專利名稱：一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法
一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域，具體是一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法。肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，也是全球發(fā)病率和死亡率增加最快的腫瘤。 在全球范圍內(nèi)，肺癌在男性常見腫瘤中居首位，在女性常見腫瘤中居于二、三位。每年大概有120萬患者被診斷為肺癌，110萬人死于肺癌。肺癌依據(jù)其組織病理學可分為兩大類小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌又包含鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等。迄今為止， 全球的肺癌篩查方案尚不成熟。因此，早期篩查和診斷己經(jīng)成為肺癌防治急需解決的重大科學問題。腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)和合理應用是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)及其個體化治療的前提。目前有關肺癌的發(fā)病機制尚不清楚，研究顯示直接從蛋白質整體水平入手來研究肺癌將有可能尋找出更合適的肺癌診斷的分子標志物，為肺癌的診斷預防和治療提供依據(jù)。鈣結合蛋白為低分子量酸性蛋白，有17個家族成員。其中SlOO家族有13個。在SlOO 蛋白家族中，與腫瘤相關的有S100A2、S100A4、S100A6和S100B。最初研究認為S100A2是 SlOO蛋白家族中唯一與腫瘤生成呈負相關的蛋白，由于它在某些腫瘤組織和細胞中表達水平低或缺失，故被稱為抑癌基因。而近來也有報道在宮頸癌、胰腺癌、食管癌和肺癌中檢測到S100A2表達增高，并與腫瘤的進展和預后有關?？傊?，已知S100A2在某些腫瘤中表達有差異，其在不同腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展和轉移等作用方面也有所不同，并且目前仍存在一些爭議。因此，深入研究S100A2與肺癌發(fā)生、 發(fā)展和轉移的相關性，并揭示其臨床價值具有重要意義。本發(fā)明在前期研究基礎上開發(fā)出可供臨床應用的檢測試劑，以深入地研究和大規(guī)模驗證S100A2與肺癌的相關性，對癌癥進行診斷及為個體患者提供更好的輔助治療方法。本發(fā)明的目的是提供一種用含有S100A2的試劑盒來檢測肺癌的方法。為實現(xiàn)上述目的設計一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，包括試劑盒、S100A2蛋白，其特征在于該方法包括以下步驟(1)肺癌診斷試劑盒設有若干個容器或液態(tài)芯片和標簽，所述的容器容器或液態(tài)芯片中分別設有a、S100A2蛋白的特異性抗體；和b、PBS緩沖液pH7. 2-7. 4，或0. Olmol檸檬酸鈉緩沖液pH6. 0，或3% H202溶液，或辣根酶檢測試劑；(2)重組蛋白制備，擴增S100A2的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞；(3)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；
3
(4)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質；(5)純化的S100A2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，注射于動物體內(nèi)以誘導多克隆抗體制備的產(chǎn)生，同時特異性結合S100A2蛋白的抗體；(6)免疫組化(a)脫蠟和水化取5 μ m的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化；(b)抗原修復將切片置于IOmM pH6.0檸檬酸緩沖液(PH6.0)中，微波爐加熱15min ;(c)微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中 15min，然后用流動的水沖洗5min ;(d)將切片放置于3% H202室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；(e)切片置于1/500稀釋的S100A2兔多克隆抗體中溫育60min ； (f) 然后通過免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB( 二氨基聯(lián)苯胺)底物染色；(g)切片用蘇木精復染， 然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯，處理完的切片，鏡檢，實驗中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對照，以S100A2過表達的標本為陽性對照，最后完成檢測。重組蛋白制備S100A2的編碼序列通過RT-PCR獲得，引物分別是S100A2-F 5-GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3，和 S100A2-R :5，-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，模板用的是肺癌組織cDNA。獲得的DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/Xohl雙酶切后插入經(jīng)BamHI/ XohI雙酶切的pGEX-4T-l中，構建重組質粒pGEX-4T-l-S100A2。轉化重組質粒到BL21 (DE3) 中誘導表達，誘導表達的S100A2重組蛋白經(jīng)過純化，并通過SDS-PAGE檢測。