專利名稱：一種大豆酯酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，具體是一種用于果品蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的大豆酯酶的制備方法。
背景技術(shù)：
目前有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥仍廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，極容易在農(nóng)產(chǎn)品中造成殘留，尤其是果品蔬菜中農(nóng)藥殘留較為突出，對(duì)人體健康造成危害。因此，農(nóng)藥殘留是食品質(zhì)量安全的重要檢測(cè)和控制指標(biāo)。近年來(lái)，有許多關(guān)于農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法的研究，其中，“酶抑制-分光光度法”由于靈敏、簡(jiǎn)便、快速而得到廣泛應(yīng)用，并且已被列為國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T5009.199-2003)。酶抑制法是根據(jù)有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)酯酶分解底物的抑制作用而建立起來(lái)的。酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的靈敏度及可靠性與使用的酶密切相關(guān)。作為酶抑制法使用的酶主要有乙酰膽堿酯酶、有機(jī)磷水解酶和植物酯酶3種。目前研究及實(shí)際應(yīng)用中使用較多的是來(lái)源于動(dòng)物及昆蟲的乙酰膽堿酯酶，如從馬血、雞血、豬血及蒼蠅、棉鈴蟲等中提取的乙酰膽堿酯酶。但由于動(dòng)物體中膽堿酯酶含量較少、所以存在較難獲得、成本高等問(wèn)題。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)研究表明，植物酯酶與動(dòng)物膽堿酯酶對(duì)農(nóng)藥殘留具有相似的靈敏度和檢測(cè)限，且由于其含量豐富、容易提取，制備成本低，因而，可以滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)普及化及市場(chǎng)化的要求。目前已有植物酯酶片制備的報(bào)道，如專利局公開的申請(qǐng)?zhí)枮?9114268.3的“快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的植物酯酶片”發(fā)明專利，它是直接用面粉作為酶源材料，但所制備的酯酶片其檢測(cè)殘留農(nóng)藥的靈敏度和最低檢測(cè)限遠(yuǎn)達(dá)不到國(guó)標(biāo)規(guī)定的安全限值要求。除此之外，再未見對(duì)植物酯酶純酶產(chǎn)品制備方法的研究報(bào)道。我們?cè)谥参秕ッ该冈春Y選的基礎(chǔ)上，選定大豆作為最佳酶源材料，進(jìn)行了大豆酯酶純酶制品制備，獲得了良好的農(nóng)藥殘留檢測(cè)用酯酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種用于果品蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)所用的大豆酯酶的制備方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下步驟制備完成選優(yōu)質(zhì)大豆→粉碎→磷酸緩沖液抽提→差速離心→硫酸銨鹽析沉淀→透析除鹽→超濾濃縮→DEAE-32離子交換層析→冷凍干燥即成純酶制品。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體操作步驟如下a.選優(yōu)質(zhì)大豆，b.用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉狀，c.磷酸緩沖液抽提，c.1將粉碎的大豆粉投入適當(dāng)大小的容器內(nèi)，以1∶4-5料液比加入0.3mol/L、pH 7.0-8.0的磷酸緩沖液；c.2在振蕩器或攪拌機(jī)上振蕩或攪拌處理10-30min；c.3振蕩或攪拌處理后，在上述容器中繼續(xù)靜置抽提c.3.1溫度為0-4℃c.3.2時(shí)間為10-24h；c.4將上述抽提液用紗布過(guò)濾，取上清液，即為粗提液；d.差速冷凍離心，
