大豆過氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大豆過氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用。第一步，大豆蛋白酶標(biāo)抗體的制備；第二步，玻片的修飾：玻片表面的羥基化、氨基硅烷化、醛基化；第三步，夾心免疫模型在生物芯片表面的構(gòu)建：在玻片表面包被抗體；封閉非特異性活性位點(diǎn)；加入待測(cè)血清，孵育、洗滌；加入酶標(biāo)抗體，孵育、洗滌；加入發(fā)光底物，CCD成像采集發(fā)光信號(hào)。選取了AFP、HCG、uE3、PAPP-A四項(xiàng)指標(biāo)作為唐氏綜合癥血清學(xué)標(biāo)志物。SBP具有底物作用范圍廣，耐熱性能高，酸堿穩(wěn)定性好，pH適用范圍寬。在Luminol-H2O2體系中，當(dāng)加入增強(qiáng)劑化學(xué)發(fā)光信號(hào)可放大近百倍，檢測(cè)靈敏度得到增強(qiáng)。
【專利說明】大豆過氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及生物芯片技術(shù)在產(chǎn)前唐氏綜合癥篩查中的應(yīng)用以及使用了新型的標(biāo)記酶(SBP)和超高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)正朝著標(biāo)準(zhǔn)化、智能化、集約化方向發(fā)展。生物芯片技術(shù)是這一趨勢(shì)的引領(lǐng)者，它是一種通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、抗原、抗體等生物樣品有序地固化于玻片、硅片、玻璃片、塑料片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)表面，組成密集二維的分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效檢測(cè)分析的技術(shù)。它能微型化、高能量、低成本地在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測(cè)手段的成百上千倍，解決了人們用I份血樣檢測(cè)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)功能狀態(tài)的需求。目前蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、微電極陣列芯片技術(shù)、液相芯片技術(shù)是比較成熟的生物芯片技術(shù)已逐步應(yīng)用于臨床。
[0003]出生缺陷是指胚胎或胎兒發(fā)育過程中結(jié)構(gòu)或代謝發(fā)生異常，出生時(shí)即可發(fā)現(xiàn)，也可在出生后數(shù)月或數(shù)年才發(fā)現(xiàn)。出生缺陷以及由此帶來的殘疾，給家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)，成為影響人口素質(zhì)的重要問題。我國(guó)出生缺陷的現(xiàn)狀已經(jīng)不僅僅是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，而且成為影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們正常生活的社會(huì)問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)2009年出生缺陷總發(fā)生率為128.38/萬，每年僅肉眼可見的出生缺陷就有20萬至30多萬，加上出生后數(shù)月和數(shù)年才顯現(xiàn)出來的缺陷，每年則高達(dá)80萬至120萬，約占每年大約2000萬個(gè)新生兒的4% — 6%。目前，最常見的遺傳性或部分遺傳性缺陷主要有:先天性心臟病、神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合征、腦積水等等，由此可見，目前的唐氏篩查方法對(duì)胎兒先天缺陷的預(yù)測(cè)，具有一定的局限性，并不完全排除異常的可能性，因此需要開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)，提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0004]產(chǎn)前篩查技術(shù)通過分析孕期的某些篩查標(biāo)志物，對(duì)宮內(nèi)的胎兒進(jìn)行評(píng)估，目的是為了在胎兒出生前發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致出生缺陷的疾病。其基本方法就是在準(zhǔn)確記錄孕婦相關(guān)資料的基礎(chǔ)上，監(jiān)測(cè)各項(xiàng)標(biāo)記物水平，然后通過專業(yè)分析軟件，計(jì)算胎兒罹患疾病的風(fēng)險(xiǎn)值。