多克隆抗體制備用生理鹽水稀釋S100A2重組蛋白，然后與弗氏不完全佐劑進行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (獲得0. 5-lml免疫前血清)， 并進行ELISA和Wfestern Blotting檢測。如果檢測為陰性或抗體效價較低，則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100-150mg抗體，最后進行ELISA和WB等質量檢測。本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比，盡管已知S100A2在某些腫瘤中表達有差異，其在不同種類腫瘤中的作用也應該是不同的。因此，本發(fā)明開發(fā)出可供臨床應用的檢測試劑，以深入地研究和大規(guī)模驗證S100A2與肺癌的相關性，對癌癥進行診斷及為個體患者提供更好的輔助治療方法。結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，這種裝置的制造技術對本專業(yè)的人來說是非常清楚的。采用比較蛋白質組學方法對肺癌細胞系/組織和正常對照細胞/組織的蛋白質表達譜進行比較分析，質譜鑒定其中部分差異蛋白質點。S100A2蛋白為其中一個差異點，即其在癌細胞中比正常細胞高表達，且可明顯區(qū)分。采用Real-time PCR(以下簡稱RT-PCR)和免疫組化的技術，分別檢測了肺癌患者及其配對的正常組織中的S100A2的mRNA和蛋白表達表達水平，發(fā)現(xiàn)S100A2在肺癌組織中表達明顯高于其配對的正常組織。該發(fā)現(xiàn)與比較蛋白質組的實驗結果一致。表明S100A2 能夠作為一種肺癌的診斷工具。因此，設計了一種試劑盒，通過S100A2抗體來檢測S100A2的存在。術語“S100A2”是鈣結合蛋白SlOO基因家族中的一員，它定位于人染色體lq21的250 300kb之間，并與S100A1，S100A3 10，S100C等SlOO基因家族成員和表皮分化基因共同位于17501Λ區(qū)域之間。目前，已經(jīng)可以通過重組DNA技術，來表達或生產(chǎn)重組S100A2蛋白。一般來說有以下步驟(1)擴增S100A2的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。純化的S100A2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可注射于動物體內(nèi)以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生，同時特異性結合S100A2蛋白的抗體，也可以是商業(yè)化的抗體。免疫組化具體包括(1)脫蠟和水化取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化。(2)抗原修復將切片置于IOmM pH6.0 檸檬酸緩沖液(PH6.0)中，微波爐加熱15min。(3)微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中15min，然后用流動的水沖洗5min。(4)將切片放置于3% H2O2室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。(5)切片置于1/500稀釋的S100A2兔多克隆抗體中溫育60min。 (6)然后通過免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB (二氨基聯(lián)苯胺)底物染色。(7)切片用蘇木精復染，然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯。處理完的切片，鏡檢。實驗中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對照，以S100A2過表達的標本為陽性對照。實施例重組蛋白制備S100A2的編碼序列通過RT-PCR獲得，引物分別是S100A2-F 5' -GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3' ^PSlOOAZ-Rj' -CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，模板用的是肺癌組織cDNA。獲得的DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/Xohl雙酶切后插入經(jīng) BamHI/XohI雙酶切的pGEX_4T_l中，構建重組質粒pGEX-4T-l_S100A2。轉化重組質粒到 BL21 (DE3)中誘導表達，誘導表達的S100A2重組蛋白經(jīng)過純化，并通過SDS-PAGE檢測。多克隆抗體的制備免疫用生理鹽水稀釋S100A2重組蛋白，然后與弗氏不完全佐劑進行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (獲得0. 5-lml免疫前血清)，并進行ELISA和Western Blotting檢測。如果檢測為陰性或抗體效價較低， 則需要再次免疫。共免疫4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得 100-150mg抗體，最后進行ELISA和WB等質量檢測。免疫組化收集肺癌患者及其配對的正常組織切片各20例。(1)脫蠟和水化取 5ym的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化。 (2)抗原修復將切片置于IOmM pH6. 0檸檬酸緩沖液(pH6. 0)中，微波爐加熱15min。(3) 微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中15min，然后用流動的水沖洗5min。(4)將切片放置于3% H2O2室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。(5)切片置于1/500稀釋的S100A2兔多克隆抗體中溫育60min。(6)然后通過免疫組化辣根酶系統(tǒng)的DAB ( 二氨基聯(lián)苯胺)底物染色。(7)切片用蘇木精復染，然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯。處理完的切片，鏡檢。實驗中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對照，以S100A2過表達的標本為陽性對照。結果，肺癌患者中16例均有不同程度高表達，而正常組織中未見高表達。因此，S100A2高表達與肺癌有緊密的相關性，可供臨床對癌癥進行診斷及為個體患者提供更好的輔助治療的有效方法。
