專利名稱：大豆脲酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼大豆(Glycinemax)脲酶(soybean Uricase，簡稱為sUricase)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的蛋白。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和蛋白的用途和制備。
背景技術(shù)：
脲酶是一種可將脲酸分解成可溶性尿囊素的生化酶，其催化的反應(yīng)如下
在自然情況下，正常人血中含有40～60mg/L的脲酸，三分之一來自飲食，三分之二來自身體的新陳代謝，正常人的尿酸可經(jīng)由腎臟排泄和腸內(nèi)細菌分解代謝排除。若代謝失常，會使血中脲酸量超過100mg/L，脲酸鹽就會在關(guān)節(jié)出沉積而引起痛風(fēng)。
痛風(fēng)是一種古老的疾病，民間又稱富貴病，今年來隨著生活水平的提高和生活方式的改變，通風(fēng)的發(fā)病率在全世界有普遍攀升的趨勢，在中國更是劇增且呈年輕化趨勢，以往患者以五、六十歲居多，現(xiàn)在則以四十歲左右的青壯年占最大群。目前雖有秋水仙素或類固醇類藥物，但副作用大，且有部分病人對現(xiàn)有藥物沒有反應(yīng)。
另一種脲酸過高的情況出現(xiàn)在癌癥化療病人中。化療經(jīng)常導(dǎo)致的一個嚴重副作用即腫瘤裂解癥，當(dāng)腫瘤細胞被化療藥物殺死時，腫瘤細胞內(nèi)大量尿酸釋放，血中尿酸濃度增高，腎臟負荷過重，大量尿酸結(jié)晶，最終導(dǎo)致腎衰竭。淋巴瘤和白血病人多發(fā)腫瘤裂解癥，青少年患者中又為多見，乳腺癌和肺癌病人中也常發(fā)生。
針對以上兩種尿酸過高引起的疾病，脲酶的作用是十分肯定的。早在1975年法國就開始在臨床上常規(guī)使用天然脲酶以控制淋巴瘤和白血病治療中的腫瘤裂解癥，效果良好。但天然酶在部分病人中易引起過敏反應(yīng)，且酶的提取純化困難，因此重組型的脲酶(Rasburicase)即被開發(fā)。Rasburicase毒性較天然酶更有改善，療效顯著，故在2001年批準在法國上市，并于2002年七月通過美國FDA批準在美國上市。
更新一代的脲酶將是用PEG修飾的重組型脲酶。美國Duke大學(xué)與MountainView Pharmacutical公司聯(lián)合開發(fā)了PEG-Uricase(命名為Puricase)，利用動物細胞來源的脲酶，經(jīng)PEG化學(xué)偶聯(lián)，具有更安全更長效的優(yōu)點(WO 00/08196)。Puricase的開發(fā)目前由Savient Pharmaceutical公司進行，03年底已成功完成一期臨床，藥效明顯，安全性好，目前正在進行二期臨床，并被FDA批準為痛風(fēng)治療的孤兒藥。
然而，目前的脲酶產(chǎn)品開發(fā)進展還遠遠不能滿足需要，基于以往脲酶產(chǎn)品療效好但免疫毒性過強的不足之處，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的脲酶來源并對其進行優(yōu)化改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的大豆脲酶sUricase蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些蛋白的方法以及該蛋白和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的大豆脲酶sUricase蛋白，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化尿酸形成尿囊素的功能的由(a)衍生的蛋白。
更佳地，該蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些蛋白的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性；(a)編碼上述sUricase蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中38-964位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1007位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有sUricase蛋白活性的蛋白的方法，該方法包含(a)在適合表達sUricase蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有sUricase蛋白活性的蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的sUricase蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗sUricase蛋白活性的化合物，以及抑制sUricase蛋白的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是sUricase蛋白的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在sUricase蛋白的方法，它包括將樣品與sUricase蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在sUricase蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種降解尿酸的組合物，它含有有效量的本發(fā)明上述的sUricase蛋白以及可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，該組合物是藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的sUricase蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。更佳地，所述的sUricase蛋白是與PEG等形成的偶聯(lián)物。這些藥物組合物可治療痛風(fēng)和腫瘤裂解癥等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了pET25b/uricase的酶切鑒定圖(1％瓊脂糖凝膠)。泳道MDNA標(biāo)準；泳道1和2兩個克隆的酶切鑒定。質(zhì)粒DNA用Nde1/EcorI切后得到將近1Kb的插入片段。
圖2顯示了脲酶的誘導(dǎo)表達結(jié)果(15％SDS-PAGE)。其中各泳道如下泳道M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準；泳道1包涵體，37℃誘導(dǎo)；泳道2胞內(nèi)可溶上清，37℃誘導(dǎo)；泳道3誘導(dǎo)前，37℃；
泳道4包涵體，22℃誘導(dǎo)；泳道5胞內(nèi)可溶上清，22℃誘導(dǎo)；泳道6誘導(dǎo)前，22℃。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次從大豆中分離出了一種大豆脲酶sUricase，并試驗證明了該大豆脲酶具有很高的酶活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“sUricase蛋白”、“sUricase多肽”或“大豆脲酶sUricase”可互換使用，都指具有大豆脲酶sUricase氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的大豆脲酶sUricase。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的sUricase蛋白或多肽”是指sUricase多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化sUricase蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。sUricase多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括sUricase蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然sUricase蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“sUricase多肽”指具有sUricase蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與sUricase蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括sUricase蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與sUricase DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗sUricase多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含sUricase多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了sUricase多肽的可溶性片段。