一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，將帶魚制備成供試品溶液，經(jīng)過高效液相色譜儀奮力檢測，獲得帶魚的指紋圖譜；所述方法包括供試品溶液的制備、高效液相色譜測定、標準指紋圖譜的確定。本發(fā)明利用HPLC色譜法建立了帶魚的指紋圖譜，方法性考察表明該方法可靠、重復性較好，符合指紋圖譜的要求；本發(fā)明檢測帶魚產(chǎn)地的方法操作簡單、檢測效率高、檢測結(jié)果可靠性好、快速、精確度高，準確率高達92.7%以上。
【專利說明】一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種操作簡單、檢測效率高、檢測結(jié)果可靠性好、快速、精確度高基于 高效液相色譜的帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 帶魚（rricAia/YAs 又稱牙帶、白帶魚、刀魚等，屬魚綱S盧形目帶魚科動 物，為暖溫性中下層集群洄游魚類，棲息于水深60-100m泥質(zhì)海底，以各種魚類、毛蝦和烏 賊等為主要食物，有明顯的晝夜垂直移動現(xiàn)象，廣泛分布于世界的溫、熱帶海域（以印度洋 和西太平洋居多）。
[0004] 帶魚魚體顯著側(cè)扁，延長成帶狀，尾細長如鞭，一般體長6(Γ120厘米、體重 20(Γ400克。頭窄長而側(cè)扁，前端尖突。兩頜牙發(fā)達而尖銳。眼大、位較高，眼間隔平坦、中 間微凹。體表光滑，鱗退化成表皮銀膜，全身呈富有光澤的銀白色，背部及背鰭、胸鰭略顯青 灰色。背鰭長，起點于鰓孔后上角沿背部齊長，臀鰭不明顯，只有鰭棘刺尖外露。無腹鰭。
[0005] 帶魚肉嫩體肥、味道鮮美，只有中間一條大骨，無其他細刺，食用方便，營養(yǎng)價值 高，是倍受人們喜愛的一種海洋魚類。具有補虛、解毒、止血等功效，可用于體虛、乳汁分泌 不足、外傷出血等癥。同時，從帶魚表皮銀膜中提取的咖啡因，可做照相工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)原 料；提取的6-硫代鳥嘌呤制成藥或治急性白血病，胃癌及淋巴腫瘤等，帶魚肉還可制取水 解蛋白注射液。 帶魚是我國四大經(jīng)濟魚類之一，我國東海、黃海、渤海、南海和北部灣均產(chǎn)，其中以東海 產(chǎn)量最大（70%，2006)，南海產(chǎn)量較少，浙江、山東沿海是產(chǎn)量較多的海區(qū)。1990年以前，東 海區(qū)最高年產(chǎn)量為52. 8萬噸（1974年)，浙江省為34萬噸，占東海區(qū)的64%，1974年后產(chǎn) 量開始滑坡，全省產(chǎn)量在20-30萬噸之間，1989年降至最低，只有19. 5萬噸。自1989年開 始，實施產(chǎn)卵帶保護區(qū)，并開發(fā)外海帶魚資源，1995年又開始伏季拖網(wǎng)和帆張網(wǎng)休漁措施， 是90年代以來的帶魚產(chǎn)量增長較快，從1990年24萬噸1995年上升到58萬噸，超過歷史 最高水平，2000年達到65萬噸，2010年達118萬噸。但是，帶魚產(chǎn)量的增長，并不意味著帶 魚資源的好轉(zhuǎn)，帶魚個體小型化，低齡化嚴重，冬汛捕撈群體當齡魚比例從1967年20. 5%， 1982年上升到59. 3%，90年代前期平均為71. 1%，90年代后期達到78. 2%，目前達到82. 3%， 可見帶魚捕撈群體以當齡的捕撈群體為主，帶魚產(chǎn)量的增長靠強化捕撈所得，帶魚資源處 于生長型過度捕撈狀態(tài)。
[0006] 舟山帶魚，由于其所處海域獨特的地理位置和水文環(huán)境，鮮度和質(zhì)地同其他地區(qū) 相比獨占鰲頭，是全國首批海鮮類地理標志證明商標的擁有者。但是，一些不法商販為牟取 利益，常以其他產(chǎn)地的帶魚冒充舟山帶魚，以次充好，嚴重損害了消費者利益，破壞了舟山 海鮮的商譽。
[0007] 于1997年9月發(fā)表水產(chǎn)學報第21卷第3期中有一篇關(guān)于東海帶魚種群鑒別研究 的報道，通過對取樣于東海不同海區(qū)29批2168尾帶魚魚體的各項形態(tài)性狀的觀察、計測、 并應用數(shù)學方法對性狀差異進行統(tǒng)計比較和群體間聚類分析，結(jié)合有關(guān)資料進行綜合分 析。結(jié)果表明：東海帶魚，不論近?；蛲夂５娜后w，相互間的形態(tài)特征基本酷似，呈現(xiàn)出密切 的關(guān)系，從而確認它們?yōu)橥环N群。這種方法來檢測帶魚產(chǎn)地或者帶魚種群時間花費過久。 [0008]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有帶魚產(chǎn)地難確定、沒有一種快速有效檢測帶魚產(chǎn) 地方法的缺陷而提供一種操作簡單、檢測效率高、檢測結(jié)果可靠性好、快速、精確度高基于 高效液相色譜法的帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，將帶魚制備成供試品溶液，經(jīng)過高效液相色譜儀奮力 檢測，獲得帶魚的指紋圖譜； 所述方法包括如下步驟： a) 供試品溶液的制備：取不同產(chǎn)地的帶魚樣品，以提取溶劑回流提取，離心，取上清液 加在堿性氧化鋁層析柱上，收集過柱液，再以水洗脫，合并過柱液及水洗脫液，過濾，作為供 試品溶液； b) 高效液相色譜測定：吸取步驟a)得到的供試品溶液至高效液相色譜儀測定，得到不 同產(chǎn)地的帶魚指紋圖譜； c) 標準指紋圖譜的確定：測定了 5個不同產(chǎn)地的帶魚共28個帶魚樣品高效液相色譜 指紋圖譜并進行比較，得到由其共有峰構(gòu)成的帶魚樣品高效液相色譜指紋圖譜，該指紋圖 譜具有的共有特征峰有13個與7個特征峰。