風(fēng)險(xiǎn)值高者即意味著該疾病的發(fā)生幾率大，需建議孕婦接受進(jìn)一步的遺傳咨詢，以決定是否進(jìn)行產(chǎn)前診斷和相應(yīng)的處理。所謂標(biāo)記物是指用于區(qū)分正常和非正常情況下的生化指標(biāo)或其他測(cè)量指標(biāo)，這些篩查標(biāo)志物可以來源于母體血液，包括一些血清學(xué)指標(biāo)(如糖蛋白、甾體激素、特異性抗體)、胎兒游離DNA、胎兒有核紅細(xì)胞等；或是超聲檢查的一些胎兒形態(tài)學(xué)指標(biāo)、。經(jīng)過多年的研究與實(shí)踐，這一技術(shù)日趨成熟，在國(guó)內(nèi)外產(chǎn)前篩查臨床工作中得到廣泛應(yīng)用，在很多發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家，均作為必不可少的二級(jí)預(yù)防措施進(jìn)行推廣。
[0005]國(guó)外對(duì)唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查最早開始于上世紀(jì)80年代，英國(guó)學(xué)者在產(chǎn)前神經(jīng)管缺陷(NTD)篩查母血甲胎蛋白(AFP)的過程中發(fā)現(xiàn)懷有唐氏綜合征的胎兒的孕婦血清AFP濃度下降，隨后相繼找到了與唐氏綜合征胎兒胎兒相關(guān)的孕中期標(biāo)志物，這些標(biāo)志物基本都由胎兒及胎兒附屬物分泌合成。目前唐氏篩查常用的血清學(xué)篩查標(biāo)志物包括甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、游離雌三醇(uE3)、妊娠相關(guān)蛋白A(PAPP-A)抑制素-A(INH — A)等。不同的孕周，正常胎兒與唐氏綜合征或者18-三體胎兒的檢測(cè)值是不同的，其中以AFP、HCG和uE3結(jié)合的孕中期“三聯(lián)篩查”最出名，應(yīng)用最廣泛，此后許多方案都是以該方案為基礎(chǔ)進(jìn)行改良或組合的。
[0006]目前篩查標(biāo)記物的常用檢測(cè)方法主要:時(shí)間熒光分辨法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法和膠體金固相免疫層析技術(shù)。這些方法已經(jīng)在臨床中得到很好的應(yīng)用，并收到了預(yù)期的效果。但由于方法本身的限制以及生物樣品的多樣化，導(dǎo)致假陽性和漏檢增加。因此尋找新的特異性篩查標(biāo)志物、開發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)、實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化程度高的多標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，以提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性，將是對(duì)產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的重大創(chuàng)新，有助于產(chǎn)前篩查技術(shù)達(dá)到方便快捷、成本低廉、準(zhǔn)確可靠的目標(biāo)，對(duì)有效預(yù)防出生缺陷具有重要的意義。[0007]隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，生物芯片技術(shù)作為新一代生物技術(shù)，以并其高通量并行分析的優(yōu)勢(shì)引起國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注，生物芯片技術(shù)是通過縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。生物芯片技術(shù)目前在藥物開發(fā)、篩選和監(jiān)測(cè)、基因測(cè)序、疾病診斷等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。雖然將生物芯片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查領(lǐng)域的研究，在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，但是診斷類生物芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，已有很多成功經(jīng)驗(yàn)可供借鑒。例如目前已獲得新藥證書和試生產(chǎn)批文的“多腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片診斷系統(tǒng)”，在一張芯片上可同時(shí)進(jìn)行12種腫瘤標(biāo)志物(其中包括AFP、β-HCG)的定量檢測(cè)，其臨床應(yīng)用價(jià)值在多項(xiàng)臨床研究中得到了
冃疋?