通常，該片段具有sUricase多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供sUricase蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然sUricase多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“sUricase蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼sUricase蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的sUricase核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或sUricase蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的sUricase多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼sUricase多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，sUricase多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含sUricase編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的sUricase蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療sUricase蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或?qū)箂Uricase蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組sUricase蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激sUricase蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對sUricase DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于sUricase基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與sUricase基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制sUricase蛋白的分子，也包括那些并不影響sUricase蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的sUricase基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的sUricase基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達sUricase蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷sUricase蛋白功能的抗體以及不影響sUricase蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用sUricase基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與sUricase基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗sUricase蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的sUricase蛋白。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用sUricase蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與sUricase蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于痛風(fēng)方面的治療。在使用本發(fā)明sUricase蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如秋水仙素或類固醇類等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明sUricase多肽以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。一種優(yōu)選的sUricase多肽是偶聯(lián)物形式的多肽，例如與可降低脲酶的免疫原性并增長半衰期的不同分子量的PEG所形成的偶聯(lián)物。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的sUricase蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
能與sUricase蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對sUricase蛋白分子進行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測sUricase蛋白水平的方法。這些方法是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。一種檢測檢測樣品中是否存在sUricase蛋白的方法是利用sUricase蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與sUricase蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在sUricase蛋白。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從大豆中分離出的。其序列如SEQID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1007個堿基，其開放讀框位于38-964位，編碼全長為309個氨基酸的sUricase蛋白(SEQ ID NO2)。本發(fā)明的大豆脲酶的核酸與蛋白序列與其他的脲酶完全不同。經(jīng)PEG偶聯(lián)后，本發(fā)明脲酶將同時具有毒性低，酶活高，半衰期長的優(yōu)點，可應(yīng)用于腫瘤裂解癥和痛風(fēng)，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1脲酶sUricase的克隆和表達從大豆根瘤中提取總RNA，RNA的提取用Trizol試劑盒(購自invitrogen公司)。
用上述抽提的RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR以獲得脲酶基因，方法如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中以隨機引物為引物，用SuperScript II RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再用特異引物(SEQ ID NO3和4)及platinumTaq DNA polymerase High Fidelity(購自Invitrogen公司)擴增脲酶基因。
引物15’-gactcatatggctaagcaggaagtgg-3’(SEQ ID NO3)引物25’-gactgaattcctacagctttgaccaaagg-3’(SEQ ID NO4)
用Nde1和EcoRI酶切上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET25b(購自Novagen公司)，然后連接，獲得質(zhì)粒pET25b-sUricase、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒、經(jīng)酶切鑒定得到正確構(gòu)建的含脲酶基因的表達質(zhì)粒(見圖1)。對插入片段進行DNA測序，獲得sUricase的核苷酸序列。
sUricase cDNA為1007bp(SEQ ID NO1)，含有完整的開放性讀框(38-964位)，編碼含309氨基酸殘基的多肽(SEQ ID NO2)。
實施例2sUricase蛋白重組表達將實施例1中制備的質(zhì)粒pET25b-sUricase轉(zhuǎn)入常規(guī)的大腸桿菌BL21菌，挑表達sUricase的陽性BL21克隆接種于10ml LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶100稀釋于預(yù)熱的LB培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2.5hr，加IPTG至終濃度0.1mM后30℃誘導(dǎo)2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，經(jīng)離子交換和分子篩純化得到sUricase。
