌組 織上的CAPRIN-I的檢測
[0144] 使用在病理診斷中診斷為惡性乳癌的狗的冷凍的乳癌組織100個(gè)樣本，進(jìn)行免疫 組織化學(xué)染色。將冷凍狗乳癌組織使用低溫恒溫器（LEICA社制）切成10?20 μm的薄 片，放置于載玻片上，隔著載玻片用吹風(fēng)機(jī)風(fēng)干30分鐘，從而制作安放了薄切組織的載玻 片。接著裝入充滿了 PBS-T (含0.05 % Tween20的生理鹽水）的染色瓶中，將每隔5分鐘 替換PBS-T的操作進(jìn)行3次。將切片周圍多余水分用無塵紙擦去，用DAKOPEN(DAKO社制） 包圍后，作為封閉液，裝載含10%胎牛血清的PBS-T溶液，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接 著，裝載將實(shí)施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#8或#14分別用封閉液調(diào)制 成10 μ g/mL而得的溶液，在濕室內(nèi)在4°C下靜置一夜。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的 洗滌后，裝載用封閉液稀釋了 250倍的MOM生物素標(biāo)記抗IgG抗體（VECTASTAIN社制），在 濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，裝載親和素-生物 素ABC試劑（VECTASTAIN社制），在濕室內(nèi)在室溫靜置5分鐘。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10 分鐘的洗滌后，裝載 DAB 顯色液（DAB 10mg+30 % H2O2IO μ L/0. 05M Tris-HCl (pH7. 6) 50mL)， 在濕室內(nèi)在室溫靜置30分鐘。用蒸餾水沖洗，裝載蘇木精試劑（DAK0社制），在室溫靜置I 分鐘后，用蒸餾水沖洗。依次放入70%、80%、90%、95%、100%的各乙醇溶液中各1分鐘 后，最后在二甲苯中靜置一夜。取出載玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制） 封入后，進(jìn)行觀察。組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量按照以下基準(zhǔn)判定。選擇顯示陽性觀察結(jié) 果的載玻片，確認(rèn)CAPRIN-I染色像。首先，使用光學(xué)顯微鏡的4倍物鏡，觀察組織內(nèi)的癌細(xì) 胞的CAPRIN-I染色像、陽性染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率。接著，將物鏡切換為10倍或20倍， 探索陽性觀察結(jié)果定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。通過以上的方法判定檢測結(jié)果，分類為得分 〇?3。得分的詳細(xì)如下。
[0145] ?得分0 (無CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0146] ?得分1 (無CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0147] ?得分2 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0148] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0149] 在檢測結(jié)果為得分2和3的情況下為陽性，判定為能通過針對CAPRIN-I的治療藥 施與而獲得有效的治療效果的荷癌犬組織。
[0150] 其結(jié)果是，使用任一抗體均能夠在狗乳癌組織中確認(rèn)CAPRIN-I的表達(dá)。具體地， 在使用抗體#8的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果中，得分2為69個(gè)樣本，得分3為11個(gè)樣本， CAPRIN-I陽性的樣本數(shù)為80個(gè)樣本（80% )，與此相對，在使用抗體#14的免疫組織化學(xué)染 色的結(jié)果中，得分2為50個(gè)樣本，得分3為32個(gè)樣本，CAPRIN-I陽性的樣本數(shù)為82個(gè)樣 本（82% )。
[0151] (5)通過使用小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#14的免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行的貓 乳癌組織上的CAPRIN-I的檢測