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服常用篩查標(biāo)記物的檢測(cè)方法本身的限制以及生物樣品的多樣化，導(dǎo)致假陽性和漏檢增加等缺點(diǎn)，本發(fā)明公開了大豆過氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，對(duì)于降低產(chǎn)前篩查檢測(cè)費(fèi)用、提高群體的篩查普及率，將具有重要的意義。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種大豆過氧化物酶免疫生物芯片，包括酶標(biāo)抗體、生物芯片底板、發(fā)光底物，所述的酶標(biāo)抗體為大豆蛋白酶標(biāo)抗體；所述的生物芯片底板是基于夾心免疫模型將與酶標(biāo)抗體對(duì)應(yīng)的抗體包被在生物芯片底板表面，然后再封閉非特異性活性位點(diǎn)得到；所述的發(fā)光底物為優(yōu)化的魯米諾-H2O2溶液和增強(qiáng)劑MORPH、SPTZ組成。
[0010]所述的生物芯片底板為經(jīng)過羥基化、氨基硅烷化和醛基化處理的玻片。
[0011]所述的酶標(biāo)抗體分別偶聯(lián)AFP、HCG、uE3和PAPP - A四種抗體。
[0012]應(yīng)用所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片的檢測(cè)方法，步驟為:
[0013]第一步，大豆蛋白酶標(biāo)抗體的制備:采用改良過碘酸鈉法制備；
[0014]第二步，玻片的修飾:玻片表面的羥基化、氨基硅烷化、醛基化；
[0015]第三步，夾心免疫模型在生物芯片表面的構(gòu)建:在玻片表面包被抗體，所述的抗體與酶標(biāo)抗體的一致；封閉非特異性活性位點(diǎn)；加入待測(cè)血清，孵育、洗滌；加入酶標(biāo)抗體，孵育、洗滌；加入發(fā)光底物，CCD成像采集發(fā)光信號(hào)。
[0016]所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片在制備唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)設(shè)備中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的原理:
[0018]I)酶標(biāo)抗體的制備:合成具有高特異性和高酶活力的酶標(biāo)抗體，利用生物偶聯(lián)技術(shù)將測(cè)定抗體(多克隆抗體)與酶的共價(jià)連接，優(yōu)化抗體及酶的偶聯(lián)條件，獲得最佳品質(zhì)的酶標(biāo)抗體。
[0019]2)唐氏綜合征血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)新方法:利用納米材料或聚合物膜技術(shù)，在96全黑孔板或鍍黑玻片表面固載捕捉抗體，通過夾心免疫方法將待測(cè)目標(biāo)物和酶標(biāo)抗體捕捉到96孔板內(nèi)或玻片表面，利用酶聯(lián)免疫法或化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)物的濃度，并與相應(yīng)的ELISA方法檢測(cè)結(jié)果相比較，從方法的敏感度、特異性、可靠性、準(zhǔn)確性和方便性等多方面評(píng)價(jià)，確定最佳檢測(cè)方法，制定目標(biāo)分子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
[0020]3)篩查標(biāo)志物組合芯片:將上述單一標(biāo)志物檢測(cè)組合在同一芯片，依據(jù)納米生物探針不同抗體與酶標(biāo)記，以及不同的底物，利用CCD成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多組分酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法同時(shí)檢測(cè)的信號(hào)分辨，研究其信號(hào)交聯(lián)響應(yīng)、特異性和敏感度，構(gòu)建唐氏綜合癥血清學(xué)標(biāo)志物多組分同時(shí)檢測(cè)芯片。
[0021]4)母體血液中唐氏綜合癥血清學(xué)標(biāo)志物芯片檢測(cè)及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估:利用上述組合芯片，對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將芯片檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，研究其相關(guān)性、差異性、一致性等指標(biāo)，研究評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果用于出生缺陷疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的效果。
[0022]有益效果:
[0023]I)基于夾心免疫模型，分別捕獲血清中待測(cè)抗原和酶(SBP)標(biāo)抗體于芯片表面，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)信號(hào)放大效應(yīng)，CCD采集發(fā)光信號(hào)。并將這一化學(xué)發(fā)光酶免疫診斷技術(shù)應(yīng)用于唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)中。