[0011] 在本技術(shù)方案中，水產(chǎn)品的營養(yǎng)成分及含量與特定的水生環(huán)境密切相關(guān)，品種相 同的產(chǎn)品可能產(chǎn)地不同，對不同產(chǎn)地產(chǎn)品特征因子進行分析，有利于原產(chǎn)地產(chǎn)品特色的形 成，并進一步制定相應的保護措施。文獻中報道較多的是利用高效液相色譜法（HPLC)技術(shù) 對中藥產(chǎn)地和真?zhèn)芜M行研究，中藥指紋圖譜是現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和品質(zhì)鑒定的新技術(shù)，為 樣品質(zhì)量評價問題和產(chǎn)地歸屬問題提供了新的方法和思路，而利用高效液相色譜法對水產(chǎn) 品指紋圖譜研究較少。
[0012] HPLC色譜法分離度高，能把復雜的化學成分進行分離并進行分析，這些高低不同 的色譜峰包含著眾多的信息，出峰的位置及高度（或峰面積）分別代表著特定化學物質(zhì)及 其含量的多少，故而整個色譜圖可表征該樣品所含有化學成分的多少及含量的大小。
[0013] 分別把各產(chǎn)地帶魚HPLC色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版 (2004)(國家藥典委員會），建立各產(chǎn)地帶魚HPLC指紋圖譜共有模式。根據(jù)相似度評價，得 到各產(chǎn)地帶魚HPLC參考指紋圖譜，確立了 13個共有峰和7個特征峰，通過各產(chǎn)地帶魚主要 共有峰相對保留時間及相對峰面積的比較，發(fā)現(xiàn)樣品間相對保留時間差異較小，而相對峰 面積有著顯著差異，說明了各產(chǎn)地帶魚含有物質(zhì)至少有13種以上相同，但是化學成分含量 因海域不同存在著差異。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟a)中帶魚樣品選擇體表富有光澤、腮呈鮮紅、粘液透明、眼球飽滿、 角膜清晰的帶魚，取1. 5-5. 0g帶魚背部肌肉樣品在0到-10°c下干燥12-18h，備用；然后加 入5-6倍帶魚質(zhì)量的去離子水攪拌均與得到帶魚肉漿，用帶魚質(zhì)量的0. 36-0. 97%的內(nèi)切蛋 白酶與魚肉漿質(zhì)量的0. 2-0. 33%的殼聚糖，35-40°C下攪拌30-240min，pH為5. 5-8. 5 ;攪拌 結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH至10-11. 2,保持30-45min后將pH調(diào)節(jié)至中性，然后4000rpm下離心，取上 清液，將上清液完全干燥后得到帶魚樣品固體，將帶魚樣品固體加入至提取溶劑中回流提 取，離心，取上清液加在堿性氧化鋁層析柱上，收集過柱液，再以水洗脫，合并過柱液及水洗 脫液，過濾，作為供試品溶液。
[0015] 在本技術(shù)方案中，在帶魚樣品用提取溶劑提取前，先對帶魚進行內(nèi)切蛋白酶酶解， 使得在后續(xù)提取工藝中可以更快速的將需要的成分提取出來，以便在高效液相色譜分析 時，得到更準確的數(shù)據(jù)與指紋圖譜。
[0016] 作為優(yōu)選，提取溶劑為無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一種。
[0017] 作為優(yōu)選，高效液相色譜儀的色譜條件為：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱， 5 μ m，4. 6 mmX 250 mm ;流動相：A相為0. 05-0. 07%的乙酸丁酯或0. 2-0. 5%的乙二醇，B相為 0· 2-0. 5%磷酸二氫鉀溶液；檢測波長210-320nm，柱溫為38-40°C，流速：1. 1-1. 5mL/min。
[0018] 作為優(yōu)選，內(nèi)切蛋白酶為木瓜蛋白酶、Neutrase或Alcalase。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟a)中過濾的孔徑為0· 22-0. 43 μ m。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟a)中，帶魚樣品與提取溶劑的料液比為1 :50_150。
[0021] 作為優(yōu)選，帶魚的產(chǎn)地為舟山、大連、青島、漳州、印度洋。