[0152] 使用在病理診斷中診斷為惡性乳癌的貓的冷凍乳癌組織30個(gè)樣本，進(jìn)行免疫組 織化學(xué)染色。將冷凍貓癌組織使用低溫恒溫器（LEICA社制），切成10?20 μ m的薄片，放置 于載玻片上，隔著載玻片用吹風(fēng)機(jī)風(fēng)干30分鐘，從而制作安放了薄切組織的載玻片。接著， 放入充滿了 PBS-T (含0.05% Tween20的生理鹽水）的染色瓶中，將每隔5分鐘替換PBS-T 的操作進(jìn)行3次。將切片周圍多余水分用無塵紙擦去，用DAKOPEN(DAKO社制）包圍后，作 為封閉液，裝載含10%胎牛血清的PBS-T溶液，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接著，裝載將 實(shí)施例2中制作的小鼠抗人CAPRIN-I單克隆抗體#8或#14分別用封閉液調(diào)制成10 μ g/ml 而得的溶液，在濕室內(nèi)在4°C下靜置一夜。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，裝載 用封閉液稀釋了 250倍的MOM生物素標(biāo)記抗IgG抗體（VECTASTAIN社制），在濕室內(nèi)在室 溫靜置1小時(shí)。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌后，裝載親和素-生物素ABC試劑 (VECTASTAIN社制），在濕室內(nèi)在室溫靜置5分鐘。用PBS-T進(jìn)行3次、每次10分鐘的洗滌 后，裝載 DAB 顯色液（DAB 10mg+30 % H2O210 μ 1/0. 05M Tris-HCl (pH7. 6) 50ml)，在濕室內(nèi)在 室溫靜置30分鐘。用蒸餾水沖洗，裝載蘇木精試劑（DAKO社制），在室溫靜置I分鐘后，用 蒸餾水沖洗。依次放入70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的各乙醇溶液中各1分鐘后，最后在二 甲苯中靜置一夜。取出載玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制）封入后，進(jìn)行觀 察。組織中的CAPRIN-I的表達(dá)量按照以下基準(zhǔn)判定。選擇顯示陽性觀察結(jié)果的載玻片，確 認(rèn)CAPRIN-I染色像。首先，使用光學(xué)顯微鏡的4倍物鏡，觀察組織內(nèi)的癌細(xì)胞的CAPRIN-I 染色像、陽性染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞率。接著，將物鏡切換為10倍或20倍，探索陽性觀察結(jié) 果定位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞質(zhì)。通過以上的方法判定檢測結(jié)果，分類為得分〇?3。得分的詳 細(xì)如下。
[0153] ?得分0 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：細(xì)胞膜無陽性染色，或者有細(xì)胞膜的陽性染色的 癌細(xì)胞小于10%。
[0154] ?得分1 (無 CAPRIN-I過表達(dá)）：有基本不能識別的微弱的細(xì)胞膜的染色的癌細(xì)胞 為10%以上，癌細(xì)胞僅細(xì)胞膜被部分染色。
[0155] ?得分2 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有弱?中程度的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì) 胞為10%以上，或者有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為10%以上30%以下。
[0156] ?得分3 (有CAPRIN-I過表達(dá)）：有強(qiáng)的完全的細(xì)胞膜的陽性染色的癌細(xì)胞為30% 以上。
[0157] 在檢測結(jié)果為得分2和3的情況下為陽性，判定為能通過針對CAPRIN-I的治療藥 施與而獲得有效的治療效果的荷癌貓組織。
[0158] 其結(jié)果是，使用任一抗體均能在貓乳癌組織中確認(rèn)CAPRIN-I的表達(dá)。具體地， 在使用抗體#8的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果中，得分2為20個(gè)樣本，得分3為4個(gè)樣本， CAPRIN-I陽性的樣本數(shù)為24個(gè)樣本（80% )，與此相對，在使用抗體#14的免疫組織化學(xué)染 色的結(jié)果中，得分2為21個(gè)樣本，得分3為6個(gè)樣本，CAPRIN-I陽性的樣本數(shù)為27個(gè)樣本 (90% ) 〇
[0159] <實(shí)施例4 :使用癌的樣品的CAPRIN-I的表達(dá)評價(jià)與由抗CAPRIN-I抗體產(chǎn)生的 抗腫瘤效果的相關(guān)性>
[0160] (1)通過免疫組織化學(xué)染色法、使用源自移植了小鼠癌細(xì)胞的荷癌小鼠的癌組織 的CAPRIN-I的檢測