d.1將粗提液以5000-6000rpm離心10-15min，收集上清；d.2將上一步沉淀物用pH 7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以3000-4000rpm離心10-15min，收集上清；d.3將上一步沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以1500-2000rpm離心10-15min，收集上清；d.4將上一步沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以1000-1500rpm離心10-15min，收集上清，棄去沉淀；d.5將上述四步離心所收集的上清液合并，即得粗酶液；e.硫酸銨鹽析沉淀，e.1取差速離心所得粗酶液，加入碾細(xì)的固體硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度在50％～70％的范圍內(nèi)，加入時(shí)，邊攪拌邊緩慢加入，以防局部過(guò)濃；e.2靜置1-2h，待完全沉淀后以4000-5000rpm離心15-20min；e.3棄去上清液，保留沉淀，沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解稀釋5-10倍；f.透析除鹽，將上一步所得硫酸銨沉淀酶液裝入透析袋，在蒸餾水中透析20-24h，其間換水3-5次，直至用1％的BaCl2檢測(cè)不出硫酸根為止；g.超濾濃縮，g.1將上一步透析所得粗酶液裝入Amicon Ultrefree-4超濾離心管，g.2在0-4℃條件下、以4000-5000rpm冷凍離心15-20min得酶濃縮液；h.DEAE-32纖維素離子交換層析，h.1將酶濃縮液過(guò)DEAE-32離子交換柱；h.2洗脫液為0～1.0mol/L NaCl和0.03mol/L、pH 7.0-8.0的磷酸緩沖液的梯度混合液；h.3流速為1-2mL/min，分管收集，4-8mL/管；h.4檢測(cè)酶活力，收集酶活力峰各管流出液；h.5核酸蛋白檢測(cè)儀，280nm處檢測(cè)酶蛋白含量；i.冷凍干燥，將上一步收集的酶活力峰各管流出液合并，冷凍干燥成粉狀，即得大豆酯酶純酶凍干制品。
本發(fā)明通過(guò)磷酸緩沖液抽提、差速離心分離、鹽析沉淀、離子交換層析和冷凍干燥，得到了電泳純的大豆酯酶純酶凍干制品。本發(fā)明所提供的大豆酯酶的制備方法，其原料來(lái)源廣泛、價(jià)廉易得，制備工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，比傳統(tǒng)的用于農(nóng)殘檢測(cè)的乙酰膽堿酯酶純酶制品的生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明制備的大豆酯酶制品純度高，經(jīng)過(guò)各步純化比粗提酶提純了19.21倍，回收率達(dá)到75.21％。用分光光度法，以乙酸萘酯為底物，固藍(lán)B鹽為顯色劑，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行靈敏性和最低檢測(cè)限試驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的酯酶用于有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留檢測(cè)敏感性好、最低檢測(cè)限(LDC)低。如對(duì)久效磷、甲胺磷、對(duì)硫磷、毒死蜱、甲拌磷等農(nóng)藥非常敏感，對(duì)久效磷、甲胺磷、對(duì)硫磷、毒死蜱、樂(lè)果、馬拉硫磷、敵百蟲等多種農(nóng)藥的最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.03125ppm，與國(guó)家規(guī)定的上述有機(jī)磷農(nóng)藥的最大殘留限量(MRL)相比較，其最低檢測(cè)限都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MRL限值，對(duì)毒死蜱和殺撲磷的LDC甚至達(dá)到了其MRL的三十二分之一，對(duì)乙硫磷、對(duì)硫磷、伏殺硫磷等的LDC也達(dá)到了MRL的十六分之一。所以，本發(fā)明制備的大豆酯酶完全能夠滿足對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)，并且可以廣泛用作農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)各種方法的酶標(biāo)記物。
權(quán)利要求