[0024]2)大豆過氧化物酶SBP代替辣根過氧化物酶HRP，而且利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，一方面，SBP底物作用范圍廣，耐熱性能高，酸堿穩(wěn)定性好，pH適用范圍寬等優(yōu)點(diǎn)；另一方面，增強(qiáng)劑SPTZ和MORPH的存在下，在SBP存在下，增強(qiáng)劑可使得Luminol-H2O2這一發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度可增強(qiáng)近百倍，檢測(cè)靈敏度大大提高?？梢杂行Э朔备^氧化物酶標(biāo)記獲得的發(fā)光信號(hào)弱，即使加入了增強(qiáng)劑對(duì)碘苯酚(PIP)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)能夠放大，但是衰減迅速的缺點(diǎn)。
[0025]3)通過組合芯片技術(shù)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前篩查方案中多個(gè)篩查標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)，是該領(lǐng)域的一大創(chuàng)新構(gòu)思。使用酶免疫生物芯片技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。
[0026]4)通過評(píng)價(jià)芯片檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)方法的一致性，分析檢測(cè)結(jié)果用于產(chǎn)前篩查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的效果，探索將芯片檢測(cè)結(jié)果直接應(yīng)用于現(xiàn)有產(chǎn)前篩查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)的可行性及解決方案。
[0027]5)開發(fā)的多篩查標(biāo)志物芯片檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低廉，因此本項(xiàng)目的成果有可能應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。[0028]6)本發(fā)明選定的生物標(biāo)志物是:選取了甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、游離雌三醇UE3)、妊娠相關(guān)蛋白A(PAPP-A)等四項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)于一個(gè)孕婦的血樣，在同一塊芯片上實(shí)現(xiàn)“四聯(lián)篩查”。這一生物芯片技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，將會(huì)給唐氏綜合癥的篩查和預(yù)防帶來新發(fā)展，提高產(chǎn)前篩查覆蓋率，增加出生缺陷二級(jí)干預(yù)措施的受益人群，有利于產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展，有利于降低人口出生缺陷率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明的檢測(cè)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明所用的大豆蛋白酶采購(gòu)自美國(guó)Bio-Research Products公司，本發(fā)明所用的 MORPH 和 SPTZ 均采購(gòu)自 Sigma Aldrich。
[0031]應(yīng)用所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片的檢測(cè)方法，步驟為:
[0032]第一步，大豆蛋白酶標(biāo)抗體的制備:采用改良過碘酸鈉法制備；
[0033]第二步，玻片的修飾:玻片表面的羥基化、氨基硅烷化、醛基化；
[0034]第三步，夾心免疫模型在生物芯片表面的構(gòu)建:在玻片表面包被抗體，所述的抗體與酶標(biāo)抗體的一致；封閉非特異性活性位點(diǎn)；加入待測(cè)血清，孵育、洗滌；加入酶標(biāo)抗體，孵育、洗滌；加入發(fā)光底物，CCD成像采集發(fā)光信號(hào)。
[0035]1、大豆蛋白酶標(biāo)抗體制備
[0036]SBP分別偶聯(lián)人絨毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇UE3)和妊娠相關(guān)蛋白A (PAPP-A)四種抗體分子，采用目前廣泛采用的高碘酸鈉氧化法。即采用改良過碘酸鈉法分別制備四種酶標(biāo)抗體。改良過碘酸鈉法具體為:
[0037]步驟一、取Img大豆過氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入新配制的12.8mg/mLNaIO4溶液50 μ L，混勻，置室溫15min ；
[0038]步驟二、取出步驟一得到的溶液，后加入9μ L/mL乙二醇PBS溶液50μ L，室溫放置30min ；
[0039]步驟三、向步驟二得到的溶液中加入含2mg純化的抗體，混勻，并裝入透析袋，于50mM pH9.6碳酸鹽緩沖液4°C透析18h,使大豆過氧化物酶和抗體結(jié)合；
[0040]步驟四、向步驟三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混勻，置4°C還原2h ；