結(jié)果如圖2所示，在30KD左右的有一蛋白表達帶。為增加表達蛋白中的可溶部分，對誘導(dǎo)溫度進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在26℃誘導(dǎo)時可溶部分可占一半左右(圖2)。
實施例3抗sUricase蛋白抗體的產(chǎn)生將實施例2中獲得的重組sUricase蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀sUricase蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制備的抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
實施例4
酶活測定在293nm處監(jiān)測尿酸吸光度的最大變化率，每隔20～30s記錄一個數(shù)據(jù)。反應(yīng)體系如下PBS(pH7.4)，適當(dāng)體積(40～80μl)粗酶溶液，尿酸終濃度0.13mmol/l，總體積3ml。
a.計算酶活酶活定義1分鐘內(nèi)催化尿酸為尿囊素的微摩爾數(shù) C.測定結(jié)果，本發(fā)明的sUricase脲酶比活大于10U/ml。
實施例5PEG化的大豆脲酶按WO00/08196中實施例3中所述的方法制備PEG化的大豆脲酶，純化的脲酶溶解于200mM磷酸鈉緩沖液中(PH8.5)，用PEG20,000進行偶聯(lián)，將PEG20,000與脲酶以30∶1(wt/wt)的比例混合，室溫攪拌2小時，通過切向流滲透將未偶聯(lián)的PEG去除，所得PEG-Uricase可在4℃穩(wěn)定保存，并在實施例4相同方法測定其酶活。
結(jié)果表明，與實施例4相比，PEG化的大豆脲酶保留了80％的酶活性。
實施例6降解尿酸的組合物用常規(guī)的混合法，將1mg PEG-sUricase(實施例5制備)與10.5mg甘露醇，15.9mg L-丙氨酸，12.6mg Na2HPO4配制成單元制劑，經(jīng)冰凍干燥以干粉形式保存，用1ml無菌水重組后可被用作靜脈注射劑。
用常規(guī)的混合法，將1mg sUricase蛋白(實施例2制備)與10.5mg甘露醇，15.9mg L-丙氨酸，12.6mg Na2HPO4配制成單元制劑，經(jīng)冰凍干燥以干粉形式保存，用1ml無菌水重組后可被用作靜脈注射劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
文獻1.JOHN S.BOMALASKI，F(xiàn)REDERICK W.HOLTSBERG，C.MARK ENSOR，and MIKEA.CLARK.Uricase Formulated with Polyethylene Glycol(Uricase-PEG20)Biochemical Rationale and Preclinical Studies.The Journal of Rheumatology2002；2992.M..Ben Hmida，J.Hachicha，Z.Bahloul，N.Kaddour，M.Kharrat，F(xiàn).Jarraya，and A.Jarraya.Cycolsporine-Induced Hyperuricemia and Gout inRenal Transplants.Transplantation Proceedings，Vol 27，No 5(October)，1995pp2722-27243.John D.Conger，MD.Acute Uric Acid Nephropathy.Medical Clinics ofNoth America-Vol.74，No.4，July 1990.
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序列表<110>上海單抗制藥技術(shù)有限公司<120>大豆脲酶及其應(yīng)用<130>042142<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1007<212>DNA<213>大豆(Glycine max)<220>
<221>CDS<222>(38)..(964)<223>
<400>1aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacat atg gct aag cag gaa gtg55Met Ala Lys Gln Glu Val1 5gtg gaa ggg ttc aag ttc gag cag agg cac ggg aaa gaa cgc gtg aga103Val Glu Gly Phe Lys Phe Glu Gln Arg His Gly Lys Glu Arg Val Arg10 15 20gtg gcg cgc gtg tgg aag acg agg cag ggg cag cac ttc att gtg gag151Val Ala Arg Val Trp Lys Thr Arg Gln Gly Gln His Phe Ile Val Glu25 30 35tgg cgc gtg ggg atc act ctc ttt tcg gat tgc gtc aac tcg tac ctc199Trp Arg Val Gly Ile Thr Leu Phe Ser Asp Cys Val Asn Ser Tyr Leu40 45 50cgc gat gac aac tct gac atc gtt gct act gat acc atg aaa aac acc247Arg Asp Asp Asn Ser Asp Ile Val Ala Thr Asp Thr Met Lys Asn Thr55 60 65 70gtg tat gca aaa gca aag gaa tgc tct gac ata ctt tct gcc gag gag295Val Tyr Ala Lys Ala Lys Glu Cys Ser Asp Ile Leu Ser Ala Glu Glu75 80 85ttt gct att ctg ctt gct aag cac ttt gta tca ttt tac cag aag gtt343Phe Ala Ile Leu Leu Ala Lys His Phe Val Ser Phe Tyr Gln Lys Val
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<221>misc_feature<223>引物<400>3gactcatatg gctaagcagg aagtgg 26<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gactgaattc ctacagcttt gaccaaagg 29
權(quán)利要求
1.一種分離的大豆脲酶sUricase蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有分解尿酸形成尿囊素的功能的由(a)衍生的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，該蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述蛋白的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中38-964位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1007位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出大豆脲酶sUricase蛋白。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的大豆脲酶sUricase蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種降解尿酸的組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求1所述的蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的大豆脲酶－sUricase蛋白，編碼sUricase蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種sUricase蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種sUricase蛋白的多核苷酸的用途。sUricase蛋白具有將脲酸分解成可溶性尿囊素的功能，是控制多數(shù)生物體內(nèi)脲酸濃度的關(guān)鍵酶。
文檔編號C12N9/00GK1690195SQ200410017789
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者陳克勤, 鄭建紅, 黃大慶, 袁崇生 申請人:上海單抗制藥技術(shù)有限公司