1.一種大豆酯酶的制備方法，其特征是操作步驟如下選優(yōu)質(zhì)大豆→粉碎→磷酸緩沖液抽提→差速離心→硫酸銨鹽析沉淀→透析除鹽→超濾濃縮→DEAE-32離子交換層析→冷凍干燥即成純酶制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大豆酯酶的制備方法，其特征是按以下具體步驟進(jìn)行2.a選優(yōu)質(zhì)大豆，2.b用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉狀，2.c磷酸緩沖液抽提，2.c.1將粉碎的大豆粉投入適當(dāng)大小的容器內(nèi)，以1∶4-5料液比加入0.3mol/L、pH7.0-8.0的磷酸緩沖液；2.c.2在振蕩器或攪拌機(jī)上振蕩或攪拌處理10-30min；2.c.3振蕩或攪拌處理后，在上述容器中繼續(xù)靜置抽提2.c.3.1溫度為0-4℃2.c.3.2時(shí)間為10-24h；2.c.4紗布過(guò)濾，取上清液，即為粗提液；2.d.差速冷凍離心，2.d.1將粗提液以5000-6000rpm離心10-15min，收集上清；2.d.2將上一步沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以3000-4000rpm離心10-15min，收集上清；2.d.3將上一步沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以1500-2000rpm離心10-15min，收集上清；2.d.4將上一步沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解，再以1000-1500rpm離心10-15min，收集上清，棄去沉淀；2.d.5將上述四步離心所收集的上清液合并，即得粗酶液；2.e硫酸銨鹽析沉淀，2.e.1取差速離心所得粗酶液，加入碾細(xì)的固體硫酸銨，使酶液中硫酸銨飽和度在50％～70％的范圍內(nèi)，加入時(shí)，邊攪拌邊緩慢加入，以防局部過(guò)濃；2.e.2靜置1-2h，待完全沉淀后以4000-5000rpm離心15-20min；2.e.3棄去上清液，保留沉淀，沉淀物用pH7.0-8.0的磷酸緩沖液溶解稀釋5-10倍；2.f透析除鹽，將上一步所得硫酸銨沉淀酶液裝入透析袋，在蒸餾水中透析10-24h，其間換水3-5次，直至用1％的BaCl2檢測(cè)不出硫酸根為止；2.g超濾濃縮，2.g.1將上一步透析所得粗酶液裝入Amicon Ultrefree-4超濾離心管，2.g.2在0-4℃條件下、以4000-5000rpm冷凍離心15-20min得酶濃縮液；2.h.DEAE-32纖維素離子交換層析，2.h.1將酶濃縮液過(guò)的DEAE-32離子交換柱；2.h.2洗脫液為0～1.0mol/L NaCl和0.03mol/L、pH7.0-8.0的磷酸緩沖液的梯度混合液；2.h.3流速為1-2mL/min，分管收集，4-8mL/管；2.h.4檢測(cè)酶活力，收集酶活力峰各管流出液；2.h.5核酸蛋白檢測(cè)儀，280nm處檢測(cè)酶蛋白含量；2.i.冷凍干燥，將上一步收集的酶活力峰各管流出液合并，冷凍干燥成粉狀，即得大豆酯酶純酶凍干制品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于果蔬中農(nóng)藥殘留量測(cè)定的大豆酯酶的制備方法。其步驟包括選優(yōu)質(zhì)大豆、粉碎、磷酸緩沖液抽提、差速離心分離、硫酸銨鹽析沉淀、離子交換層析純化和冷凍干燥。本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，比提取乙酰膽堿酯酶純酶制品的生產(chǎn)成本低。經(jīng)本發(fā)明純化后的大豆酯酶靈敏度比酶粗提液提高19倍以上。對(duì)久效磷、甲胺磷、對(duì)硫磷、毒死蜱、樂(lè)果、馬拉硫磷、敵百蟲等多種農(nóng)藥的最低檢測(cè)限(LDC)可以達(dá)到0.03125ppm，對(duì)毒死蜱和殺撲磷的LDC甚至達(dá)到了其最大殘留限量(MRL)的三十二分之一，對(duì)乙硫磷、對(duì)硫磷、伏殺硫磷等的LDC也達(dá)到了其MRL的十六分之一。本發(fā)明制備的大豆酯酶完全能夠滿足對(duì)多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)，并且可以廣泛用作農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)各種方法的酶標(biāo)記物。
文檔編號(hào)C12N9/16GK1952122SQ20051009620
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李建科, 溫艷霞, 牛樂(lè), 朱桂勤 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)