[0161] 在26只Balb/c小鼠（日本SLC社制）的背部皮下，將源自小鼠的癌細(xì)胞2種 (B16F10，EMT-6)分別移植5只，使其成長至腫瘤為直徑7_左右的大小。從移植了癌細(xì)胞 2種的小鼠的2組中篩選出各3只，切下腫瘤塊，在PBS中將腫瘤塊切開，用含4%低聚甲 醛（PFA)的0. IM磷酸緩沖液（pH7. 4)進(jìn)行一夜回流固定。丟棄回流液，用PBS洗滌各臟器 的組織表面，將含10%蔗糖的PBS溶液裝入50mL容量的離心管中，在其中加入癌組織，在 4°C使用旋轉(zhuǎn)器振蕩2小時(shí)。替換成含20%蔗糖的PBS溶液，在4°C靜置至癌組織沉降后， 替換成含30%蔗糖的PBS溶液，再在4°C靜置至癌組織沉降。取出癌組織，用手術(shù)刀切下必 要的部分。接著，加入OCT冷凍切片包埋劑（Tissue Tek社制）適應(yīng)組織表面后，在冷凍 切片包埋模具中配置組織。在干冰上放置冷凍切片包埋模具使其急速冷凍后，使用低溫恒 溫器（LEICA社制）切成10?20 μπι的薄片，隔著載玻片用吹風(fēng)機(jī)風(fēng)干30分鐘，從而制作 安放了薄切組織的載玻片。第二天，用PBS(-)洗滌3次。作為封閉液，裝載含5%山羊血 清的PBS(-)，在濕室內(nèi)在室溫靜置1小時(shí)。接著，裝載用包含實(shí)施例2中制作的小鼠抗人 CAPRIN-I單克隆抗體#8或#14的PBS(-)溶液調(diào)制成10 μ g/mL而得的溶液，在濕室內(nèi)在 4°C靜置一夜。用PBS(-)進(jìn)行5次、每次5分鐘的洗滌后，滴加適量Peroxidase Labelled Polymer ConjugatecKDAKO社制），在濕室內(nèi)室溫靜置30分鐘。用PBS-T進(jìn)行6次、每次5 分鐘的洗滌后，裝載DAB顯色液（DAK0社制），在室溫靜置10分鐘左右后，丟棄顯色液。用 PBS(-)進(jìn)行3次、每次5分鐘的洗絳后，用Glycergel Mounting Medium(DAK0社制）封入 后，進(jìn)行觀察。如實(shí)施例3所記載那樣進(jìn)行得分分類，使用抗體#8的免疫組織化學(xué)染色的 結(jié)果是源自黑素瘤的細(xì)胞B16F10和源自乳癌的細(xì)胞EMT-6均為得分1，未檢測到CAPRIN-I 表達(dá)。另一方面，在使用抗體#14的結(jié)果中，對癌細(xì)胞B16F10與抗體#8同樣地為得分1，但 對癌細(xì)胞EMT-6為得分3。
[0162] (2)由抗CAPRIN-I抗體產(chǎn)生的抗腫瘤效果
[0163] 使用人-雞嵌合抗人CAPRIN-I抗體#13,研宄使用上述⑴中制作的荷癌小鼠的 抗腫瘤效果。對移植了 B16F10和EMT-6的各癌細(xì)胞的荷癌小鼠 10只中各5只，腹腔內(nèi)施 與抗體#13,每1只各200 μ g(200 μ L)。然后，以2天共計(jì)3次在腹腔施與等量的抗體，以 此作為研宄組，每天計(jì)測腫瘤的大小，觀察#13抗體的抗腫瘤效果。另一方面，對各荷癌小 鼠的其余5只，施與PBS(-)代替抗體，以此作為對照組。
[0164] 抗腫瘤效果的觀察結(jié)果是，在施與了抗體#13的B16F10移植研宄組中，腫瘤體積 在以抗體施與開始時(shí)為100%的情況下，在第4天、第6天、第8天、第11天分別增大至約 150%、200 %、370%、630 %。另一方面，在施與了抗體#13的EMT-6移植研宄組中，腫瘤體 積在以抗體施與開始時(shí)為100%的情況下，在第4天萎縮至51%，第6天萎縮至31%左右， 第8天腫瘤萎縮至9 %，到第10?14天腫瘤基本完全萎縮。此外，在施與了 PBS (-)的對照 組中，B16F10移植研宄組和EMT-6移植研宄組的任一者均在第4天、第6天、第8天、第11 天腫瘤分別增大至約230 %、290 %、470 %、800 %。
[0165] 由以上的結(jié)果，在使用抗體#8的情況下，CAPRIN-I的檢測結(jié)果與由該抗體的抗腫 瘤活性產(chǎn)生的癌治療效果未發(fā)現(xiàn)相關(guān)，但在使用抗體#14的情況下，CAPRIN-I的檢測結(jié)果 與由該抗體的抗腫瘤活性產(chǎn)生的癌治療效果發(fā)現(xiàn)了相關(guān)性。即，由于移植了 EMT-6的癌組 織中的利用抗體#14的CAPRIN-I的檢測結(jié)果為得分3,因而確認(rèn)了 CAPRIN-I的過表達(dá)，并 且還確認(rèn)了基于由該抗體的施與產(chǎn)生的抗腫瘤活性的藥理效果。
[0166] 另一方面，移植了 B16F10的癌組織中的利用抗體#14的CAPRIN-I的表達(dá)的檢測 結(jié)果為得分1，未檢測到CAPRIN-I的表達(dá)，另外即使將具有抗腫瘤活性的抗體#13施與移植 了 B16F10的荷癌小鼠，也得不到藥理效果。
[0167] 由以上的結(jié)果能夠預(yù)測，如果使用作為本發(fā)明的與CAPRIN-I特異性地結(jié)合的抗 體的#14來檢測癌組織中的CAPRIN-1，對判定為其表達(dá)量高的癌或個(gè)體施與具有抗腫瘤效 果的抗CAPRIN-I抗體，則獲得高的治療效果。
[0168] 產(chǎn)業(yè)可利用性
[0169] 本發(fā)明用于癌的診斷而在產(chǎn)業(yè)上有用。
[0170] 將本說明書中引用的所有刊物、專利和專利申請直接作為參考引入本說明書中。
[0171] 序列表自由文本
[0172] 序列號31?36、38?42 :引物