權利要求
1.一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，包括試劑盒、S100A2蛋白，其特征在于該方法包括以下步驟(1)肺癌診斷試劑盒設有若干個容器或液態(tài)芯片和標簽，所述的容器容器或液態(tài)芯片中分別設有a、S100A2蛋白的特異性抗體；和b、PBS緩沖液pH7.2-7. 4，或0. Olmol檸檬酸鈉緩沖液pH6. 0，或3% H202溶液，或辣根酶檢測試劑；(2)重組蛋白制備，擴增S100A2的核苷酸序列，或用含有該核苷的重組表達載體轉化或轉導至合適的宿主細胞；(3)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(4)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質；(5)純化的S100A2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，注射于動物體內(nèi)以誘導多克隆抗體制備的產(chǎn)生，同時特異性結合S100A2蛋白的抗體；(6)免疫組化(a)脫蠟和水化取5μπι的石蠟切片于二甲苯中30min，脫蠟；然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至水化；(b)抗原修復將切片置于IOmM pH6. 0檸檬酸緩沖液 (ρΗ6· 0)中，微波爐加熱15min ；(c)微波處理后的切片仍置于檸檬酸緩沖液中15min，然后用流動的水沖洗5min;(d) 將切片放置于3% H202室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；(e)切片置于 1/500稀釋的S100A2兔多克隆抗體中溫育60min ； (f)然后通過免疫組化辣根酶系統(tǒng)的 DAB(二氨基聯(lián)苯胺)底物染色；(g)切片用蘇木精復染，然后通過一系列不同級別的乙醇浸泡至二甲苯，處理完的切片，鏡檢，實驗中以水或緩沖液代替多克隆抗體做陰性對照，以 S100A2過表達的標本為陽性對照，最后完成檢測。
2.如權利要求1所述的一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，其特征在于重組蛋白制備S100A2的編碼序列通過RT-PCR獲得，引物分別是S100A2_F :5_GGATCC GAACTTCTGCACAAGG-3，和 S100A2-R :5，-CCGCTCGAGAAAGGCATCAACAGTC-3，，模板用的是肺癌組織cDNA。獲得的DNA片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/Xohl雙酶切后插入經(jīng)BamHI/Xohl雙酶切的PGEX-4T-1中，構建重組質粒pGEX-4T-l-S100A2。轉化重組質粒到BL21 (DE3)中誘導表達，誘導表達的S100A2重組蛋白經(jīng)過純化，并通過SDS-PAGE檢測。
3.如權利要求1所述的一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，其特征在于多克隆抗體制備用生理鹽水稀釋S100A2重組蛋白，然后與弗氏不完全佐劑進行等比混合，吹打至抗原和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每次免疫前采血2ml (獲得0. 5-lml免疫前血清)，并進行ELISA 和Wfestern Blotting檢測。如果檢測為陰性或抗體效價較低，則需要再次免疫。共免疫 4次，末次放血20-30ml，純化混合血樣，平均每次純化可以獲得100_150mg抗體，最后進行 ELISA和WB等質量檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域，具體是一種有關肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，通過基因重組技術純化生產(chǎn)S100A2蛋白，純化的S100A2蛋白，注射于動物體內(nèi)以誘導產(chǎn)生特異性結合S100A2蛋白的多克隆抗體，另一方面方面，提供了一種肺癌的診斷試劑盒，該試劑盒含有容器，容器中含有S100A2蛋白；以及標簽，所述標簽說明所述試劑盒用于診斷肺癌。還含有抗S100A2蛋白的特異性抗體。試劑盒中或含有免疫組化相關試劑PBS緩沖液，或0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液，或3％H2O2溶液，或辣根酶檢測試劑，本發(fā)明深入地研究和大規(guī)模驗證S100A2與肺癌的相關性，研究出可供臨床應用的檢測試劑，對肺癌進行診斷及為患者提供個體化輔助治療方法。
文檔編號C07K16/06GK102520174SQ20111032829
公開日2012年6月27日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權日2011年10月25日
發(fā)明者孫戰(zhàn)強, 張舒林, 沈建國 申請人:孫戰(zhàn)強, 張舒林, 沈建國