[0041]步驟五、緩慢加入和步驟四得到的溶液等體積的飽和硫酸銨溶液，輕搖鹽析0.5h，轉(zhuǎn)速132000g離心15min，去上清，沉淀以少許PBS溶解，裝入透析袋，于大量PBS中4°C透析過夜；
[0042]步驟六、次日取出離心，以除去不溶物，上層清夜即得大豆過氧化物酶-抗體結(jié)合物，以PBS加至500yL;
[0043]步驟七、效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量甘油，分裝小瓶，低溫保存。
[0044]2、玻片的修飾
[0045]I)玻片表面的羥基化:取玻片，放入按體積計(jì)由1/3H202和2/3濃H2SO4組成的溶液中，浸泡lh，然后用二次蒸餾水沖洗3遍，再用二次蒸餾水煮沸l(wèi)Omin，在凡流下干燥，于干燥處保存?zhèn)溆谩?br> [0046]2)玻片表面的氨基硅烷化:將上述玻片浸入含有2%wt的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTEOS)的95%wt乙醇/水的溶液lOmin，取出后，玻片用乙醇洗3遍，每次lmin，再用二次水沖洗3遍，每次lmin，最后在110°C條件下烘干，置于干燥處保存。
[0047]3)玻片表面的醛基化:將上述硅烷化后的玻片放入含5%wt戊二醛的磷酸鹽(0.0lM, pH7.4PBS)中，室溫浸泡4h，取出PBS洗滌三次，再用二次水沖洗3遍，用N2吹干，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0048]3、夾心免疫模型在生物芯片表面的構(gòu)建
[0049]1、四種抗體 Abl (HCG/AFP/uE3/PAPP-A)在玻片表面的包被:將 5μ LlOy g/mL(IOmM pH7.4PBS)的Abl分別滴加到上述修飾玻片表面(修飾的玻片附刻有圓孔的膜，規(guī)定反應(yīng)區(qū))，4°C過夜孵育，PBS充分洗滌，N2吹干，4°C保存。
[0050]2、封閉非特異性活性位點(diǎn):用5 μ L2%BSA (IOmM pH7.4PBS)滴加于固定有Abl的玻片表面，室溫封閉2h。PBS洗滌三次，N2吹干，4 °C保存。
[0051]3、待測(cè)血清的檢測(cè):將5 μ L待測(cè)血清加入上述封閉好的玻片上，室溫孵育lh，PBS徹底洗滌。
[0052]4、酶標(biāo)抗體的捕獲:加入5 μ L 一定稀釋比的酶標(biāo)抗體于上述玻片上，室溫孵育Ih，PBS徹底洗滌。
[0053]5、加入發(fā)光底物，C⑶成像采集發(fā)光信號(hào):各孔中同時(shí)加入條件優(yōu)化過的新混合的 0.4mM Luminol,0.4mM H2O2,0.6mM MORPH, 1.2mM SPTZ，立即采集各孔的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。因每一孔對(duì)應(yīng)的是血清檢驗(yàn)中的四個(gè)指標(biāo)，因而，一步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前唐氏綜合癥的篩選的四聯(lián)篩查。經(jīng)優(yōu)化后化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)近兩個(gè)數(shù)量級(jí)，由原先的3.5X IO5提高到1.4X 107。
【權(quán)利要求】
1.一種大豆過氧化物酶免疫生物芯片，包括酶標(biāo)抗體、生物芯片底板、發(fā)光底物，其特征在于，所述的酶標(biāo)抗體為大豆蛋白酶標(biāo)抗體；所述的生物芯片底板是基于夾心免疫模型將與酶標(biāo)抗體對(duì)應(yīng)的抗體包被在生物芯片底板表面，然后再封閉非特異性活性位點(diǎn)得到；所述的發(fā)光底物為優(yōu)化的魯米諾-H2O2溶液和增強(qiáng)劑MORPH、SPTZ組成。
2.如權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片，其特征在于，所述的生物芯片底板為經(jīng)過羥基化、氨基硅烷化和醛基化處理的玻片。
3.如權(quán)利要求1所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片，其特征在于，所述的酶標(biāo)抗體分別偶聯(lián)AFP、HCG、uE3和抑制素-A四種抗體。
4.應(yīng)用權(quán)利要求1~3任一所述的大豆過氧化物酶免疫生物芯片的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟為: 第一步，大豆蛋白酶標(biāo)抗體的制備:采用改良過碘酸鈉法制備； 第二步，玻片的修飾:玻片表面的羥基化、氨基硅烷化、醛基化； 第三步，夾心免疫模型在生物芯片表面的構(gòu)建:在玻片表面包被抗體，所述的抗體與酶標(biāo)抗體的一致；封閉非特異性活性位點(diǎn)；加入待測(cè)血清，孵育、洗滌；加入酶標(biāo)抗體，孵育、洗滌；加入發(fā)光底物，CCD成像采集發(fā)光信號(hào)。
5.權(quán)利要求1~3任一所述 的大豆過氧化物酶免疫生物芯片在制備唐氏綜合癥產(chǎn)前篩查血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)設(shè)備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK103901217SQ201410108570
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】薛艷春, 蘇娟, 車彥軍, 王建江, 毛世琴, 朱偉, 田亦平, 蔣鐫, 翟麗芬, 陶嵐, 劉松琴, 沈麗, 吳慧萍 申請(qǐng)人:靖江市人民醫(yī)院, 東南大學(xué)