【權(quán)利要求】
1. 癌的檢測方法，包括：使用與具有序列號63所示的氨基酸序列的多膚具有免疫反應(yīng) 性的抗體或其抗原結(jié)合片段，通過抗原抗體反應(yīng)，來測定生物體樣品中的CAPRIN-1的表達(dá) 量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的癌的檢測方法，要測定的所述CAPRIN-1是 (a)具有序列表的序列號2?30中偶數(shù)的序列號所示的任一氨基酸序列的多膚，或者 化）與所述多膚具有85% W上的序列同一性的多膚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自人、狗或貓。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自狗，要測定 的所述CAPRIN-1具有序列號6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?3的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品源自人，要測定 的所述CAPRIN-1具有序列號2或4所示的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，在測定出的CAPRIN-1表達(dá)量與 健常個(gè)體相比有意義地高的情況下，顯示成為作為癌治療藥的所述抗體的祀的癌存在。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述CAPRIN-1的表達(dá)量的測定 使用免疫分析法來進(jìn)行。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的癌的檢測方法，所述免疫分析法是化ISA和/或免疫組織化 學(xué)染色法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?8的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述生物體樣品是體液、組織或 細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述癌是選自乳癌、腦瘤、食道 癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌、脾癌、膜癌、大腸癌、皮膚癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺 癌、膀脫癌、精巢癌、骨肉瘤和纖維肉瘤中的至少1種癌。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1?10的任一項(xiàng)所述的癌的檢測方法，所述抗體或其抗原結(jié)合片段 是具有包含序列號70所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含序列號71所示的氨基酸序列 的輕鏈可變區(qū)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
12. 癌診斷藥或試劑盒，其特征在于，包含與具有序列號63所示的氨基酸序列的多膚 具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的癌診斷藥或試劑盒，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是具有包 含序列號70所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含序列號71所示的氨基酸序列的輕鏈可 變區(qū)的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
14. 區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的選擇方法，使用與具有序列號63所示的氨基酸序列的多膚 具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段來測定生物體樣品中的CAPRIN-1的表達(dá)量，在 該表達(dá)量與健常個(gè)體相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義地高的情況下，確定選擇CAPRIN-1祀向藥作 為適合對該生物體樣品所源自的個(gè)體進(jìn)行施與的癌治療藥。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的區(qū)別個(gè)體的癌治療藥的選擇方法，其特征在于，所述 CAPRIN-1祀向藥是與CAPRIN-1具有免疫反應(yīng)性的抗體或其抗原結(jié)合片段。
【文檔編號】G01N33/577GK104471403SQ201380038351
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月19日
【發(fā)明者】井戶隆喜, 岡野文義 申請人:東麗株式會社