[0022] 本發(fā)明的有益效果： 1) 本發(fā)明利用HPLC色譜法建立了帶魚的指紋圖譜，方法性考察表明該方法可靠、重復 性較好，符合指紋圖譜的要求； 2) 本發(fā)明檢測帶魚產(chǎn)地的方法操作簡單、檢測效率高、檢測結(jié)果可靠性好、快速、精確 度高，準確率高達92. 7%以上。
[0023]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1是實施例1同一份帶魚的HPLC指紋圖譜。
[0025] 圖2是實施例2的HPLC指紋圖譜。
[0026] 圖3是不同產(chǎn)地帶魚樣品HPLC指紋圖譜的聚類結(jié)果。
[0027]

【具體實施方式】
[0028] 以下通過具體實施例，對本發(fā)明做進一步的解釋： 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的，下述實施例中 的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0029] 構(gòu)建不同產(chǎn)地帶魚標準指紋圖譜的來源見下表。
[0030] 表1、不同產(chǎn)地帶魚樣品來源

【權(quán)利要求】
1. 一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，將帶魚制備成供試品溶液，經(jīng)過高效液 相色譜儀奮力檢測，獲得帶魚的指紋圖譜； 所述方法包括如下步驟： a) 供試品溶液的制備：取不同產(chǎn)地的帶魚樣品，以提取溶劑回流提取，離心，取上清液 加在堿性氧化鋁層析柱上，收集過柱液，再以水洗脫，合并過柱液及水洗脫液，過濾，作為供 試品溶液； b) 高效液相色譜測定：吸取步驟a)得到的供試品溶液至高效液相色譜儀測定，得到不 同產(chǎn)地的帶魚指紋圖譜； c) 標準指紋圖譜的確定：測定了 5個不同產(chǎn)地的帶魚共28個帶魚樣品高效液相色譜 指紋圖譜并進行比較，得到由其共有峰構(gòu)成的帶魚樣品高效液相色譜指紋圖譜，該指紋圖 譜具有的共有特征峰有13個與7個特征峰。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟a)中帶魚 樣品選擇體表富有光澤、腮呈鮮紅、粘液透明、眼球飽滿、角膜清晰的帶魚，取1. 5-5. Og帶 魚背部肌肉樣品在0到-l〇°C下干燥12-18h，備用；然后加入5-6倍帶魚質(zhì)量的去離子水攪 拌均與得到帶魚肉漿，用帶魚質(zhì)量的〇. 36-0. 97%的內(nèi)切蛋白酶與魚肉漿質(zhì)量的0. 2-0. 33% 的殼聚糖，35-401：下攪拌30-2401^11，？!1為5.5-8.5;攪拌結(jié)束后，調(diào)節(jié)？!1至10-11.2，保 持30-45min后將pH調(diào)節(jié)至中性，然后4000rpm下離心，取上清液，將上清液完全干燥后得 到帶魚樣品固體，將帶魚樣品固體加入至提取溶劑中回流提取，離心，取上清液加在堿性氧 化鋁層析柱上，收集過柱液，再以水洗脫，合并過柱液及水洗脫液，過濾，作為供試品溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，提取溶劑為 無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，高效液相色譜 儀的色譜條件為：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱，5 μ m，4. 6 mmX 250 mm ;流動相：A相 為0. 05-0. 07%的乙酸丁酯或0. 2-0. 5%的乙二醇，B相為0. 2%磷酸二氫鉀溶液；檢測波長 210-320nm，柱溫為 38-40 °C，流速：1· 1-1. 5mL/min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，內(nèi)切蛋白酶為 木瓜蛋白酶、Neutrase或Alcalase。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟a)中過濾 的孔徑為〇· 22-0. 43 μ m。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟a)中，帶魚 樣品與提取溶劑的料液比為1 :50_150。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或5或6或7所述的一種帶魚指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特 征在于，帶魚的產(chǎn)地為舟山、大連、青島、漳州、印度洋。
【文檔編號】G01N30/02GK104101659SQ201410187249
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】周宇芳, 鄭斌, 肖金星, 相興偉, 楊會成, 孟志娟, 徐珊 申請人:浙江省海洋開發(fā)研究院